Hel-dyr Imaging og strømningscytometriske Teknikker for analyse av Antigen-spesifikke CD8 + T celle responser etter Nanopartikkel Vaksinasjon

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Tradisjonell vaksineutvikling har i hovedsak benyttet empirisk tilnærming med prøving og feiling. Men med den siste utviklingen av et bredt utvalg av biomaterialer og oppdagelsen av molekylære determinanter for aktivering av immunsystemet, er det nå mulig å rasjonelt designe vaksineformuleringer med biofysiske og biokjemiske signaler avledet fra patogener 1,2. Spesielt har ulike partikkel stoffet levering plattformer blitt undersøkt som vaksinebærere som de kan være co-lastet med subenhet antigener og immunstimulerende midler, beskytte vaksinekomponenter fra degradering, og styrke deres co-levering til antigenpresenterende celler (APC) bosatt i lymfe noder (LNS), og dermed maksimere immun stimulering og aktivisering 3-5. I denne rapporten beskriver vi syntesen av en "patogen-ligne" nanopartikler system, betegnet interbilayer-tverrbundne multilamellære vesikler (ICMVs), som tidligere er vist som en potent vaksine plattform;m for utløsning av robust cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og humorale immunresponser hos både systemiske og slimhinne vevsområder 6-9. Spesielt oppnådde vaksinering med ICMVs vesentlig forbedret serum IgG-nivåer mot malaria antigen, sammenlignet med vaksinering med konvensjonelle hjelpestoffer (for eksempel alun og Montanide) 7 og også utløst sterke CTL-responser mot kreftceller og virale smittemodeller i mus 9. Her, ved hjelp ICMVs som modell vaksine nanopartikkel-system, beskriver vi metoder for karakterisering av vaksinenanoformuleringer, inkludert partikkelstørrelse og Zeta potensial målinger og sporing av partikkel trafficking til drenering LNS (dLNs) utnytte confocal avbildning av cryosectioned vev 7. I tillegg presenterer vi en hel-animalsk bildebasert metode for å analysere utvidelse av CTL-responser i mus etter adoptiv overføring av luciferase-uttrykkende antigen-spesifikke CD8 + T-celler 9,10. Til slutt, vi despiss tetramer farging av perifere mononukleære blodceller (PBMC) for langsgående måling av endogent T-celleresponser hos mus vaksinert med nanopartikler 6,9.

ICMVs er et lipid-baserte nanopartikkel-formulering syntetisert ved kontrollert fusjon av liposomer inn i enkle multilamellære strukturer, som deretter kjemisk stabilisert ved tverrbinding av maleimid-funksjonalisert fosfolipid hodegruppene i lipidlagene med ditiol tverrbindere 6. Når ICMVs er syntetisert, kan en liten brøkdel av nanopartikler kan brukes til å bestemme partikkelstørrelse og zeta potensial (dvs. overflateladningen av partikler) med en dynamisk lysspredning (DLS) system og et zeta potensial analysator. DLS måler forandringer i lysspredningen i partikkelsuspensjoner, som tillater bestemmelse av diffusjonskoeffisienten og den hydrodynamiske størrelse av partikler 11. Oppnå konsistente partikkelstørrelse fra parti til parti syntese er kritiskSiden partikkelstørrelsen er en av de viktigste faktorene som påvirker lymfatisk drenering av vaksine partikler til dLNs og påfølgende cellulært opptak av APC 12,13. I tillegg kan zeta-potensialet oppnås ved å måle partikkelhastigheten når en elektrisk strøm påtrykkes, som tillater bestemmelse av den elektroforetiske mobilitet av partikler og partikkeloverflateladning 11. Å sikre konsistente zeta-potensialverdier partikler er viktig fordi overflateladningen på partiklene bestemmer kolloidal stabilitet, som har direkte innvirkning på partikkel dispersjon under lagring og etter in vivo administrering 14,15. For å spore partikkel lokalisering til dLNs kan ICMVs merkes med ønskede fluoroforene inkludert lipofile fargestoffer og kovalent-merket antigener. Etter immunisering, kan mus avlives på ulike tidspunkter, dLNs resected, cryosectioned, og analysert med konfokalmikroskopi. Denne teknikken tillater visualisering av lymfatisk Draining av både nanopartikkel vaksinebærere og antigen til dLNs. Vevssnittene kan i tillegg være farget med fluorescensmerkede antistoffer og brukes for å oppnå mer informasjon, slik som typer av celler assosiert med antigenet, og dannelsen av germinale sentre som vi har vist tidligere 7.

Når partikkelen syntese er optimalisert og omsetning til de dLNs er bekreftet, er det viktig å validere utløsning av CTL in vivo ekspansjon. For å analysere utløsning av antigen-spesifikke CD8 + T-celler i respons til nanopartikler vaksinering, har vi benyttet en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominant CD8 + T-celle epitop, som tillater detaljerte immunologiske analyser av antigen-spesifikke T-celle-responser for første vaksineutvikling 16,17. Spesielt å avhøre dynamikken i ekspansjon og migrering av antigen-spesifikke CD8 + T-celler, har vi generert endobbelt-transgen musemodell ved å krysse ildflue luciferase-uttrykkende transgene mus (Luc) med OT-I transgene mus som har CD8 + T-celler med T-cellereseptoren (TCR) spesifikk for SIINFEKL (i forbindelse med H-2K b). Fra disse OT-I / Luc mus, luciferase-uttrykkende, OT-I CD8 + T-celler kan bli isolert og preparert for adoptiv overføring til naive C57BL / 6-mus. Når seeded, vil vellykket immunisering med OVA-holdige nanopartikler resulterer i utvidelse av den utskilte T-celler, som kan spores ved å overvåke Bioluminescens signal med et helt dyr avbildningssystem 9,10. Denne ikke-invasiv helkropps avbildningsteknikk har vært brukt sammen med andre virale eller tumorantigener i det siste 18-20, avslørende prosessene som er involvert i T-celle-ekspansjon i lymfevev og spredning til perifert vev på en langsgående måte.

Komplement til analyse av adoptivt overført antigen-spesifikke CD8 + T-celler, endogenooss T-celleresponser etter vaksinering kan undersøkes med peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) tetramer assay 21, hvor et peptid-MHC-komplekset tetramer, bestående av fire fluorofor-merket MHC-klasse I-molekyler fylt med peptidepitoper, benyttes å binde TCR og etikett CD8 + T-celler i en antigen-spesifikk måte. Den peptid-MHC tetramer assay kan utføres enten i terminal obduksjon studier for å identifisere antigen-spesifikke CD8 + T-celler i lymfoid og perifert vev eller i langsgående studier med perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble oppnådd fra serieblodprøver. Etter farging lymfocytter med peptid-MHC-tetramer, strømningscytometri-analyse blir utført for detaljerte analyser på fenotypen av CTL eller kvantifisering av deres frekvens mellom CD8 + T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene beskrevet i denne protokollen ble vedtatt av Universitetskomiteen for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA) ved University of Michigan og utført i henhold til de etablerte retningslinjer.

1. Syntese og karakterisering av ICMVs Co-lastet med proteinantigen og Adjuvans Molekyler

  1. Blandingsforhold 1: 1 molart forhold mellom 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-fosfokolin (DOPC) og 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramid] (MPB) i kloroform, og holder den totale mengde lipider på 1,26 umol per batch (dvs. 500 ug DOPC og 630 ug MPB) i et 20 ml hetteglass (diameter = 28 mm og høyde = 61 mm).
  2. Legg lipofile legemidler, slik som monofosforyllipid A (MPLA) eller lipofile fargestoffer (for eksempel gjorde), til lipidoppløsningen til ønsket konsentrasjon. Grundig fjerne det organiske løsningsmiddel ved spyling med ekstra tørr nitrogen-N gassen og plassere prøvene under vakuum O / N.
  3. Hydrat lipidfilmen ved å tilsette 200 pl 10 mM bis-Tris propan (BTP, pH 7,0) inneholdende vannoppløselige medikamenter (f.eks proteinantigener). Vortex i 10 sekunder hvert 10 min i 1 time ved RT.
  4. Overfør innholdet fra glass hetteglass i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, plassere prøvene i et is-vannbad, og sonicate kontinuerlig i 5 minutter ved bruk av 40% intensitet innstillingen på en 125 W / 20 kHz probe-sonikator spiss.
  5. Tilsett 4 mL av 150 mM dithiothreitol (DTT) til hvert parti (jobber konsentrasjon 2,4 mm), vortex, og kort sentrifuge bruker en tabletop mikro.
  6. Legg 40 ul av 200 mM CaCl2 og blande seg med pipette (arbeidskonsentrasjon 33 mM). Inkuber prøvene ved 37 ° C i 1 time for å tillate tverrbinding av MPB-inneholdende lipid sjikt med DTT.
  7. Sentrifuger prøvene ved 20 000 xg i 15 minutter, fjern supernatanten og resuspender i 200 ul ddiH 2 O.
  8. Gjenta trinn 1.7 og sentrifuger på nytt etter den andre ddiH 2 O vask for å fjerne CaCl2, ureagert DTT, og uinnkapslede laste materiale fra supernatanten.
  9. Forbered 10 mg / ml 2 kDa polyetylenglykol-tiol (PEG-SH) i ddiH 2 O. Resuspender ICMV hver prøve i 100 pl PEG-SH-løsning og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
  10. Utføre to ddiH 2 O vasker (trinn 1.7) og resuspender den endelige ICMV pellet i PBS og oppbevares ved 4 ° C. Før bruk blande ICMV suspensjonen, som partikler kan sette seg på bunnen etter lengre tids lagring.
  11. For karakterisering av partikler, fjerne en liten alikvot (~ 10%) av ICMVs fra hver sats og fortynn individuelt i et totalt volum på 1 ml ddiH 2 O. Plasser en enkelt prøve i et Zetasizer celle og måle partikkelstørrelse, polydispersitetsindeks, og zeta-potensialet av prøvene ved hjelp av en DLS og zeta-potensialet målesystem (i henhold til produsentens protokoll).

2. Undersøkelse av Lymfeknute Tømming av fluorescens-merket ICMVs med Konfokalmikroskopi

  1. Utarbeidelse av ICMVs lastet med fluorophore-merket antigen og lipofile fluorescerende fargestoff
    1. Forbered fluorophore-merket protein, slik som ovalbumin reagert med Alexa Fluor 555-succinimidylester, i henhold til produsentens anvisninger.
    2. For å fremstille ICMVs merket med fluoroforen i lipid skallet, tilsett lipofil fluorescerende fargestoff, (for eksempel, 1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) under fremstillingen av lipidfilmen (Trinn 1.2) på 0,05% molar lipid beløp. For lipidfilm hydrering (trinn 1.3), bruk buffer som inneholder fluorophore-merket antigen, og fullstendig ICMV syntese som skissert i trinn 01.04 til 01.11.
  2. Subkutan administrering av nanopartikler på halen basen
    1. Anesthetize mus bruker en kontrollert flyt vaporizer utstyrt med en induksjon kammer utilizing 3% isofluran og 1,5 l / min av oksygenstrømmen i henhold til et dyr IACUC godkjent protokoll. Når musen er bevisstløs, utføre følgende trinn raskt før anestesi seg av for å tillate optimal tilgang til injeksjonsstedet og minimere ubehag for dyret. Alternativt kan du bruke en skikkelig montering nesekonus å opprettholde anestesi. Hvis musene bedøvet i mer enn 5 min, gjelder øye glidemiddel er nødvendig for å minimere irritasjon etter inngrepet.
    2. Spray haleroten med 70% etanol for å rense og fukte pels del vått hår for å eksponere en liten flekk av synlig hud, som kan brukes til å visualisere nålen under huden.
    3. Forbered partikkelinjeksjonssuspensjon inneholdende ønsket mengde av antigen og adjuvans pr 100 ul av vaksinasjon dose i PBS (f.eks, 10 ug OVA og 0,3 ug MPLA per 100 ul injeksjon dose har blitt benyttet i det siste 6,9).
    4. Tegn partikkelsuspensjonen intoa sprøyte med 27-29 G nål og stikk nålen på haleroten (~ 5 mm fra hårfestet) med skråkant vendt opp og injisere 50 mL av partikkelsuspensjonen 22.
    5. Vent noen sekunder for trykkutligning å hindre overdreven tilbakestrømning og trekk nålen ut. Gjenta injeksjonen på den andre siden av halen basen for påvirkning både drenering inguinal LNS.
  3. Utarbeidelse av lymfeknutefrysesnitt og undersøkelse med konfokalmikroskopi.
    1. Avlive mus med CO 2 kvelning, etterfulgt av indusert pneumothorax ifølge en IACUC godkjent dyr protokollen. Ekstraher inguinale LNS ifølge protokollen vist i Bedoya 23 og vaske ut blodet ved å sette vevet i 1 ml 4 ° C PBS.
    2. Absorbere PBS fra vev med vev og plassere vev i vev cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) ferdigfylt til toppen med oktober frysing medium 24. Snap fryse tissue blokk i flytende nitrogen i 30 sekunder. Alternativt kan plassere vevsblokk på tørr is i 30 min. Oppbevar frosne vev i -80 ° C fryser.
    3. Skjær vevssnitt 5-10 mikrometer tykt i en kryostat satt ved -20 ° C 24.
    4. Hvis det er nødvendig, utføre immunfluorescens merking, og undersøke vev med konfokalmikroskopi som tidligere demonstrert 24.

3. Overvåking Utvidelse av antigenspesifikke, Luciferase-uttrykkende CD8 + T-celler etter Nanopartikkel Vaksinasjon med Hele dyre Imaging

  1. Isolering av OVA-spesifikke 257-264, luciferase-uttrykker CD8 + T-celler fra OT-I / Luc transgene mus
    1. Avlive en OT-I / Luc transgen mus med CO 2 kvelning og indusere en pneumothorax ifølge en IACUC godkjent dyr protokollen. Høste milten på en steril måte ved å åpne bukhulen og forsiktig demontering av vev fra bukspyttkjertelen 23, ogsted i 5 ml av 4 ° C PBS + 2% FBS for overføring til vevskultur hette.
    2. Plasser milt på et 70 mikrometer nylonfilter over et 50 ml konisk sentrifugerør (opp til 3 miltene om gangen). Ved hjelp av et stempel fra en 3 ml sprøyte, slipe cellene gjennom silen.
    3. Vask stempelet og sil med PBS + 2% FBS og kast. Bringe det totale volum til 10 ml / milt i 50 ml tube, kan en liten prøve av cellesuspensjonen til å telle med et hemocytometer, og sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g.
    4. Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig magnetisk negativ seleksjon kit, isolere CD8 + T-celle befolkningen ved å følge produsentens instruksjoner.
    5. Etter vasking av cellene med PBS, telle antall isolerte CD8 + T-celler. For å vurdere renheten av de isolerte CD8 + T-celler, inkuberes ~ 20,000-30,000 celler i 20 pl mus CD16 / 32-antistoff (0,025 mg / ml) i 10 minutter, og deretter legge 20 ul αCD8-APC-antistoff (0,005 mg / ml) og inkuberes i 30 min. Perform alle inkubasjoner ved 4 ° C i PBS + 1% w / v BSA. Utfør flowcytometrisk analyse 25.
  2. Adoptiv overføring av isolerte CD8 + T-celler og visualisering av deres ekspansjon etter vaksinasjon
    1. Utføre adoptiv overføring av isolert OT-I / Luc CD8 + T-celler til naive C57BL / 6 mus ved administrering av 1-10 x 10 5 celler i et 200 ul volum av PBS via intravenøs injeksjon i halevenen 22 (dag -1). Tatt i betraktning at pels og sort hudplastere i C57BL / 6 mus kan forstyrre bioluminescent signal, barbert albino C57BL / 6-mus er ideelle for disse studiene.
    2. Etter en dag (dag 0), administrere vaksinen som tidligere beskrevet (avsnitt 2.2).
    3. Administrere 150 mg av luciferin pr kg musekroppsvekt intraperitonealt i et 300 ul volum av PBS. Etter 10 min, bedøve mus med isofluran (som i trinn 2.2.1) og visualisere OT-I / Luc CD8 + T-celler ved å anskaffe Bioluminescens signal i 5-10 min wed et helt dyr bildesystem (IVIS refererer til Wilson 26 for detaljert instruksjon). Gjenta etter behov for longitudinelle studier.

4. Peptid-MHC Tetramer Farging av PBMC for analyse av antigen-spesifikke CD8 + -T-celler

Merk: Den følgende protokoll fremgangsmåte kan utføres ved hjelp av enten C57BL / 6-mus adoptivt overført med OT-I / Luc CD8 + T-celler eller C57BL / 6-mus uten adoptiv overføring.

  1. På et ønsket tidspunkt etter vaksinasjon, samle omtrent 100 ul blod (4-6 dråper) fra mus via submandibulære blødning teknikk 27 inn i et rør belagt med K 2 EDTA og invertere flere ganger for å hindre koagulering.
  2. Overfør 100 ul av blod til et mikrosentrifugerør, tilsett 1 ml lyseringsbuffer, og inkuberes i 2 til 3 minutter for å fjerne røde blodceller (RBC). Sentrifuger prøver for 5 min ved 1500 xg og fjern supernatanten. Hvis pellet fortsatt enppears røde (som indikerer ufullstendig fjerning av RBC), gjenta lyseringstrinnet med en kort inkubasjonstid (<1 min) lysisbuffer.
  3. Vask de rester PBMC med 1 ml FACS-buffer (PBS + 1% vekt / volum BSA) og sentrifuger ved 1500 xg i 5 min.
  4. Aspirer supernatanten og resuspender prøven i 20 mL av mus CD16 / 32-antistoff (0,025 mg / ml) for å blokkere ikke-spesifikk og FcR-mediert antistoffbinding. Inkuber i 10 min ved RT.
  5. Overfør cellene fra mikrosentrifugerør i 4 ml rund FACS rør. Tilsett 20 ul H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE-løsning i henhold til produsentens spesifikasjoner til hver prøve og inkuber i 30 min på is.
  6. Klargjør antistoff cocktail (f.eks αCD8-APC, αCD44-FITC, og αCD62L-PECy7 antistoffer (0,005, 0,005 og 0,002 mg / ml konsentrasjon, henholdsvis)). Tilsett 20 ul til hver eksperimentell prøve, og inkuber i 20 minutter på is. Forberede enkelt fluoroforen kontroller etter laBeling celler med hver fluorofor-merket antistoff tetramer eller ved konsentrasjonen som er angitt ovenfor.
  7. Vask to ganger med FACS-buffer og resuspender den siste pellet i FACS-buffer som inneholdt 2 mikrogram / ml av DAPI. Cellene er nå klar for strømningscytometri-analyse (detaljer og eksempler kan finnes i Scheffold 25).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinnene som er involvert i syntesen av ICMVs er illustrert i figur 1 til 6. Kort sagt blir en lipid film inneholdende eventuelle lipofile legemidler eller fluoriserende fargestoffer hydrert i nærvær av hydrofile legemidler. Toverdige kationer, slik som Ca2 +, blir tilsatt for å drive sammensmelting av anioniske liposomer inn i multilamellære vesikler. Ditiol tverrbindingsmiddel, så som DTT, tilsettes til "stift" maleimid-funksjonaliserte lipider på innsidene lipid-lag og til slutt gjenværende ytre maleimidgrupper er slukket i en reaksjon med tiolert-PEG-andeler. En liten del av hver porsjon kan lett underkastes kvalitetskontroll målinger ved bestemmelse av partikkelstørrelse, polydispersitetsindeks, og zeta-potensialet med en DLS og zeta-potensialet analysesystem. De resulterende partikler er forholdsvis homogent med en gjennomsnittlig størrelse på 130 ± 20 nm, polydispersitetsindeks på 0,22 ± 0,02, og zeta potensial på -54 ± 3 mV for OVA-innkapsling av partikler (Figur 1B og 1C). Typisk utbytte av partikler, målt i tørr vekt av partikler, er ~ 50% 6.

Bruke protokollen beskrevet ovenfor, ICMVs kan være co-lastet med fluorophore-merket protein antigen og fluorescerende lipofile fargestoff, slik visualisering av antigen og nanopartikkel levering in vivo. Å sammenligne mønstre av antigen levering i løselig form versus i ICMVs, C57BL / 6 mus ble administrert sc på halen base med 100 mikrogram AlexaFluor555-merket OVA enten i løselige eller gjorde merkede ICMV formuleringer, og drenering inguinal LNS ble skåret på ulike tidspunkter for utarbeidelse av DLN vev kryo-seksjoner. Visualisering med konfokalmikroskopi indikerte at løselig antigen raskt nådd dLNs innen 4 timer, men ble også ryddet veldig raskt med 24-timers (figur 2) 7. I motsetning til dette ble OVA-lastet ICMVs detektert ved periferien av dLNs av 24 timer under fortsatt akkumuleringsom undersøkes på dag 4, avsetning av en stor mengde av OVA-ICMVs i dLNs (figur 2). Konfokale mikrografier viste også samlokalisering av AlexaFluor555-merket OVA og gjorde merkede ICMVs innenfor dLNs, noe som tyder på at ICMVs tillate stabil co-levering av proteinantigener og andre immunstimulerende midler innkapslet i ICMVs 7.

Isolering av CD8 + T-celler fra OT-I / Luc transgene mus kan lett utføres med kommersielt tilgjengelige magnetiske negativ seleksjon kit, hvilket ga ~ 8-12 x 10 6 celler per mus milt. Figur 3 viser C57BL / 6-mus adoptivt overført med 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T-celler på dag -1, og immunisert på dag 0 med subkutan administrering av 10 ug OVA og 0,3 ug av MPLA enten oppløselige eller ICMV formuleringer. Bioluminesens bildebehandling med IVIS utført på dag 0 før vaksinasjon viste minimal OT-I / Luc signal. Men ved dag 4 etter vaksinasjon, mus immunisertmed OVA / MPLA-ICMVs hadde robust Bioluminescens signal innen inguinale LNS, som er LNS drenering halen basen regionen 28. I motsetning til dette, mus immunisert med løselig form av vaksinen viste mye mindre utvidelse av OT-I / Luc CD8 + T-celler i inguinal dLNs.

Bruke OVA som modell antigen tillater overvåking av utvidelse av endogene CD8 + T-celler som er spesifikke for immunodominant OVA 257-264 peptid (SIINFEKL). For eksempel, ble C57BL / 6-mus immunisert på dag 0, 21 og 35 med subkutan administrering av 10 ug OVA og 0,3 ug MPLA i enten ICMVs eller i oppløselig form, og frekvenser på SIINFEKL-spesifikke CD8 + T-celler blant CD8 + T-celler i PBMC ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av PBMC farget med SIINFEKL-H-2K b tetramerfritt PE. 4A viser representative flowcytometri spredningsplott av SIINFEKL-H-2K b tetramer + celler blant CD8 + T-celler i PBMC på dag 41 6. Figure 4B viser representative spredningsplott av CD62L + CD44 + celler med sentral minne fenotype blant SIINFEKL-tetramer + CD8 + T-celler. Weekly overvåking av PBMC-er vist i figur 4C viste at oppløselig OVA vaksinen fremkalte minimal utvidelse av antigen-spesifikke CD8 + T-celler, mens ICMV vaksinering fremkalte betydelig sterkere CD8 + T-celleresponser, å oppnå en maksimal 28% SIINFEKL-tetramer + T-celler i CD8 + T-cellepopulasjonen ved dag 41 6. Ved hjelp av tetramer fargeprotokollen presentert her, observerte vi bakgrunnen frekvens på 0,11% ± 0,04% OVA-spesifikke T-celler (n = 15) ubehandlede eller PBS-behandlede dyr, og vi kan oppdage statistisk signifikant økning av antigen-spesifikke CD8 + T-celle frekvenser så lavt som 0,46% ± 0,05% (p-verdi <0,005, data ikke vist).

Figur 1
(A) ICMVs syntetiseres i de følgende fire trinn.; (I) anioniske, blir maleimid-funksjonaliserte liposomer fremstilt fra tørkede lipid-film; (Ii) divalente kationer blir tilsatt for å indusere fusjon av liposomer og dannelse av multilamellære vesikler; (Iii) membran-gjennomtrengelige ditioler tilsettes, som fornette maleimid-lipider på apposed lipidbilag i vesikkel veggene; og (iv) de resulterende lipidpartikler pegylert med tiol-terminerte PEG. (B) Representative partikkelfordeling som analysert ved DLS er vist. (C) Gjennomsnittlig hydrodynamisk størrelse, polydispersitetsindeks, og zeta potensialet ICMVs co-lastet med OVA og MPLA vises. Panel (A) har blitt forandret fra Moon et al. 6. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 2
Figur 2. Analyse av antigen tappe til lymfeknuter med konfokal mikroskopi. C57BL / 6 mus ble immunisert med 100 ug fluorofor-konjugert OVA (vist i rødt) og 5 ug MPLA enten i løsning eller ICMVs (vist i blått). Drenering inguinal lymfeknuter ble skåret på angitte tidspunkter, cryosectioned, og avbildes med konfokalmikroskopi. Representative konfokale mikrografer vises. Rosa signaler tyder samlokalisering av OVA og ICMVs. Dette tallet har blitt forandret fra Moon et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. overvÃg T-celle-ekspansjon etter vaksinasjon. C57Bl / 6 albino-mus adoptivt overført IV med 5 x 10 5 Luc + OT-I CD8 + T-celler på dag -1. På dag 0, ble dyrene administrert med 10 ug OVA og 0,1 ug av MPLA enten som løselige eller ICMV formuleringer. Dyrene ble bedøvet med isofluran og administreres med luciferin (150 mg / kg, 300 mL injisert ip), og bioluminescens signal fra Luc + OT-1 CD8 + T-celler ble kjøpt med IVIS. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 4
Figur 4. Utvidelse av endogene OVA-spesifikke CD8 + T-celler etter ICMV vaksinasjon. C57BL / 6 mus ble immunisert med 10 ug OVA og 0,1 ug av enten i MPLAN løsning eller ICMVs på dag 0, 21 og 35 (piler). Frekvens av OVA-spesifikke T-celler blant perifere mononukleære blodceller ble bestemt over tid ved strømningscytometrisk analyse av SIINFEKL-MHC-I tetramer + CD8 + T-celler. (A) Representant flowcytometri spredningsplott fra enkelte mus i dag 41 showet SIINFEKL-MHC-I tetramer + CD8 + T-celler og (B) CD62L + CD44 + celler, markør for sentrale minne T-celler. (C) De samlede kinetikken av T-celle-ekspansjon og sammentrekning er vist. Dette tallet har blitt forandret fra Moon et al. 6. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen i denne artikkelen beskriver syntese og karakterisering av en ny lipid-baserte nanopartikler system, betegnet ICMVs, og gir prosessen med å validere effektiviteten av nanopartikkel-baserte vaksinepreparater for å fremkalle antigen-spesifikke CD8 + T-celleresponser. ICMV syntesen er fullført i alle vandige tilstand, noe som er en stor fordel sammenlignet med andre vanlig anvendte polymere nanopartikkel-systemer (for eksempel, poly (laktid-ko-glykolid) syre partikler), som typisk krever organiske løsningsmidler for fremstillingen, som ofte resulterer i tap av antigenevne i protein antigener 29,30. I tillegg til ICMVs nytte omfattende stabilitet og evne innkapsle både hydrofobe og hydrofile molekyler 6, noe som tillater samtidig levering av antigener og adjuvanser som er rettet mot den samme intracellulære rommet innenfor APC 31,32. Bruke ICMVs som modell vaksine nanopartikler, her har vi skissert prosedyrenefor (1) nanopartikler syntese og karakterisering, (2) kontroll av nanopartikkel-drenering for å dLNs, og undersøkelse av utløsning av antigen-spesifikke CD8 + T-celle-responser under anvendelse av (3) en ikke-invasiv bioluminescens avbildningsteknikk og (4) peptid-MHC tetramer farging analysen på PBMCer.

Det er avgjørende for å sikre ensartethet i nanopartikkel-syntese fra sats til sats, spesielt med henblikk på partikkelstørrelse og overflateladning som de i stor grad kan påvirke lymfatisk drenering og opptak av APC ved in vivo-administrering. DLS og zetapotensial analyse gir raske metoder for kvalitetssjekk på partikkelstørrelse og overflateladning. For mer detaljerte analyser på morfologi av individuelle partikler, kan disse teknikkene kompletteres med høy oppløsning elektronmikroskopi, slik som Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) som bevarer morfologi av "myke" partikler i vitrified vannlaget 6,33,34 . Innkapslingseffektiviteten av antigener og adjuvmaur må også bestemmes og holdes ensartet mellom synteser. Adjuvanser, slik som MPLA, kan bli merket med en fluorofor 6, mens proteinantigener kan kvantifiseres ved hjelp av absorbance- og fluorescens-baserte protein kvantifisering kits, eller analysert benytte SDS-PAGE og Coomassie 35 eller 36 sølvfarging, og kvantifisert basert på båndintensitet . Uoverensstemmelser i partikkel forberedelse kan skyldes utløpt eller dårlig lagret reagenser, som optimal reaktivitet er nødvendig for fullstendig syntese. For dette formål, og maleimide- thiol funksjon reagenser bør holdes i små porsjoner ved -80 ° C uten hyppige fryse-tine-sykluser.

Partikler mindre enn 100 nm er generelt antatt å effektivt inn lymfekar og trafikk til dLNs 13, mens større partikler (500-2,000 nm) krever aktiv transport av vev-resident DC 12,37. I våre hender, ICMVs med hydrodynamisk størrelse som varierer 150-250 Nm effektivt lokalisert og vedvarte i DLN, noe som resulterer i omfattende CTL og humorale responser 6,7. I løpet av 24 timer fra administreringen ble ICMVs forbundet med subkapsulær sinus makrofager i dLNs, og strømningscytometrisk analyser utført på dag 1 og 4 viste at de fleste ICMVs innenfor dLNs ble tatt opp av LN-resident APC med bare en liten andel av partikler i forbindelse med Langerhans og dermal DCs 7. Resultatene indikerte at passiv transport er den viktigste måten å ICMV trafficking til dLNs. Disse studiene har benyttet fluoroforen-merket nanopartikler og proteinantigener å avgrense sine lokaliserings og distribusjonsmønstre i dLNs. Konfokalmikroskopi av cryosectioned dLNs slipper ekstra immunfluorescens histokjemi for identifisering av LN strukturer (f.eks GL-7 uttrykk i germinalsentre) og celler i samspill med formuleringen komponenter (f.eks DCs - CD11c, makrofager - F4 / 80, CD169, og B- celler & #8211; B220) 7,9. Denne teknikken kan utføres parallelt med flowcytometri analyser av celler høstet fra dLNs å avgrense de undergrupper av APCer som er ansvarlige for partikkel uptake 7,9 eller med hel-dyr avbildning for å kvantifisere vaksine levering fra injeksjonsstedet til dLNs 38,39, forutsatt at de fluorescente signalene er sterke og vev autofluorescens ikke forstyrrer signalene.

Effektiv immunisering krever robuste aktivering og ekspansjon av antigenspesifikke cytotoksiske T-celler, som kan spores av helkropps bioluminescens avbildning etter adoptiv overføring av selvlysende, antigen-spesifikke transgene T-celler, etterfulgt av vaksinering. Den ekstra fordel med denne metoden er muligheten for gjentatt visualisering av CTL handel med de samme dyrene i en lengre periode, og dermed redusere antall dyr er nødvendig for immunologiske analyser, og å unngå bruk av arbeidskrevende celleisolasjon procedures. Ved hjelp av denne avbildningsteknikk, har vi nylig vist at pulmonal administrasjon av ICMVs ko-lastet med protein antigen og et immunstimulerende middel førte til potent utløsning av antigen-spesifikke CD8 + T-celler i lungen og mediastinum LNS og påfølgende spredning av CTL å distale slimhinnevev , inkludert Peyers patcher, cecum, og vaginal kanalen 9. Strømningscytometrisk analyser viste at disse nylig utvidet CD8 + T-celler ble merket med en "slimhinne-homing" fenotype, karakterisert ved α 4 β 7 + integrininhibitorer ekspresjon og medierte beskyttende immunresponser mot viral mucosal utfordring 9. Hele-animalsk avbildning av bioluminescerende CD8 + T-celler ble også nylig benyttet av Hailemicheal et al., Som viste at tumorantigenet peptidet formuleres i ufullstendig Freunds adjuvans (IFA, olje-i-vann-emulsjon) resulterte i sekvestrering av T-celler på stedet av injeksjonsmed vaksine "depot" bort fra tumormasser, som fører til T-celle dysfunksjon og sletting 40.

Tetramer farging har vært brukt i stor utstrekning i det siste for å kvantifisere nivået av endogent CTL-responser som skyldes ulike vaksineformuleringer 21. Denne teknikken er også relevant og vanligvis benyttes i tidlige humane kreftimmunterapi kliniske forsøk for å bekrefte CTL-responser på spesifikke tumorassosierte antigener 41,42. PBMC kan lett hentes fra mus og forberedt for flowcytometri; Det kan imidlertid ikke avsløre den fulle omfanget av T-celle-ekspansjon på grunn av celle lokalisering til depot-formings vaksiner som nevnt før eller i løpet av tumorer i cancermodeller, og dermed krever mer omfattende analyser. Kompatibiliteten til denne metoden med flowcytometri tillater bestemmelse av antigen-spesifikke T-celler med lagermarkører (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, og KLRG-1) for å skille effektor, sentrale minne, og effektor hukommelse cells blant Tetramer + T celler 43 eller langvarige vev bosatt CTL 44,45 (som oppsummert i siste vurderinger 46,47). Imidlertid gir tetramer flekker analysen bare den innledende vurderingen av CTL-responser siden svært utvidede antigen-spesifikke T-celler kan ha tegn på immun utmattelse 48,49. Funksjonell evaluering av CTL-responser kan bli utført ved å undersøke cytokin-frigjøring med enzymbundet immunospot (ELISPOT) 50 eller intracellulær farging cytokin 51 etter ex vivo stimulering av lymfocytter med minimal epitoper, så vel som ved måling av de intracellulære nivåene av perforin og granzyme B 52 og ekstracellulære uttrykk for CD107a og CD107b på degranulation 53. I tillegg kan cytolytisk funksjon av CTL være direkte vurderes med CTL cytotoksisitetsanalyser utført in vitro eller in vivo 54-56.

Induksjon av humorale immunresponseretter nanopartikkel vaksinasjon kan studeres parallelt med CD8 + T-celle analyser som presenteres her. Antistofftitere kan analyseres ved den tradisjonelle metoden for enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), mens antistoff affinitet og bredden av epitop godkjenning kan vurderes ved å endre ELISA-protokollen ved anvendelse av kaotropisk middel (for eksempel urea) i løpet av antistoffbinding til substrat og bruk av underdomener i antigener som substrater, henholdsvis 7. Utløsning av potente humorale responser krever utvidelse av follikkelutvikling hjelper CD4 + T-celler (T fh) 57. For å undersøke ekspansjon av T FH-celler i respons til partikkel vaksinering, kan protokollen som presenteres her lett tilpasses for isolering av antigen-spesifikke CD4 + T-celler fra OT-II-transgene mus, etterfulgt av adoptiv overføring til celle naive resipientmus. Etter vaksinering kan lymfevev høstes og analysert med flowcytometrisk analyser for å avskrekkemin ekspansjon av antigenspesifikke T-FH-celler (identifisert ved deres CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotype) 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Perkin Elmer gitt produksjonskostnadene påløper under offentliggjøringen av denne artikkelen.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Institute of Health gi 1K22AI097291-01 og ved Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences av National Institutes of Health i henhold Award Antall UL1TR000433. Vi erkjenner også Prof. Darrell Irvine ved MIT og professor Matthias Stephan ved Fred Hutchinson Cancer Center for deres bidrag på den innledende arbeidet med vaksinenanopartikler og OT-I / Luc transgene mus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6, (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3, (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics