משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University
* These authors contributed equally

Published 3/25/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

Cite this Article

Copy Citation

Gaj, T., Liu, J. Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains. J. Vis. Exp. (97), e52814, doi:10.3791/52814 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מאוד אסטרטגיות אספקת החלבון יעילה ותכליתיות הן קריטיות למחקר בסיסי ויישומים רבים טיפוליים. המשלוח הישיר של חלבונים מטוהרים לתאים מייצג את אחד מהשיטות הבטוחות ביותר והקלה ביותר להשגת מטרה זו. בניגוד ל1,2 אסטרטגיות המסתמכות על ביטוי גנים מחומצות גרעין, 3-5 משלוח החלבון אינו מהווה סיכון של mutagenesis insertional, אינו תלוי ב שעתוק / מכונות תרגום וסלולרי מאפשר לתוקף באופן מיידי. עם זאת, חוסר שיטות פשוטות ולהכליל למעניקים פעילות חודרת תאים על חלבונים מבלבל באופן שגרתי הכניסה הישירה שלהם לתאים. שיטות קיימים להקלת משלוח חלבון תאית המבוססות על השימוש באופן טבעי 6-8 או תוכנן פפטידים חודרים-תא, 9-12 תחומים התמרה לעייף, ו13,14 חלקיקים 15 ויפוזומים, 16 חלקיקים כמו וירוס-17,18 19 למרבה הצער, רבים מן הגישות הללו הם הקשו על ידי שיעורים נמוכים סלולריים ספיגה, 20,21 יציבות עניה, 22 סגוליות שלא במתכוון תא מסוג, 23 נכסי בריחת endosomal הנמוך 24 ורעילות. 25 בנוסף, רב חלבון טכנולוגיות התמרה להפחית את הפעילות הביולוגית של החלבונים נמסרו. 14

המעבדה שלנו הראתה כי nuclease אבץ-אצבע בעבר חלבונים (ZFN) - הגבלת chimeric endonucleases בהיקף של 2 כלי- 2 חלבון לתכנות Cys אבץ-אצבע ה- DNA מחייבת ותחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI 26-28 - מטבעם תאי ד' חדיר. 29 פעילות חודרת תאים מפתיע זה הוצגה להיות רכוש מהותי של תחום אבץ-אצבע אישית מעוצב, פלטפורמת ה- DNA מחייב שהתפתחה ככלי רב עוצמה למטרת הגנום enההנדסה באמריקה, 30-32 ונחשבת לתוצאה של קבוצת הכוכבים של שש שאריות מטען חשמליות חיוביות על פני החלבון. ואכן, כמה חלבוני קושרי DNA, כוללים ג-ג'ון וN-DEK הוכחו יש יכולת מולדת לחצות קרום תא. 33 לאחרונה, המעבדה שלנו התרחבה על תוצאות אלו, והראו שהפעילות חודרת תאים של zinc- תחומים אצבע (ZIF) יכולים להיות ממונפים למסירת חלבון תאית. היתוך גנטי של שני תחומים זיף אחת או שתי אצבעות למטען חלבון מסוים הוביל לספיגה יעילה שעלו על מערכות רבות קונבנציונליות חודר תאי פפטיד משלוח. 34 בעיקר, משלוח בתיווך זיף לא התפשר הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו והקל רמות גבוהות של משלוח cytosolic. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה להדגים את הפוטנציאל של תחום הזיף להקלה על ההעברה היעילה וקלילה של חלבונים, וסוגים שעלולים להיות יותר מגוונים של מאקרומולקולות, לתאים.

כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט על כיצד ליישם טכנולוגית זיף למסירת חלבון בתאי יונקים מוצג. בנינו חבילה של עבר אחד, שתיים, שלוש, ארבעה, חמש ושש-אצבע תחומים זיף שחסר את היכולת לקשור DNA, עקב החלפה של כל אחד משאריות ה- DNA מחייבת α-סליל, אבל הם מסוגלים לספק חלבונים לתאים 34 (איור 1). הייצור והתמרה של Emerald GFP (EmGFP) לתאי הלה באמצעות תחום זיף שתי אצבעות מתוארת. פרוטוקול זה הוא הרחבה לכמעט כל חלבון מסוגל ביטוי מסיס בEscherichia coli וכמעט כל סוג של תאי יונקים. תוצאות צפויות מסופקות ואסטרטגיות למקסם את הביצועים של מערכת זו הם דנו גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט

  1. להשיג תחומים זיף שתי אצבעות-הוחלף אלאנין שכבר תת-שובטו לתוך מערכת וקטור ביטוי PET-28 והנם זמינים לפי בקשה (PET-2F-זיף). 34
  2. PCR להגביר EmGFP מפלסמיד Emerald-pBAD עם פריימרים 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma אני אתר מודגש) ו 3 'SACI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 " ; Sac אני אתר מודגש).
    1. השתמש 5 ng של DNA תבנית, 10 μl של חיץ 10x פולימראז, 1 יח '(U) של פולימראז תקי DNA, 0.2 מ"מ כל אחד dNTP ו -0.2 מיקרומטר של כל צבע יסוד בפתרון 100 μl עם הנפח שנותר מורכבים ממים מזוקקים / deionized . השתמש בתנאי הרכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; C ° 72 במשך 10 דקות. לטהר את מוצר ה- PCR על ידי extracti ג'לובלקבוע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר.
  3. Digest PET-2F-זיף ולהוסיף קידוד EmGFP עם הגבלת אנזימי Xma אני וSac אני במאגר מומלץ ל3 שעות על 37 מעלות צלזיוס באמצעות 10 U של אנזים לכל 1 מיקרוגרם של ה- DNA. דמיין DNA על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל באמצעות צבע intercalating פלורסנט, כגון ברומיד ethidium.
  4. לטהר את ה- DNA מתעכל על ידי ערכת חילוץ ג'ל ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר.
  5. ולקשור DNA EmGFP הקידוד המטוהרים ל50-100 ng של PET-2F-זיף באמצעות 1 U של אנזים T4 DNA לשעות לפחות 1 ב RT לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את תגובת קשירה באמצעות 6: יחס טוחנת להכניס לוקטור 1.
  6. הפשירי 50 μl של כל XL-1 תאי coli Escherichia הכחול כימי מוסמכים על קרח ומערבבים בעדינות עם 10-20 ng של ligated PET-2F-הזיף-EmGFP.
  7. שמור על קרח 30 דקות. הלם חום את התערובת על 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ולשחזר את התאים ב 2 מיליליטר של מרק הסופר אופטימלי עם דיכוי Catabolite (SOC) עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
  8. התפשטות תרבות התאוששות 100 μl על מרק lysogeny (LB) צלחת אגר עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. למחרת, לחסן 6 מיליליטר של סופר מרק (SB) או תרבות LB המכילה 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת מצלחת LB אגר ותרבות O / N על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: המושבה PCR באמצעות פריימרים 5 'XmaI-EmGFP ו 3' SACI-EmGFP יכול לשמש כדי לזהות שיבוטים חיוביים לפני miniprep
  10. לטהר PET-2F-הזיף-EmGFP ידי miniprep ולאשר פלסמיד על ידי רצפי DNA באמצעות אמרגן T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ").

2. ביטוי וטיהור

  1. להפשיר 50 μl של כימי המוסמך BL21 E. coli תאים על קרח ומערבבים בעדינות עם של PET-2F-הזיף-EmGFP pl 100 ngasmid. להפוך כמתואר בשלבים 1.7-1.8.
  2. למחרת, לחסן 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
  3. למחרת, לדלל את 10 מיליליטר של O / תרבות N לתוך 1 ליטר של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, גלוקוז 0.2% ו -100 מיקרומטר ZnCl 2. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.8 ולגרום לביטוי חלבון עם 2 מ"מ איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לאחר 6 שעות של צמיחה על 37 מעלות צלזיוס, תאי קציר על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    הערה: תנאי אינדוקציה הם משתנים מאוד ותלויים ביציבות של החלבונים לידי ביטוי. לפקח על OD 600 כל 30 דקות עד OD 600 של 0.8 הוא הגיע.
  4. Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ תמוגה (50 מ"מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ 'dithiothreitol M (DTT), 1 מ"מ MgCl 2, פלואוריד 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF) ו -10 מ"מ imidazole, pH 8.0). Lyse התאים על קרח על ידי sonication עם ההגדרה הבאה: 50% תפוקת כוח, זמן תהליך 4 דקות עם 5 שניות על / 10 שניות את מרווחים. הימנע מחימום יתר הפתרון.
  5. צנטריפוגה lysate התא ב25,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לתוך צינור איסוף טרי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את כל השלבים ב 4 מעלות צלזיוס הבאות.
  6. הפעל את supernatant דרך עמודה מראש ארוז עם 1 מיליליטר של תרחיף Ni-נ.ת.ע equilibrated. לשטוף את השרף עם 20 מיליליטר של חיץ לשטוף (50 מ"מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ MgCl imidazole 2 ו -30 מ"מ, pH 8.0).
  7. Elute החלבון עם 5 מיליליטר של חיץ elution (50 מ"מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ"מ DTT, 1 מ"מ MgCl 2, ו -300 מ"מ imidazole, pH 8.0).
  8. מאגר להחליף חלבון eluted עם חיץ אחסון (50 מ"מטריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ"מ DTT, 1 גליצרול מ"מ MgCl 2 ו -10%, pH 8.0) ולרכז את החלבון לפחות 40 מיקרומטר באמצעות concentrator ספין על ידי צנטריפוגה על פי הוראות היצרן.
  9. קביעת ריכוז חלבון על ידי BCA או assay ברדפורד. לערבב 2 μl של חלבונים מטוהרים עם 2 μl 2 × צבע טעינת SDS-PAGE, רתיחה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לפתור על 4% -20% טריס-גליצין SDS-PAGE להעריך טוהר חלבון (איור 2).

3. חלבון אחסון

  1. Aliquot החלבון המרוכז, פלאש הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לחלבוני היתוך EmGFP, לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום על מנת להגן על החלבון מן האור.
  2. הימנע מהקפאה והפשרה של פתרון החלבון חוזרים ונשנים. הערה: חלבונים התמזגו-זיף הם יציבים בתנאים אלה במשך לפחות 1 חודש. או אחסון לא ראוי חודש> 4 עשוי להוביללמשקעי חלבון או photobleaching של EmGFP.

התמרה 4. חלבון

  1. לשמור על תאי הלה במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 10% (v / v) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% לאנטיביוטיקה antimycotic על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified באופן מלא עם 5% CO 2.
    הערה: תאי passaged יותר מ -30 פעמים אינן מומלצים לתמרת חלבון.
  2. טרום מעיל צלחת 24 גם עם 500 μl 50 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי ליזין למשך 30 עד 60 דקות במהירות של 25 ° C. תאי זרע על צלחת 24 גם בצפיפות של 2 × 10 5 תאים לכל טוב. בגיל 24 שעות לאחר זריעה, או פעם תאים הם בין 80% -90% ומחוברות, להסיר תקשורת מכל טוב ולשטוף עם 500 μl של סרום ללא DMEM המחומם מראש (SFM).
  3. זה טוב, להוסיף 250 μl של SFM המכיל 2 מיקרומטר חלבון הזיף-EmGFP של 100 מיקרומטר ZnCl 2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: תחומים זיף להיכנס לתאי יחסי ציבורimarily דרך macropinocytosis, 34 שהוא מנגנון אנרגיה תלויה. לכן, תאים חייבים להיות טופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך הפנמת חלבון יעילה.
  4. הסר את המדיה מהתאים ולשטוף שלוש פעמים עם 500 μl של סידן ומגנזיום ללא פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco (DPBS) בתוספת 0.5 מ"ג / מיליליטר של הפרין. הערה: הפרין יש צורך להסיר חלבון מאוגד משטח שעשוי לסבך את הניתוח במורד הזרם.
  5. טיפולים (אופציונליים) חזור על עד שלוש פעמים למסירה משופרת.
  6. בודד תאים שטופלו מייד לאחר הפרין לשטוף על ידי עיכול עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. להשעות מחדש תאים מנותקים ב 0.5 מיליליטר של DPBS בתוספת 1% FBS.
  7. למדוד את עוצמת הקרינה של כל דגימה על ידי זרימת cytometry 35 באמצעות ערוץ isothiocyanate והעמסת (FITC) (איור 3). התאם את הפיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC) למקום האוכלוסייהריבית על קנה מידה, על מנת להבטיח שאוכלוסיות עם מאפיינים שונים נפתרות אחד מהשני.
  8. לאסוף 10,000 אירועים חיים עבור כל דגימה ולנתח את הנתונים באמצעות זרימת cytometry ניתוח נתונים תוכנה. 36 הקרינה לנרמל מתאי הלה שטופלו בזיף-EmGFP לאלה תאים שטופלו רק עם SFM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יכולים לבוא לידי ביטוי חלבוני היתוך שתי אצבעות הזיף-EmGFP בE. coli עם> ההומוגניות 95% ותשואות גבוהות (> 25 מ"ג / מיליליטר) (איור 2). באופן כללי, אחד ושתי אצבעות ניתן לייצר חלבוני היתוך זיף בכמויות כמעט זהות לאלו של חלבון ללא שינוי wild-type. עם זאת, בחלק ממקרים, חלבוני היתוך זיף חמישה ושש-אצבע אינם מסוגלים לייצר תשואות גבוהות מספיק עבור יישומים במורד הזרם.

יישום ישיר של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP על תאי הלה למשך 90 דקות ב 37 ° C מוביל לעלייה תלוית מינון הקרינה EmGFP (איור 3 א). באופן ביקורתי, אין הקרינה הוא ציין בהעדר תחום הזיף. אנו נצפו בעבר כי כמעט 100% מתאים הם פלורסנט לאחר טיפול עם רק 2 מיקרומטר של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP, וכי תאים הלה טופלו בחלבון היתוך זיף הם חיוביים לקרינת EmGFP בריכוזים חלבון נמוך כמו 0.25 מיקרומטר (איור 3).

איור 1
איור 1. מבנה ורצף חלבון אבץ-אצבע של. מבנה (למעלה) Crystal של תחום אבץ-אצבע אחת (זיף). הרשתות בצד של Cys נשמרים ושאריות שלו בתיאום עם Zn 2 + יון מוצגים כמקלות (PDB ID: 2I13). 37 רצף (תחתון) של תחום הזיף. חיצים וצילינדרים מצביעים מבנים משניים Β גיליון וα-סליל, בהתאמה. שאריות ה- DNA מחייבת α-סליל שהוחלפו באלאנין מודגשות הוורודות. שאריות מטען חשמליות חיוביים ניבאו לתווך הפנמת תא מודגשות בצבע תכלת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 2
2. איור SDS-PAGE של מטוהר אחד, שתיים, שלושה וארבעה חלבוני היתוך-אצבע הזיף-EmGFP. חלבוני היתוך הזיף-EmGFP באו לידי ביטוי בE. coli ומטוהר על ידי שרף agarose Ni-נת"ע. חלבון eluted נותח לטוהר על ידי SDS-PAGE באמצעות 4% -20% ג'ל טריס-גליצין. אין השפלה או truncations של חלבוני היתוך הזיף-EmGFP משמעותיים נצפתה.

איור 3
איור 3. זיף בתיווך משלוח חלבון לתוך תאי הלה. (א) הקרינה בעוצמה של תאי הלה שטופלו בכמויות גדלות והולכות של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP. תאים הלה טופלו בחלבון EmGFP לבד חופפים לחלוטין עם תאים שלא טופלו. עוצמת הקרינה מנורמלת של תאי הלה שטופלה ברצף עם o 2 מיקרומטר (B)שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP f. עוצמת הקרינה נקבעה על ידי cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד למסירת החלבון השתמשה בתחומי תא חדיר אבץ-אצבע (ZIF) מוצג. תחום הזיף אינו מפחית את הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו 34; מאפשר לייצור והטיהור של חלבונים בתשואות כמעט זהות לאלו שנצפו עם חלבון ללא שינוי; ויכול להעביר חלבונים ואנזימים למגוון רחב של סוגי תאים עם יעילות העולה על מערכות חודרות תאים מסורתיים פפטיד או חלבון תחום התמרה. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על הפוטנציאל הרחב של תחומים זיף לתיווך משלוח חלבון ישיר לתאים למגוון רחב של יישומים.

משלוח חלבון מרבי הושג בעבר רק באמצעות תחום זיף שתי אצבעות, על אף העובדה שהרחיבה את המערכים של שלושה ותחומים זיף ארבע-אצבע לשאת מטען חיובי גדול יותר. ממצאים אלה מצביעים על כך שערך בתא בתיווך זיף עשוי להיות מושפע מגורמים אחרים מאשר תשלום, including יציבות חלבון או נוקשות קונפורמציה. משלוח חלבון בתיווך תחום הזיף נמצא גם להיות אנרגיה תלויה ובכך דורש שכל התאים שטופלו בחלבון להיות טופחו על 37 מעלות צלזיוס. באמצעות השימוש במעכבי מולקולה קטנים של מסלולי endocytic שונים, macropinocytosis, ולאנדוציטוזה caveolin תלויה במידה פחותה, היו נחושים בדעתו להיות המסלולים העיקריים לכניסת תא בתיווך זיף. 34 יש לציין, בניגוד למערכות התמרה חלבון אחרות, תחומים זיף הם מסוגל ביעילות בריחת endosomes לתווך רמות גבוהות של משלוח cytosolic של מטען macromolecular התמזגה, מדגיש את הפוטנציאל של תחומים אלה להשגת אספקת חלבון חזקה.

מניסיוננו, צפיפות הזריעה של תאים היא שלב קריטי להשגת רמות גבוהות של חלבון התמרה. אנו ממליצים טיפול בתאים ברגע שהם יגיעו ל -80% -90% confluency ובעבר ציינו כי תאים שנזרעו ב> 95% משנה תכנית confluencyיכולת התמרה אופטימלית, תוך תאים שנזרעו בצפיפות נמוכה (<50%) רגישים לרעילות עקב חלבון. חשוב לציין, לסוגי תאים עם נטיות ניתוק גבוהות, צלחות תרבית תאים מראש מצופות עם פולי-ליזין מומלץ. פולי-ליזין מאפשר תא קובץ מצורף באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם רכיבים על פני קרום התא טעון שלילי. למרות שאריות ה- DNA מחייבת α-סליל של כל תחום זיף הוסרו כדי למנוע כל פוטנציאל להכרה DNA, שאריות ציסטאין והיסטידין שיתאמו עם יון 2 + Zn לייצב את קיפול תחום ΒΒα הזיף יישארו ללא שינוי. לפיכך, אנו ממליצים כי כל מאגר אחסון להשלים עם לפחות 100 מיקרומטר של ZnCl 2 כדי לשמור על שלמות חלבון.

למרות תחום הזיף הוצג בעבר כדי לספק חלבונים ואנזימים למגוון של סוגי תאים, היעילות של משלוח הזיף עשויה גם להיות תלויה בשני macromoמטען lecular וריכוז חלבון. לדוגמא, תאים שטופלו עם חלבון היתוך זיף-לוציפראז שתי אצבעות נצפו להציג הארה המרבית כאשר טופל עם 0.5 מיקרומטר חלבון, עם פעילות ירדה בריכוזים גבוהים יותר, ואילו תאים שטופלו בשתי אצבעות EmGFP הציג עלייה תלוית מינון הקרינה עוצמה של עד 8.0 חלבון מיקרומטר, ועל טיפולי חלבון ברציפות. לכן אנו ממליצים הערכת יכולת התא החודרת של כל היתוך תחום זיף ייחודי על פני מגוון של ריכוזים.

לבסוף, למרות שעדיין לא הוכיח, אנו צופים כי משלוח תחום הזיף הוא פלטפורמה גמישה מאוד, מסוגלת לספק מערך מגוון של מקרו-מולקולות לתוך תאים. לדוגמא, ייתכן שניתן לשני DNA ו- RNA להיות פונקציונליות כימי על פני השטח של תחום הזיף באמצעות מקשר hydrolyzable, או זמני transfected לתאים על ידי אנקפסולציה של תחומים זיף. בנוסף, efficiency מסירת חלבון זיף יכול להיות עוד יותר משופר על ידי מאמצי תכנון רציונלים התמקדו בתשלום משטח אופטימיזציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (DP1CA174426 לקרלוס פ Barbas) ואוניברסיטת ShanghaiTech, שנחאי, סין (לJL). גרפיקה מולקולרית היו שנוצרה באמצעות PyMOL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XmaI New England Biolabs R0180L
SacI New England Biolabs R0156L
Expand High Fidelity PCR system Roche 11759078001
dNTPs New England Biolabs N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells Life Technologies EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 161-0737
T4 DNA Ligase Life Technologies 15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527I
IPTG Thermo Scientific R0391
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086-5G
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-25
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
DTT Fisher Scientific PR-V3151 
PMSF Thermo Scientific 36978
Ni-NTA Agarose Resin QIAGEN 30210
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMO Millipore UFC900324
DMEM Life Technologies 11966-025
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10437-028
Antibiotic-Antimycotic  Life Technologies 15240-062
24-Well Flat Bottom Plate Sigma-Aldrich CLS3527-100EA
Poly-Lysine Sigma-Aldrich P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium Life Technologies 21600010
Heparan Sulfate Sigma-Aldrich H4777
Trypsin Life Technologies 25300054
HeLa cells ATCC CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats