We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Traditionell vaccinutveckling har främst använde empiriska tillvägagångssättet trial-and-error. Men med den senaste utvecklingen av ett brett spektrum av biomaterial och upptäckt av molekylära faktorer som påverkar immunaktivering, är det nu möjligt att rationellt utforma vaccinformuleringar med biofysiska och biokemiska signaler som härrör från patogener 1,2. Framför allt har olika partikelläkemedelsleveransplattformar undersökts som vaccinbärare som de kan samtidigt laddade med subenhet antigener och immunstimulerande medel, skydda vaccinkomponenter från nedbrytning och förbättra sitt samarbete leverans till antigenpresenterande celler (APC) är bosatt i lymfan noder (LNS), vilket maximerar immunstimulering och aktivering 3-5. I denna rapport beskriver vi syntesen av ett "patogen liknande" nanopartikel-system, benämnda interbilayer-tvärbunden multilamellära vesiklar (ICMVs), som tidigare har visat en potent vaccin platform för framkallande av robust cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och humorala immunsvar i både systemiska och slemhinnevävnad fack 6-9. Framför allt uppnådde vaccination med ICMVs förbättras avsevärt serum IgG-nivåer mot en malariaantigen, jämfört med vaccination med konventionella hjälpmedel (t.ex. alun och Montanide) 7 och framkallade också potenta CTL-svar mot tumörceller och virus utmaning modeller i möss 9. Här använder ICMVs som modell vaccin nanopartikel-system, vi beskriver metoder för karakterisering av vaccinnanoformuleringar, inklusive partikelstorlek och zeta potentiella mätningar och spårning av partikel människohandel dränerande LNS (DLN-er) som utnyttjar konfokal avbildning av cryosectioned vävnader 7. Dessutom presenterar vi en hel-djur imaging-baserad metod för att analysera expansion av CTL-svar i möss efter adoptiv överföring av luciferas-uttryckande antigenspecifika CD8 + T-celler 9,10. Slutligen, vi derits tetramer-färgning av perifera blodmononukleära celler (PBMC) för längsgående kvantifiering av endogena T-cellsvar i möss vaccinerade med nanopartiklar 6,9.
ICMVs är en lipidbaserad nanopartikelformulering syntetiseras genom kontrollerad fusion av enkla liposomer i multilamellära strukturer, som sedan kemiskt stabiliserade av tvärbindnings maleimid-funktionaliserade fosfolipid huvudgrupper inom lipidskikt med ditiol tvärbindningsmedel 6. När ICMVs syntetiseras, kan en liten del av nanopartiklar användas för att bestämma partikelstorlek och zeta-potential (dvs. ytladdning av partiklar) med en dynamisk ljusspridning (DLS) systemet och en zeta-potential analysator. DLS mäter förändringar i ljusspridning i partikelsuspensioner, möjliggör bestämning av diffusionskoefficienten och den hydrodynamiska partikelstorlek 11. Att uppnå konsekvent partikelstorlek från parti till parti syntes är kritiskeftersom partikelstorlek är en av de viktigaste faktorerna som påverkar lymfatisk dränering av vaccinpartiklar till DLN-er och efterföljande cellulärt upptag av APC 12,13. Dessutom kan zeta-potentialen erhållas genom att mäta partikelhastigheten när en elektrisk ström anbringas, vilken möjliggör bestämning av den elektroforetiska mobiliteten av partiklar och partikel ytladdning 11. Säkerställa konsekvent Zeta-potential värden av partiklar är viktigt eftersom ytladdning av partiklar bestämmer kolloidalt stabilitet, som har direkt inverkan på partikeldispersion under lagring och efter administration in vivo 14,15. För att spåra partikel lokalisering till DLN-er, kan ICMVs märkas med önskade fluoroforer inklusive lipofila färgämnen och kovalent märkta antigener. Efter immunisering kan möss avlivas vid olika tidpunkter, DLN-er opererande, cryosectioned, och analyserades med konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör visualisering av lymfatisk Dralning av både nanopartiklar vaccinbärare och antigen till DLN-er. De vävnadssnitt kan dessutom färgas med fluorescerande antikroppar och används för att få mer information, till exempel olika typer av celler i samband med antigenet och bildandet av germinalcentra som vi har visat tidigare 7.
När väl partikelsyntes är optimerad och handel till DLN-er bekräftas, är det viktigt att validera framkallande av in vivo-CTL-expansion. För att analysera framkallande av antigen-specifika CD8 + T-celler som svar på nanopartikel vaccinering, har vi använt en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominanta CD8 + T-cellepitop, som medger detaljerade immunologiska analyser av antigenspecifika T-cellsvar för inledande vaccinutveckling 16,17. I synnerhet för att förhöra dynamiken i expansion och migration av antigen-specifika CD8 + T-celler har vi genererat endubbel-transgena musmodell genom att korsa eldfluga luciferas-uttryckande transgena möss (Luc) med OT-I transgena möss som uppvisar CD8 + T-celler med T-cellreceptorn (TCR) som är specifik för SIINFEKL (i association med H-2K ''). Från dessa OT-I / Luc-möss, luciferas-uttryckande, OT-I CD8 + T-celler kan isoleras och beredas för adoptiv överföring in i naiva C57BL / 6-möss. När ympades, kommer framgångsrik immunisering med OVA-innehållande nanopartiklar resulterar i expansion av de överförda T-celler, som kan spåras genom att övervaka bioluminiscens-signalen med ett helt djur avbildningssystem 9,10. Detta icke-invasiva hela kroppen bildteknik har använts med andra virala eller tumörantigener i det förflutna 18-20, avslöjar processer involverade i T-cell expansion i lymfoida vävnader och spridning till perifera vävnader i en längsgående sätt.
Komplementär till analys av adoptivt överförd antigenspecifika CD8 + T-celler, endogenooss T-cellssvar efter vaccination kan undersökas med peptiden-större histokompatibilitetskomplex (MHC) tetramer-analys 21, i vilket en peptid-MHC-tetramer-komplex, som består av fyra fluorofor-märkta MHC-klass I-molekyler laddade med peptid-epitoper, används att binda TCR och label CD8 + T-celler på ett antigenspecifikt sätt. Peptid-MHC-tetramer analys kan utföras antingen i terminalobduktionsstudier för att identifiera antigenspecifika CD8 + T-celler i lymfoida och perifera vävnader eller i longitudinella studier med perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhållna från seriebloddragningar. Efter färgning lymfocyter med peptid-MHC tetramer, flödescytometrianalys utförs för detaljerade analyser av fenotypen av CTL eller kvantifiering av deras frekvens bland CD8 + T-celler.
Protokollet föreskrivs i denna artikel beskriver syntesen och karakteriseringen av en ny lipidbaserad nanopartikelsystem benämnt ICMVs, och ger processen för att validera effektiviteten av nanopartiklar baserade vaccinformuleringar för att inducera antigenspecifika CD8 + T-cellssvar. ICMV syntesen är fullbordad i alla vattenhaltiga tillstånd, vilket är en stor fördel jämfört med andra vanliga polymera nanopartiklar system (t.ex., poly (laktid-sam-glykolid) syrapartiklar), som typiskt kräver organiska…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av National Institute of Health bevilja 1K22AI097291-01 och National Center for Advancing Translation Sciences i National Institutes of Health i Award Antal UL1TR000433. Vi erkänner också professor Darrell Irvine vid MIT och professor Matthias Stephan vid Fred Hutchinson Cancer Center för deras bidrag till det inledande arbetet på vaccinnanopartiklar och OT-I / Luc transgena möss.
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
FlowJo Software | FlowJo |