Hel-djur Imaging och Flödescytometrisk Tekniker för analys av antigen-specifika CD8 + T-cellssvar efter Nanoparticle Vaccination

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Traditionell vaccinutveckling har främst använde empiriska tillvägagångssättet trial-and-error. Men med den senaste utvecklingen av ett brett spektrum av biomaterial och upptäckt av molekylära faktorer som påverkar immunaktivering, är det nu möjligt att rationellt utforma vaccinformuleringar med biofysiska och biokemiska signaler som härrör från patogener 1,2. Framför allt har olika partikelläkemedelsleveransplattformar undersökts som vaccinbärare som de kan samtidigt laddade med subenhet antigener och immunstimulerande medel, skydda vaccinkomponenter från nedbrytning och förbättra sitt samarbete leverans till antigenpresenterande celler (APC) är bosatt i lymfan noder (LNS), vilket maximerar immunstimulering och aktivering 3-5. I denna rapport beskriver vi syntesen av ett "patogen liknande" nanopartikel-system, benämnda interbilayer-tvärbunden multilamellära vesiklar (ICMVs), som tidigare har visat en potent vaccin platform för framkallande av robust cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och humorala immunsvar i både systemiska och slemhinnevävnad fack 6-9. Framför allt uppnådde vaccination med ICMVs förbättras avsevärt serum IgG-nivåer mot en malariaantigen, jämfört med vaccination med konventionella hjälpmedel (t.ex. alun och Montanide) 7 och framkallade också potenta CTL-svar mot tumörceller och virus utmaning modeller i möss 9. Här använder ICMVs som modell vaccin nanopartikel-system, vi beskriver metoder för karakterisering av vaccinnanoformuleringar, inklusive partikelstorlek och zeta potentiella mätningar och spårning av partikel människohandel dränerande LNS (DLN-er) som utnyttjar konfokal avbildning av cryosectioned vävnader 7. Dessutom presenterar vi en hel-djur imaging-baserad metod för att analysera expansion av CTL-svar i möss efter adoptiv överföring av luciferas-uttryckande antigenspecifika CD8 + T-celler 9,10. Slutligen, vi derits tetramer-färgning av perifera blodmononukleära celler (PBMC) för längsgående kvantifiering av endogena T-cellsvar i möss vaccinerade med nanopartiklar 6,9.

ICMVs är en lipidbaserad nanopartikelformulering syntetiseras genom kontrollerad fusion av enkla liposomer i multilamellära strukturer, som sedan kemiskt stabiliserade av tvärbindnings maleimid-funktionaliserade fosfolipid huvudgrupper inom lipidskikt med ditiol tvärbindningsmedel 6. När ICMVs syntetiseras, kan en liten del av nanopartiklar användas för att bestämma partikelstorlek och zeta-potential (dvs. ytladdning av partiklar) med en dynamisk ljusspridning (DLS) systemet och en zeta-potential analysator. DLS mäter förändringar i ljusspridning i partikelsuspensioner, möjliggör bestämning av diffusionskoefficienten och den hydrodynamiska partikelstorlek 11. Att uppnå konsekvent partikelstorlek från parti till parti syntes är kritiskeftersom partikelstorlek är en av de viktigaste faktorerna som påverkar lymfatisk dränering av vaccinpartiklar till DLN-er och efterföljande cellulärt upptag av APC 12,13. Dessutom kan zeta-potentialen erhållas genom att mäta partikelhastigheten när en elektrisk ström anbringas, vilken möjliggör bestämning av den elektroforetiska mobiliteten av partiklar och partikel ytladdning 11. Säkerställa konsekvent Zeta-potential värden av partiklar är viktigt eftersom ytladdning av partiklar bestämmer kolloidalt stabilitet, som har direkt inverkan på partikeldispersion under lagring och efter administration in vivo 14,15. För att spåra partikel lokalisering till DLN-er, kan ICMVs märkas med önskade fluoroforer inklusive lipofila färgämnen och kovalent märkta antigener. Efter immunisering kan möss avlivas vid olika tidpunkter, DLN-er opererande, cryosectioned, och analyserades med konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör visualisering av lymfatisk Dralning av både nanopartiklar vaccinbärare och antigen till DLN-er. De vävnadssnitt kan dessutom färgas med fluorescerande antikroppar och används för att få mer information, till exempel olika typer av celler i samband med antigenet och bildandet av germinalcentra som vi har visat tidigare 7.

När väl partikelsyntes är optimerad och handel till DLN-er bekräftas, är det viktigt att validera framkallande av in vivo-CTL-expansion. För att analysera framkallande av antigen-specifika CD8 + T-celler som svar på nanopartikel vaccinering, har vi använt en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominanta CD8 + T-cellepitop, som medger detaljerade immunologiska analyser av antigenspecifika T-cellsvar för inledande vaccinutveckling 16,17. I synnerhet för att förhöra dynamiken i expansion och migration av antigen-specifika CD8 + T-celler har vi genererat endubbel-transgena musmodell genom att korsa eldfluga luciferas-uttryckande transgena möss (Luc) med OT-I transgena möss som uppvisar CD8 + T-celler med T-cellreceptorn (TCR) som är specifik för SIINFEKL (i association med H-2K ''). Från dessa OT-I / Luc-möss, luciferas-uttryckande, OT-I CD8 + T-celler kan isoleras och beredas för adoptiv överföring in i naiva C57BL / 6-möss. När ympades, kommer framgångsrik immunisering med OVA-innehållande nanopartiklar resulterar i expansion av de överförda T-celler, som kan spåras genom att övervaka bioluminiscens-signalen med ett helt djur avbildningssystem 9,10. Detta icke-invasiva hela kroppen bildteknik har använts med andra virala eller tumörantigener i det förflutna 18-20, avslöjar processer involverade i T-cell expansion i lymfoida vävnader och spridning till perifera vävnader i en längsgående sätt.

Komplementär till analys av adoptivt överförd antigenspecifika CD8 + T-celler, endogenooss T-cellssvar efter vaccination kan undersökas med peptiden-större histokompatibilitetskomplex (MHC) tetramer-analys 21, i vilket en peptid-MHC-tetramer-komplex, som består av fyra fluorofor-märkta MHC-klass I-molekyler laddade med peptid-epitoper, används att binda TCR och label CD8 + T-celler på ett antigenspecifikt sätt. Peptid-MHC-tetramer analys kan utföras antingen i terminalobduktionsstudier för att identifiera antigenspecifika CD8 + T-celler i lymfoida och perifera vävnader eller i longitudinella studier med perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhållna från seriebloddragningar. Efter färgning lymfocyter med peptid-MHC tetramer, flödescytometrianalys utförs för detaljerade analyser av fenotypen av CTL eller kvantifiering av deras frekvens bland CD8 + T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök som beskrivs i detta protokoll godkändes av University utskottet för användning och skötsel av djur (UCUCA) vid University of Michigan och utförs i enlighet med fastställda policies och riktlinjer.

1. Syntes och karakterisering av ICMVs Co-laddad med proteinantigen och Adjuvant Molekyler

  1. Blanda 1: 1 molförhållande av 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine--N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramid] (MPB) i kloroform, hålla den totala lipid belopp 1,26 jimol per parti (dvs 500 mikrogram av DOPC och 630 mikrogram av MPB) i en glasflaska 20 ml (diameter = 28 mm och höjd = 61 mm).
  2. Lägg lipofila läkemedel, såsom monofosforyllipid A (MPLA) eller lipofila färgämnen (t.ex. DiD), till lipiden lösningen vid önskad koncentration. Noggrant avlägsna det organiska lösningsmedlet genom spolning med extra torr nitrogen gas och placera proverna under vakuum O / N.
  3. Hydratisera lipidfilmen genom tillsats 200 pl av 10 mM bis-tris propån (BTP, pH 7,0) innehållande vattenlösliga läkemedel (t.ex. proteinantigener). Vortexa i 10 s var 10 min under en timme vid RT.
  4. Överför innehållet från glasflaska i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, placera prover i ett is-vattenbad, och sonikera kontinuerligt under 5 minuter med hjälp av intensiteten 40% inställning på en 125 W / 20 kHz probe-tip sonicator.
  5. Lägg 4 pl av 150 mM ditiotreitol (DTT) till varje parti (arbetskoncentration 2,4 mM), virvel, och kort centrifug med användning av en bordsmikrocentrifug.
  6. Lägg 40 | il av 200 mM CaCl2 och blanda med pipetten (arbetskoncentration 33 mM). Inkubera proverna vid 37 ° C under 1 timme för att medge tvärbindning av MPB-innehållande lipidskikt med DTT.
  7. Centrifugera proverna vid 20.000 x g under 15 minuter, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 200 ^ il ddiH 2 O.
  8. Upprepa steg 1,7 och centrifugera igen efter den andra ddiH 2-tvätt för att avlägsna CaCl2, oreagerad DTT och oinkapslade lastmaterial från supernatanten.
  9. Bered 10 mg / ml av 2 kDa polyetylenglykol-tiol (PEG-SH) i ddiH 2 O. Resuspendera varje ICMV prov i 100 pl av PEG-SH-lösning och inkubera vid 37 ° C under 30 minuter.
  10. Utför två ddiH två O-tvättar (steg 1,7) och återsuspendera den slutliga ICMV pelleten i PBS och lagra vid 4 ° C. Före användning, blanda ICMV suspensionen, som partiklar kan sedimentera till botten efter långvarig lagring.
  11. För karakterisering av partiklar, avlägsnande av en liten alikvot (~ 10%) av ICMVs från varje sats och späd individuellt i en total volym av 1 ml ddiH 2 O. Placera ett enda prov i en Zetasizer cell och mått partikelstorlek, polydispersitetsindex, och zeta-potentialen för proverna med användning av en DLS och zeta-potential mätsystemet (enligt tillverkarens protokoll).

2. Undersökning av Lymph Node Tömning av fluorescens-märkta ICMVs med konfokalmikroskopi

  1. Framställning av ICMVs laddad med fluorofor-märkta antigen och lipofil fluorescerande färgämne
    1. Förbered fluorofor-märkta protein, såsom ovalbumin reagera med Alexa Fluor 555-succinimidylester, enligt tillverkarens instruktioner.
    2. För att förbereda ICMVs taggade med fluorofor i lipid skal, lägga lipofil fluorescerande färgämne (t.ex., 1,1-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (gjorde)) under beredning av lipidfilmen (Steg 1,2) vid 0,05% molärt lipidmängd. För lipidfilm hydrering (steg 1,3), använd buffert innehållande fluorofor-märkta antigen, och fullständig ICMV syntes som beskrivs i steg från 1,4 till 1,11.
  2. Subkutan administrering av nanopartiklar vid svansbasen
    1. Söva musen med hjälp av ett kontrollerat flöde förångare utrustad med en induktionskammare utilizing 3% isofluran och 1,5 L / min syreflöde enligt en IACUC godkänd djurprotokoll. När musen är medvetslös, utföra följande steg snabbt före anestesi avta för att möjliggöra optimal tillgång till injektionsstället och minimera obehag för djuret. Alternativt kan du använda en korrekt montering noskon att upprätthålla anestesi. Om möss bedövas längre än 5 minuter, applicera ögonsmörj nödvändiga för att minimera irritation efter proceduren.
    2. Spraya svansroten med 70% etanol för att sanera och fukta pälsdelen vått hår för att exponera en liten bit synlig hud, som kan användas för att visualisera nålen under huden.
    3. Förbered partikelinjektionssuspension innehållande önskad mängd av antigen och adjuvans per 100 | il av vaccinationsdosen i PBS (t ex 10 | j, g OVA och 0,3 | ig MPLA per 100 | il injektions dos har använts tidigare 6,9).
    4. Rita partikelsuspensionen intoa spruta med en 27-29 G nål och stick in nålen vid basen av svansen (~ 5 mm från hårfästet) med koniska uppåt och injicera 50 il av partikelsuspensionen 22.
    5. Vänta några sekunder för tryckutjämning att förhindra överdriven backflöde och dra ut nålen. Upprepa injektionen på den andra sidan av svansbasen att rikta båda dränerande inguinal LNS.
  3. Framställning av lymfkörtel kryosnitt och undersökning med konfokalmikroskopi.
    1. Euthanize musen med CO 2 kvävning, följt av inducerad pneumothorax enligt en IACUC godkänd djurprotokoll. Extrahera inguinala LNS enligt protokoll visat i Bedoya 23 och tvätta ur blodet genom att placera vävnaderna i en ml 4 ° C PBS.
    2. Absorbera PBS från vävnaderna med vävnaderna och placera vävnaden i vävnads cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) förfylld till toppen med oktober frysmedium 24. Snap frysa tisstämma block i flytande kväve under 30 sek. Alternativt, placera vävnadsblock på torr is under 30 minuter. Förvara fryst vävnad i -80 ° C frys.
    3. Klipp vävnadssnitt 5-10 pm tjockt i en kryostat inställd på -20 ° C 24.
    4. Om det är nödvändigt, utföra immunofluorescens märkning, och undersöka vävnaden med konfokalmikroskopi som tidigare visats 24.

3. Övervakning Utbyggnad av antigenspecifika, luciferas-uttryck CD8 + T-celler efter Nanoparticle Vaccination med hela djuret Imaging

  1. Isolering av OVA257-264 -specifika, luciferas-uttryck CD8 + T-celler från OT-I / Luc transgena möss
    1. Euthanize en OT-I / Luc transgen mus med CO 2 kvävning och framkalla en pneumothorax enligt en IACUC godkänd djurprotokoll. Skörda mjälten på ett sterilt sätt genom att gå i peritonealhålan och försiktigt lösgöra vävnad från bukspottkörteln 23, ochplats i 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS för överföring till vävnadsodling huva.
    2. Placera mjälten på en 70 | im nylon sil över en 50 ml koniskt centrifugrör (upp till 3 mjältar åt gången). Med hjälp av en kolv från en 3 ml spruta, slipa cellerna genom silen.
    3. Tvätta kolven och silen med PBS + 2% FBS och kasta. Bringa den totala volymen till 10 ml / mjälte i 50 ml rör, ta ett litet prov av cellsuspensionen för att räkna med en hemocytometer, och centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.
    4. Med hjälp av en kommersiellt tillgänglig magnetisk negativ selektion kit, isolera CD8 + T-cellpopulationen genom att följa tillverkarens instruktioner.
    5. Efter tvättning celler med PBS, räkna antalet isolerade CD8 + T-celler. För att bedöma renheten av de isolerade CD8 + T-celler, inkubera ~ 20,000-30,000 celler i 20 | il mus CD16 / 32-antikropp (0,025 mg / ml) under 10 minuter, tillsätt sedan 20 ^ il αCD8-APC-antikropp (0,005 mg / ml) och inkubera under 30 minuter. PeR form alla inkubationer vid 4 ° C i PBS + 1% vikt / volym BSA. Utför flödescytometrisk analys 25.
  2. Adoptiv överföring av isolerade CD8 + T-celler och visualisering av deras expansion efter vaccination
    1. Utför adoptiv överföring av isolerade OT-I / Luc CD8 + T-celler till naiva C57BL / 6-möss genom administrering av 1-10 x 10 5 celler i en 200 pl volym PBS via intravenös injektion i svansvenen 22 (dag -1). Med tanke på att päls och svarta hudfläckar i C57BL / 6-möss kan störa den självlysande signalen, rakade albino C57BL / 6 möss är idealiska för dessa studier.
    2. Efter en dag (dag 0), administrera vaccinet såsom beskrivits tidigare (avsnitt 2.2).
    3. Administrera 150 mg luciferin per kg muskroppsvikt intraperitonealt i en 300 | il volym av PBS. Efter 10 minuter, söva möss med isofluran (såsom i steg 2.2.1) och visualisera OT-I / Luc CD8 + T-celler genom att förvärva bioluminescens signalen under 5-10 min wed ett helt djur avbildningssystem (IVIS, se Wilson 26 för detaljerade instruktioner). Upprepa vid behov för longitudinella studier.

4. Peptid-MHC-tetramer Färgning av PBMC för analys av antigen-specifika CD8 + T-celler

Anmärkning: Följande protokoll procedur kan utföras med användning antingen C57BL / 6-möss adoptivt överförda med OT-I / Luc CD8 + T-celler eller C57BL / 6-möss utan adoptiv överföring.

  1. Vid en önskad tidpunkt efter vaccination, samla cirka 100 pl blod (4-6 droppar) från möss via submandibulära blödning teknik 27 i ett rör belagt med K 2 EDTA och vänd flera gånger för att förhindra koagulering.
  2. Överför 100 | il blod till ett mikrocentrifugrör, tillsätt 1 ml lyseringsbuffert och inkubera i 2 till 3 min för att avlägsna röda blodkroppar (RBC). Centrifugera prover för 5 min vid 1500 xg och avlägsna supernatanten. Om pelleten fortfarande enppears röd (indikerar ofullständig borttagning av röda blodkroppar), upprepa lyssteget med en kort inkubationstid (<1 min) i lysbuffert.
  3. Tvätta de återstående PBMC med en ml FACS-buffert (PBS + 1% vikt / volym BSA) och centrifugera vid 1500 xg under 5 minuter.
  4. Aspirera supernatanten och återsuspendera provet i 20 | il mus CD16 / 32-antikropp (0,025 mg / ml) för att blockera icke-specifika och FcR-förmedlad antikroppsbindning. Inkubera under 10 min vid RT.
  5. Överför celler från mikrocentrifugrör i 4 ml rundbottnad FACS rör. Lägg 20 pl HgO-2K ^ OVA tetramer-SIINFEKL-PE-lösning i enlighet med tillverkarens specifikationer till varje prov och inkubera i 30 minuter på is.
  6. Förbered antikroppscocktail (t.ex. αCD8-APC, αCD44-FITC, och αCD62L-PECy7 antikroppar (0,005, 0,005, och 0,002 mg / ml koncentration, respektive)). Lägg 20 | il till varje försöksprov, och inkubera i 20 minuter på is. Förbered enstaka fluoroforen kontroller labeling celler med varje fluoroforen-märkta tetramer eller antikropp vid den koncentration som anges ovan.
  7. Tvätta två gånger med FACS-buffert och återsuspendera den slutliga pelleten i FACS-buffert innehållande 2 | ig / ml DAPI. Cellerna är nu redo för flödescytometri analys (detaljer och exempel kan hittas i Scheffold 25).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De steg som ingår i syntesen av ICMVs illustreras i figur 1 sex. Kortfattat är en lipidfilm innehållande eventuella lipofila läkemedel eller fluorescerande färgämnen hydratiseras i närvaro av hydrofila läkemedel. Tvåvärda katjoner, såsom Ca2 +, tillsätts för att driva fusion av anjoniska liposomer i multilamellära vesiklar. Ditiol tvärbindare, såsom DTT, sätts till "stapel" maleimid-funktionaliserade lipider på apposing lipidskikten, och slutligen återstående externa maleimidgrupper kyls i en reaktion med tiolerade-PEG-grupper. En liten del av varje parti kan lätt utsättas för mätningar kvalitetskontroll genom att bestämma partikelstorleken, polydispersitetsindex, och zeta-potential med DLS och zeta-potential systemanalys. De resulterande partiklarna är relativt homogent med en genomsnittlig storlek på 130 ± 20 nm, polydispersitetsindex på 0,22 ± 0,02, och zeta-potentialen för -54 ± 3 mV för OVA-inkapslande partiklar (Figur 1B och 1C). Typiskt utbyte av partiklar, uppmätt i torrvikt av partiklar, är ~ 50% 6.

Med användning av ovan beskrivna protokoll, ICMVs kan användas samtidigt laddas med fluorofor-märkta proteinantigen och fluorescerande lipofila färgämnet, vilket möjliggör visualisering av antigen och nanopartiklar leverans in vivo. För att jämföra mönster av antigen leverans i löslig form kontra i ICMVs, C57BL / 6-möss administrerades fm i svansbasen med 100 pg av AlexaFluor555-märkta OVA antingen lösliga eller har märkta ICMV formuleringar, och dränering inguinal LNS skars vid olika tidpunkter för beredning av DLN vävnads Cryo-sektioner. Visualisering med konfokalmikroskopi indikerade att lösligt antigen snabbt nått DLN-er inom 4 timmar, men var också rensas mycket snabbt med 24 timmar (Figur 2) 7. Däremot var OVA belastade ICMVs upptäcks vid periferin av DLN-er med 24 timmar, med fortsatt ackumuleringsom undersöktes på dag 4, avsätta en stor mängd OVA-ICMVs i DLN-er (Figur 2). Konfokala mikrografier visade också samlokalisering av AlexaFluor555-märkta OVA och gjorde märkta ICMVs inom DLN-er, vilket tyder på att ICMVs medger stabil samtidig leverans av proteinantigener och andra immunstimulerande medel inkapslade i ICMVs 7.

Isolering av CD8 + T-celler från OT-I / Luc transgen mus kan lätt utföras med kommersiellt tillgänglig magnetisk negativ selektion sats, vilket gav ~ 8-12 x 10 6 celler per en musmjälte. Figur 3 visar C57BL / 6-möss adoptivt överförda med 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T-celler på dag -1, och immuniserades på dag 0 med subkutan administrering av 10 mikrogram OVA och 0,3 mikrogram av MPLA antingen lösliga eller ICMV formuleringar. Bioluminescence avbildning med IVIS utförs på dag 0 före vaccination visade minimal OT-I / Luc signal. Emellertid, vid dag 4 efter vaccinering, immuniseras mössmed OVA / MPLA-ICMVs hade robust mareld signalen inom inguinal LNS, som är LNS dränerar svans basområdet 28. Möss som immuniserats med den lösliga formen av vaccinet visade mycket reducerad expansion av OT-I / Luc CD8 + T-celler inom inguinal DLN-er.

Använda OVA som modell antigen medger övervakning av utbyggnaden av endogena CD8 + T-celler som är specifika för immun OVA257-264 peptid (SIINFEKL). Till exempel var C57BL / 6-möss immuniserades på dag 0, 21, och 35 med subkutan administrering av 10 | j, g OVA och 0,3 | ig MPLA i endera ICMVs eller löslig form, och frekvenser av SIINFEKL-specifika CD8 + T-celler bland CD8 + T-celler i PBMC bestämdes genom flödescytometrisk analys av PBMC infärgade med SIINFEKL-H-2K '' tetramer-PE. Figur 4A visar representativ flödescytometri spridningsdiagram av SIINFEKL-H-2K '' tetramer + celler bland CD8 + T-celler i PBMC på dag 41 6. Figure 4B visar representativa scatter tomter av CD62L + CD44 + celler med centrala minne fenotyp bland SIINFEKL-tetramer + CD8 + T-celler. Veckovis övervakning av PBMC som visas i figur 4C visade att lösligt OVA vaccinet framkallade minimala expansion av antigen-specifika CD8 + T-celler, medan ICMV vaccinering elicited betydligt starkare CD8 + T-cellssvar, uppnå en topp 28% SIINFEKL-tetramer + T-celler i CD8 + T-cellpopulationen vid dag 41 6. Använda tetrameren färgningsprotokollet presenteras här, observerade vi bakgrundsfrekvens av 0,11% ± 0,04% OVA-specifika T-celler (N = 15) i obehandlade eller PBS-behandlade djur, och vi kan detektera statistiskt signifikant ökning av antigenspecifika CD8 + T-cells frekvenser så låga som 0,46% ± 0,05% (p-värde <0,005, data ej visade).

Figur 1
(A) ICMVs syntetiseras i följande fyra steg.; (I) anjoniska är maleimid-funktion liposomer av torkade lipidfilmer; (Ii) tvåvärda katjoner tillsättes för att inducera sammansmältning av liposomer och bildningen av multilamellära vesiklar; (Iii) membrangenomträng ditioler tillsätts, som tvärbinder maleimid-lipider på apposed lipidbiskikt i vesikler väggarna; och (iv) de resulterande lipidpartiklama är pegylerade med tiol-terminerad PEG. (B) representant partikelfördelning som analyseras av DLS visas. (C) Genomsnittlig hydrodynamisk storlek, polydispersitetsindex, och zeta potential ICMVs co-laddad med OVA och MPLA visas. Panel (A) har ändrats från månen et al. 6. Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 2
Figur 2. Analys av antigen dränerande till lymfkörtlarna med konfokalmikroskopi. C57BL / 6-möss immuniserades med 100 ^ g fluorofor-konjugerad OVA (visat i rött) och 5 | ig MPLA antingen i lösning eller ICMVs (visat i blått). Dränerande inguinala lymfkörtlar skars vid angivna tidpunkter, cryosectioned, och avbildas med konfokalmikroskopi. Representativa konfokala mikrofotografier visas. Rosa signaler indikerar samlokalisering av OVA och ICMVs. Denna siffra har ändrats från månen et al. 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Monitoring T-cells expansion efter vaccination. C57Bl / 6 albino möss adoptivt överförd iv med 5 x 10 5 Luc + OT-I CD8 + T-celler på dag -1. På dag 0 djuren administrerades med 10 ^ g av OVA och 0,1 | ig av MPLA, antingen som lösliga eller ICMV formuleringar. Djuren sövdes med isofluran och administreras med luciferin (150 mg / kg, 300 ul injiceras ip), och mareld signalen från Luc + OT-1 CD8 + T-celler förvärvades med IVIS. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4. Expansion av endogena OVA-specifika CD8 + T-celler efter ICMV vaccinering. C57BL / 6-möss immuniserades med 10 ^ g av OVA och 0,1 | ig av MPLA antingen in lösning eller ICMVs på dag 0, 21 och 35 (pilar). Frekvens av OVA-specifika T-celler bland perifera mononukleära blodkroppar utvärderades över tiden genom flödescytometrisk analys av SIINFEKL-MHC-I-tetrameren + CD8 + T-celler. (A) Representativa flödescytometri spridningsdiagram från individuella möss vid dag 41 visar SIINFEKL-MHC-I-tetrameren + CD8 + T-celler och (B) CD62L + CD44 + celler, markör av centrala minnes-T-celler. (C) De övergripande kinetiken för T-cell-expansion och kontraktion visas. Denna siffra har ändrats från månen et al. 6. Klicka här för att se en större version av bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet föreskrivs i denna artikel beskriver syntesen och karakteriseringen av en ny lipidbaserad nanopartikelsystem benämnt ICMVs, och ger processen för att validera effektiviteten av nanopartiklar baserade vaccinformuleringar för att inducera antigenspecifika CD8 + T-cellssvar. ICMV syntesen är fullbordad i alla vattenhaltiga tillstånd, vilket är en stor fördel jämfört med andra vanliga polymera nanopartiklar system (t.ex., poly (laktid-sam-glykolid) syrapartiklar), som typiskt kräver organiska lösningsmedel för framställning, vilket ofta resulterar i förlust av antigenicitet i protein antigener 29,30. Dessutom till ICMVs nytta omfattande stabilitet och förmåga inkapsla både hydrofoba och hydrofila molekyler 6, vilket således medger samtidig tillförsel av antigener och adjuvanser riktade till samma intracellulärt rum inom APC 31,32. Använda ICMVs som en modell vaccin nanopartiklar, här har vi redogjorde för förfarandenför (1) nanopartiklar syntes och karakterisering, (2) validering av nanopartiklar dränering till DLN-er, och granskning av framkallande av antigenspecifika CD8 + T-cellssvar med hjälp av (3) en icke-invasiv mareld bildteknik och (4) peptid-MHC tetramer färgning analys på PBMC.

Det är viktigt att säkerställa enhetlighet i nanopartiklar syntes från parti till parti, särskilt för partikelstorlek och ytladdning eftersom de i hög grad kan påverka lymfdränage och upptag av APC vid administrering in vivo. DLS och zetapotential analys ger snabba metoder för kvalitetskontroll på partikelstorlek och ytladdning. För mer detaljerade analyser av morfologi av enskilda partiklar, kan dessa tekniker kompletteras med högupplösande elektronmikroskopi, såsom Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) som bevarar morfologi "mjuka" partiklar i förglasat vattenskiktet 6,33,34 . Inkapslingseffektivitet av antigener och adjuvmyror måste också bestämmas och hålls jämn mellan synteser. Adjuvans, såsom MPLA, kan märkas med en fluorofor 6 medan proteinantigener kan kvantifieras med hjälp absorbance- och fluorescensbaserade protein kvantifiering kit, eller analyseras med användning av SDS-PAGE 35 och Coomassie eller silver färgning 36, och kvantifieras baserat på bandintensitet . Inkonsekvenser i förberedelse partikel kan bli följden av utgångna eller dåligt lagrade reagens, så optimal reaktivitet är nödvändig för fullständig syntes. För detta ändamål maleimide- och tiol- funktion reagens bör hållas i små alikvoter vid -80 ° C utan frekventa frysnings-upptiningscykler.

Partiklar mindre än 100 nm i allmänhet tros effektivt in i lymfkärl och trafik till DLN-er 13, medan större partiklar (500-2,000 nm) kräver aktiv transport av vävnadshemmahörande DC 12,37. I våra händer, ICMVs med den hydrodynamiska storlek som sträcker sig från 150 till 250 nm effektivt lokaliserad och framhärdade i DLN, vilket resulterar i omfattande CTL och humorala svar 6,7. Inom 24 timmar av administrationen, var ICMVs samband med subkapsulär sinus makrofager i DLN-er, och flödescytometrisk analyser utförs på dag 1 och 4 indikerade att de flesta ICMVs inom DLN-er togs upp av LN-bosatta APC med endast en liten del av partiklar i samband med Langerhanska och dermala DC 7. Dessa resultat visade att passiv transport är huvudsättet ICMV människohandel DLN-er. Dessa studier har använt fluoroforen-märkta nanopartiklar och proteinantigener att avgränsa sina lokalisering och distributionsmönster i DLN-er. Konfokalmikroskopi av cryosectioned DLN-er kan ytterligare immunofluorescens histokemi för identifiering av LN strukturer (t.ex. GL-7-uttryck i germinalcentra) och celler interagerar med formuleringskomponenterna (t.ex. utvecklingsländer - CD11c, makrofager - F4 / 80, CD169 och B- celler & #8211; B220) 7,9. Denna teknik kan utföras parallellt med flödescytometri analyser av celler skördade från DLN-er för att beskriva de undergrupper av APC som ansvarar för partikel upptaget 7,9 eller med hela-djur imaging att kvantifiera vaccinleverans från injektionsstället till DLN-er 38,39, under förutsättning att de fluorescerande signalerna är stark och vävnads autofluorescens inte störa signalerna.

Effektiv immunisering kräver robust aktivering och expansion av antigen-specifika cytotoxiska T-celler, som kan spåras av hela kroppen bioluminescens avbildning efter adoptiv överföring av bioluminescerande, antigen-specifika transgena T-celler, följt av vaccination. Den ytterligare fördelen med denna metod är möjligheten till upprepad visualisering av CTL-handel med samma djur under en längre tid, vilket minskar antalet djur som behövs för immunologiska analyser och undvika användning av mödosamma cellisolering procedures. Med användning av denna avbildningsteknik, har vi nyligen visat att pulmonär administration av ICMVs sam-laddad med proteinantigen och en immunstimulerande medel ledde till potenta framkallande av antigen-specifika CD8 + T-celler i lungan och mediastinum LNS och påföljande spridning av CTL till distala slemhinnevävnader , inklusive Peyers plack, blindtarmen och vaginan 9. Flödescytometrisk analyser visade att dessa nyligen utökade CD8 + T-celler märkta med ett "mukosal-målsökande" fenotyp som kännetecknas av α 4 β 7 + grin uttryck och förmedlade skyddande immunsvar mot mucosal viral utmaning 9. Hela-djur avbildning av bioluminescerande CD8 + T-celler var också nyligen utnyttjas av Hailemicheal et al., Som visade att tumörantigen peptid formulerad i ofullständigt Freunds adjuvans (IFA, olja-i-vatten-emulsion) resulterade i sekvestrering av T-celler vid stället av injektionenmed vaccin "depå" bort från tumörmassor, vilket leder till T-cellsdysfunktion och radering 40.

Tetramer färgning har använts i stor utsträckning i det förflutna för att kvantifiera nivån av endogena CTL-svar till följd av olika vaccinformuleringar 21. Denna teknik är också relevant och vanligen används i tidiga humana cancerimmunterapi kliniska prövningar för att bekräfta CTL-svar till specifika tumörassocierade antigener 41,42. PBMC kan enkelt samlas in från möss och preparerades för flödescytometri; den kan emellertid inte avslöja den fulla omfattningen av expansionen av T-celler på grund av cell lokalisering till depå Formande vacciner som tidigare nämnts eller inom tumörer i cancermodeller, vilket kräver mer omfattande analys. Kompatibilitet med denna metod med flödescytometri möjliggör bestämning av antigenspecifika T-celler med minnesmarkörer (CD44, CD62L, CD127, BCL-2 och KLRG-1) för att skilja effektor, centrala minne och effektor minne cells bland tetramer + T-celler 43 eller långvariga vävnads bosatta CTL 44,45 (som sammanfattas i senaste omdömena 46,47). Men ger tetramer färgning analysen endast den ursprungliga bedömningen av CTL-svar eftersom högt expanderade antigenspecifika T-celler kan uppvisa tecken på immun utmattning 48,49. Funktionell utvärdering av CTL-svar kan utföras genom att undersöka cytokinfrisättning med enzymkopplad immunospot (ELISpot) 50 eller intracellulärt cytokin-färgning 51 efter ex vivo stimulering av lymfocyter med minimala epitoper såväl som genom mätning av de intracellulära nivåerna av perforin och granzym B 52 och extracellulär expression av CD107a och CD107b vid degranulering 53. Dessutom kan cytolytisk funktion CTL direkt bedömas med CTL cytotoxicitetsanalyser utförs in vitro eller in vivo 54-56.

Induktion av humorala immunsvarefter nanopartikel vaccinering kan studeras parallellt med CD8 + T-cellsanalyser presenteras här. Antikroppstitrar kan analyseras genom den traditionella metoden med enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA), medan antikroppsaffinitet och bredden av epitop igenkänning kan bedömas genom modifiering av ELISA-protokollet med användning av kaotropt medel (t ex karbamid) under antikroppsbindning till den substrat och användning av underdomäner inom antigener som substrat, respektive 7. Framkallande av potenta humorala svar kräver expansion av follikulär hjälpar CD4 + T-celler (T fh) 57. För att undersöka expansion av T-fh-celler som svar på vaccination partikel, kan protokollet som presenteras här lätt anpassas för isolering av antigenspecifika CD4 + T-celler från OT-II-transgena möss, följt av adoptiv cellöverföring in i naiva mottagarmöss. Efter vaccination kan lymfvävnader skördas och analyseras med flödescytometrisk analyser att avskräckagruva expansion av antigenspecifika T fh celler (identifieras av deras CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotyp) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Perkin Elmer förutsatt att produktionskostnaden som har upparbetats under publiceringen av denna artikel.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Institute of Health bevilja 1K22AI097291-01 och National Center for Advancing Translation Sciences i National Institutes of Health i Award Antal UL1TR000433. Vi erkänner också professor Darrell Irvine vid MIT och professor Matthias Stephan vid Fred Hutchinson Cancer Center för deras bidrag till det inledande arbetet på vaccinnanopartiklar och OT-I / Luc transgena möss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6, (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3, (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics