Summary

Hel-djur Imaging och Flödescytometrisk Tekniker för analys av antigen-specifika CD8 + T-cellssvar efter Nanoparticle Vaccination

Published: April 29, 2015
doi:

Summary

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Abstract

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

Traditionell vaccinutveckling har främst använde empiriska tillvägagångssättet trial-and-error. Men med den senaste utvecklingen av ett brett spektrum av biomaterial och upptäckt av molekylära faktorer som påverkar immunaktivering, är det nu möjligt att rationellt utforma vaccinformuleringar med biofysiska och biokemiska signaler som härrör från patogener 1,2. Framför allt har olika partikelläkemedelsleveransplattformar undersökts som vaccinbärare som de kan samtidigt laddade med subenhet antigener och immunstimulerande medel, skydda vaccinkomponenter från nedbrytning och förbättra sitt samarbete leverans till antigenpresenterande celler (APC) är bosatt i lymfan noder (LNS), vilket maximerar immunstimulering och aktivering 3-5. I denna rapport beskriver vi syntesen av ett "patogen liknande" nanopartikel-system, benämnda interbilayer-tvärbunden multilamellära vesiklar (ICMVs), som tidigare har visat en potent vaccin platform för framkallande av robust cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och humorala immunsvar i både systemiska och slemhinnevävnad fack 6-9. Framför allt uppnådde vaccination med ICMVs förbättras avsevärt serum IgG-nivåer mot en malariaantigen, jämfört med vaccination med konventionella hjälpmedel (t.ex. alun och Montanide) 7 och framkallade också potenta CTL-svar mot tumörceller och virus utmaning modeller i möss 9. Här använder ICMVs som modell vaccin nanopartikel-system, vi beskriver metoder för karakterisering av vaccinnanoformuleringar, inklusive partikelstorlek och zeta potentiella mätningar och spårning av partikel människohandel dränerande LNS (DLN-er) som utnyttjar konfokal avbildning av cryosectioned vävnader 7. Dessutom presenterar vi en hel-djur imaging-baserad metod för att analysera expansion av CTL-svar i möss efter adoptiv överföring av luciferas-uttryckande antigenspecifika CD8 + T-celler 9,10. Slutligen, vi derits tetramer-färgning av perifera blodmononukleära celler (PBMC) för längsgående kvantifiering av endogena T-cellsvar i möss vaccinerade med nanopartiklar 6,9.

ICMVs är en lipidbaserad nanopartikelformulering syntetiseras genom kontrollerad fusion av enkla liposomer i multilamellära strukturer, som sedan kemiskt stabiliserade av tvärbindnings maleimid-funktionaliserade fosfolipid huvudgrupper inom lipidskikt med ditiol tvärbindningsmedel 6. När ICMVs syntetiseras, kan en liten del av nanopartiklar användas för att bestämma partikelstorlek och zeta-potential (dvs. ytladdning av partiklar) med en dynamisk ljusspridning (DLS) systemet och en zeta-potential analysator. DLS mäter förändringar i ljusspridning i partikelsuspensioner, möjliggör bestämning av diffusionskoefficienten och den hydrodynamiska partikelstorlek 11. Att uppnå konsekvent partikelstorlek från parti till parti syntes är kritiskeftersom partikelstorlek är en av de viktigaste faktorerna som påverkar lymfatisk dränering av vaccinpartiklar till DLN-er och efterföljande cellulärt upptag av APC 12,13. Dessutom kan zeta-potentialen erhållas genom att mäta partikelhastigheten när en elektrisk ström anbringas, vilken möjliggör bestämning av den elektroforetiska mobiliteten av partiklar och partikel ytladdning 11. Säkerställa konsekvent Zeta-potential värden av partiklar är viktigt eftersom ytladdning av partiklar bestämmer kolloidalt stabilitet, som har direkt inverkan på partikeldispersion under lagring och efter administration in vivo 14,15. För att spåra partikel lokalisering till DLN-er, kan ICMVs märkas med önskade fluoroforer inklusive lipofila färgämnen och kovalent märkta antigener. Efter immunisering kan möss avlivas vid olika tidpunkter, DLN-er opererande, cryosectioned, och analyserades med konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör visualisering av lymfatisk Dralning av både nanopartiklar vaccinbärare och antigen till DLN-er. De vävnadssnitt kan dessutom färgas med fluorescerande antikroppar och används för att få mer information, till exempel olika typer av celler i samband med antigenet och bildandet av germinalcentra som vi har visat tidigare 7.

När väl partikelsyntes är optimerad och handel till DLN-er bekräftas, är det viktigt att validera framkallande av in vivo-CTL-expansion. För att analysera framkallande av antigen-specifika CD8 + T-celler som svar på nanopartikel vaccinering, har vi använt en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominanta CD8 + T-cellepitop, som medger detaljerade immunologiska analyser av antigenspecifika T-cellsvar för inledande vaccinutveckling 16,17. I synnerhet för att förhöra dynamiken i expansion och migration av antigen-specifika CD8 + T-celler har vi genererat endubbel-transgena musmodell genom att korsa eldfluga luciferas-uttryckande transgena möss (Luc) med OT-I transgena möss som uppvisar CD8 + T-celler med T-cellreceptorn (TCR) som är specifik för SIINFEKL (i association med H-2K ''). Från dessa OT-I / Luc-möss, luciferas-uttryckande, OT-I CD8 + T-celler kan isoleras och beredas för adoptiv överföring in i naiva C57BL / 6-möss. När ympades, kommer framgångsrik immunisering med OVA-innehållande nanopartiklar resulterar i expansion av de överförda T-celler, som kan spåras genom att övervaka bioluminiscens-signalen med ett helt djur avbildningssystem 9,10. Detta icke-invasiva hela kroppen bildteknik har använts med andra virala eller tumörantigener i det förflutna 18-20, avslöjar processer involverade i T-cell expansion i lymfoida vävnader och spridning till perifera vävnader i en längsgående sätt.

Komplementär till analys av adoptivt överförd antigenspecifika CD8 + T-celler, endogenooss T-cellssvar efter vaccination kan undersökas med peptiden-större histokompatibilitetskomplex (MHC) tetramer-analys 21, i vilket en peptid-MHC-tetramer-komplex, som består av fyra fluorofor-märkta MHC-klass I-molekyler laddade med peptid-epitoper, används att binda TCR och label CD8 + T-celler på ett antigenspecifikt sätt. Peptid-MHC-tetramer analys kan utföras antingen i terminalobduktionsstudier för att identifiera antigenspecifika CD8 + T-celler i lymfoida och perifera vävnader eller i longitudinella studier med perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhållna från seriebloddragningar. Efter färgning lymfocyter med peptid-MHC tetramer, flödescytometrianalys utförs för detaljerade analyser av fenotypen av CTL eller kvantifiering av deras frekvens bland CD8 + T-celler.

Protocol

Alla försök som beskrivs i detta protokoll godkändes av University utskottet för användning och skötsel av djur (UCUCA) vid University of Michigan och utförs i enlighet med fastställda policies och riktlinjer. 1. Syntes och karakterisering av ICMVs Co-laddad med proteinantigen och Adjuvant Molekyler Blanda 1: 1 molförhållande av 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine–N – [4- (p -maleimid…

Representative Results

De steg som ingår i syntesen av ICMVs illustreras i figur 1 sex. Kortfattat är en lipidfilm innehållande eventuella lipofila läkemedel eller fluorescerande färgämnen hydratiseras i närvaro av hydrofila läkemedel. Tvåvärda katjoner, såsom Ca2 +, tillsätts för att driva fusion av anjoniska liposomer i multilamellära vesiklar. Ditiol tvärbindare, såsom DTT, sätts till "stapel" maleimid-funktionaliserade lipider på apposing lipidskikten, och slutligen åters…

Discussion

Protokollet föreskrivs i denna artikel beskriver syntesen och karakteriseringen av en ny lipidbaserad nanopartikelsystem benämnt ICMVs, och ger processen för att validera effektiviteten av nanopartiklar baserade vaccinformuleringar för att inducera antigenspecifika CD8 + T-cellssvar. ICMV syntesen är fullbordad i alla vattenhaltiga tillstånd, vilket är en stor fördel jämfört med andra vanliga polymera nanopartiklar system (t.ex., poly (laktid-sam-glykolid) syrapartiklar), som typiskt kräver organiska…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av National Institute of Health bevilja 1K22AI097291-01 och National Center for Advancing Translation Sciences i National Institutes of Health i Award Antal UL1TR000433. Vi erkänner också professor Darrell Irvine vid MIT och professor Matthias Stephan vid Fred Hutchinson Cancer Center för deras bidrag till det inledande arbetet på vaccinnanopartiklar och OT-I / Luc transgena möss.

Materials

1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 mL glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

View Video