多能干细胞的海藻酸钠封装使用同轴喷嘴

1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo
Developmental Biology

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Horiguchi, I., Sakai, Y. Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle. J. Vis. Exp. (101), e52835, doi:10.3791/52835 (2015).

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Abstract

Protocol

1.准备材料

  1. 准备10毫米的HEPES缓冲。将pH调节至7.0,在室温,添加NaCl至0.9%。
  2. 制备5%藻酸盐溶液和10mM EDTA的溶液通过混合1.1制备的HEPES缓冲盐水。将pH调节至7.0,在室温。
  3. 高压釜中加入试剂(1.1,1.2)20分钟,在121℃。
  4. 制备层状用1.2明胶包衣60毫米菜- 2.0×10 6的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞,其内含有10%ES-合格FBS和丝裂霉素C的10微克/毫升90当作饲养细胞温育 - 120分钟。
  5. 保持小鼠诱导多能干细胞(iPS)在与饲养细胞在5毫升含有的ES-合格的FBS 20%,50μM2-巯基乙醇,非必需氨基酸和抗生素的DMEM高葡萄糖存在下的菜(青霉素G钠,硫酸链霉素100微克/毫升100单位/毫升,及amphoteri的250纳克/毫升霉素B)中。
  6. 种子4×10 5个iPS细胞在明胶包被60mm培养皿孵育它们在37℃和5%的CO 2。每天孵化过程中改变培养基。后3 -培养的第4天,trypsinize细胞1分钟用500微升含有0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶在37℃和5%的CO 2。在此之后,通过敲击培养皿十倍分离细胞。
  7. 加入2.5的10ml DMEM与ES-合格FBS和抗生素(以下离解小鼠iPS细胞成单个细胞通过移液以1000微升微量三次)离心细胞悬浮液10%,在160×g下3分钟,除去上清液,并计数细胞。以下细胞计数,补种在明胶涂覆的培养皿中收集的细胞,并温育30分钟以从MEF细胞分离iPS细胞。计数细胞后(通常为1 - 3×10 6个细胞/皿可以被收集),上补种4×10 5个iPS细胞这道菜。

2.电池封装成海藻酸钠水凝胶胶囊

  1. 通过在1.5和1.6中描述的相同的方法收集细胞。离心后,在160×g下3分钟,三次洗涤的iPS细胞沉淀用HEPES缓冲盐水中。后重新悬浮的细胞在HEPES缓冲盐水,过滤细胞悬浮液通过40微米的细胞过滤以除去大的聚集体,这可能否则堵塞喷嘴。
  2. 混合料2 ml的细胞悬浮液中的HEPES缓冲盐水和3ml 5%海藻酸钠-Na溶液。最后5毫升细胞悬浮在3%以内海藻酸钠-Na溶液中获得。细胞密度优选大于10 6个细胞/ ml。
  3. 收集的细胞悬浮到5ml的注射器之后,注射器上安装同轴喷嘴( 图1A,B)和设置它们上的注射泵。 EMIT N 2气流量(低于1L /分钟)通过同轴喷嘴的外针和通过内喷嘴排出的细胞悬浮液。
  4. 收集液滴加到250ml 0.5%的CaCl 2溶液并等待10 - 20分钟进行凝胶化,在60-90转,同时搅拌。

3.治疗藻酸胶囊(可选)

  1. 孵育海藻酸钠钙胶囊在0.05%(重量/体积)聚-l-赖氨酸(PLL)中5分钟,溶液在37℃和5%的CO 2。
  2. 洗涤用HEPES缓冲的盐水的胶囊后,孵育他们在DMEM含有10%FBS,以中和在其表面上的电荷。利用它们作为包衣胶囊( 图1C)。
  3. 孵育在含有10mM EDTA的5分钟的HEPES缓冲盐水的胶囊。在EDTA处理的胶囊被用作中空胶囊( 图1C)。

4.文化和收集细胞的藻酸胶囊

  1. 孵育封装细胞以75rpm摇动在37℃和5%CO 2的10天。
  2. 收集和孵化在10mM EDTA的胶囊在37℃和5%CO 2的10分钟。在1,000×g下3分钟收集来自藻酸胶囊不带PLL处理细胞通过离心。
  3. 5000×g下5分钟 - 如果藻酸胶囊与PLL处理,通过移液器上下吹吸10倍左右与连接到一个注射器中,并离心它在1000的针打破海藻酸钠-PLL膜。针直径应比胶囊的尺寸和25克(260微米)的针在本实验中使用的低级(600微米)
  4. 离心后,从严从破碎的海藻酸钠-PLL膜,如果你想收集样品的mRNA从细胞中收集细胞沉淀。剩余的海藻酸钠-PLL膜可能阻止mRNA纯化。

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Representative Results

在协议2.5,排出的藻酸盐溶液构成的球状立即排出后( 图2A - H)。若悬浮液排出用的N 2流动速率大于1L /分下,液滴的尺寸是均匀的( 图2I)。然而,如果N 2流量低于1L /分高时,液滴分解( 图2G,白色带箭头)和液滴的尺寸变得不均匀( 图2J)。鉴于此,它是难以制备的液滴比使用此方法为500μm以下。

在胶凝过程(协议2.4),海藻酸钠娜液滴形成中的CaCl 2溶液球状海藻酸钠钙胶囊如果海藻酸钠钠(超过3%)的浓度是足够的( 图3E-H,K,I)。海藻酸钠钠(低于3%)的但是低浓度导致非球形和胶囊的非平滑的形状( 图3A-D,I),其在涂覆过程中的问题。即使海藻酸钠-Na浓度是不够的,球形胶囊可以通过增加的CaCl 2浓度( 图3J)来形成。然而,大约50的CaCl 2的20mM适合封装,因为过高的浓度的CaCl 2的降低的细胞生长和生存力(数据未示出)。滴入氯化钙溶液后,您也可以选择等待几分钟胶凝但我们建议从氯化钙溶液2拿起胶囊,因为太久孵化氯化钙有时会影响细胞的生长。有时候你获得非球形胶囊即使浓度足够。这可能是因为洗涤细胞团不是海藻酸钠-Na溶液重悬细胞之前足够。残留的试剂,如血清可能防止凝胶。

封装细胞可以在胶囊,但细胞的生长泄漏(箭头图4A)可发生在胶囊没有海藻酸钠-PLL涂层( 图4A)。在小鼠iPS细胞的情况下,将细胞形成圆盘状的聚集体中的每个海藻酸钠钙胶囊( 图4B),而将细胞聚集在一起,形成单一的球形聚集体中的每个中空胶囊( 图4C)。初始细胞密度并不影响聚集体的胶囊,但低细胞密度(10 5个细胞/ ml凝胶)的大小使故障长大(数据未显示)。因此,10 6个细胞/ ml凝胶是可取的封装。

在收集从胶囊中的细胞,海藻酸钠钙的水凝胶可以与藻酸盐裂解酶或螯合试剂被溶解,虽然海藻酸钠锁相环涂层难以溶解用酶或化学品。 ALG-PLL,因此应在物理破碎用移液,例如。碎膜可以从细胞通过离心分离。


封装系统和胶囊的图1.图像(A)在一个干净的长椅海藻酸钠钙封装封装系统的图像。 (B)一种共轴喷嘴进行封装的示意图像。 (C)三种不同类型的这份报告中获得的胶囊。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
的N 2流对胶囊的形态图2.影响连续图像(A - H)。与液滴形成的3%海藻酸钠-Na溶液外观(I,J),从在N 2中的共轴喷嘴流以1L /分钟(A - D,I)和2升/分钟(E - 1H,J)。连续的图像由高速相机拍摄。水凝胶囊形成0.5% 氯化钙请点击此处查看该图的放大版本。

图3
海藻酸钠娜图3.影响和氯化钙浓度对胶囊的形态连续图像(A - H)。和外观-海藻酸钠娜(I L)凝胶微滴在氯化钙溶液中。在连续的图像,液滴具有不同浓度的海藻酸钠钠,2% (A - D)和3%的(E - 1H),被胶凝在50mM的CaCl 2溶液。连续的图像是由喜抓获倍速摄像机。外观照片显示由不同浓度的海藻酸钠钠,2%(L,J)3%(K,L)氯化钙 ,50mM的(L,K)和500毫形成海藻酸钠钙胶囊的形态差异(J,L)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
。iPS细胞的聚集体4,6,8天和10天培养的图4形态封装的小鼠的iPS细胞集料在胶囊显微图像(1 -分别为4)在三种不同类型的胶囊剂组成:(A)裸( B)涂层,和(C)空心胶囊。 请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

封装文化可以直接悬浮培养进行比较。悬浮培养是一个更简单的方法,以获得大量的多能干细胞比包封方法。然而,控制在悬浮培养中的细胞的凝集是仍然具有挑战性。在封装方法,蜂窝聚集在胶囊有限的,因此可以很好地控制。先前的出版物表明,包封的细胞形成大小均匀的聚集体,而大细胞团块出现在自由悬浮培养7。此外,先前的一份报告显示,强烈搅拌导致PS细胞的直接悬浮培养细胞死亡;因此需要在有限的搅拌速度。与此相反,封装能够保护从剪切应力细胞甚至在悬浮条件下。因此,该封装方法允许的灵活性,在操作条件下的水平时在悬浮生长的细胞。

ove_content“>封装是为干细胞研究以及大规模生产过程的变型的有用工具。干细胞的封装是在研究的干细胞小生境,包括细胞外基质和生长因子是有用的。一些研究者已证明小鼠ES细胞的包封进VEGF共轭琼脂糖凝胶促进细胞分化成血祖细胞8。

本文介绍如何轻松地通过使用同轴喷嘴和N 2流封装小鼠iPS细胞分化成规模控制的海藻酸钠钙胶囊。虽然有一些封装过程的各种工具,例如蠕动泵9和电电压10,包封用的N 2流是一个比其它方法简单和更安全的方法。此外,这种方法能够形成更小的(约大于600微米)的胶囊比方法与蠕动泵(约大于3毫米)。大胶囊需要更长的时间完全胶凝长的时间孵化氯化钙可能影响细胞特性。此外,大的胶囊还可能有营养素或废物的质量传递,如葡萄糖和氧的问题。因此,通过N 2流(600 -1,000微米)形成的胶囊的大小是理想的大小内细胞培养物。

这种方法不适合于制备小胶囊和精确地控制尺寸。因为液滴的破裂,这种方法是不适合于制备胶囊大于500μm小。此外,仅目测可确定胶囊的大小,因此难以用这种方法来控制胶囊的大小。在这种情况下,使用微流体装置可能可以解决这些问题11。但是,有时堵塞发生在微型因为海藻酸钠钠凝胶满足氯化钙 SOLUT后立即离子。

尽管藻酸盐是因为它的高粘度的不适合的化学修饰,它是能够形成混合胶囊的水凝胶,其中,像聚乙二醇,也难以用于封装。先前的出版物表明,小鼠iPS细胞在RGD肽结合的PEG-ALG混合水凝胶胶囊封装改善细胞生长12。无化学修饰,细胞包封进只是凝胶胶囊将预期通过保留分泌因子来修改干细胞小生境。事实上,以往的研究表明,分泌生长因子,保留在microbioreactor,均有效地控制干细胞的命运13,14。

细胞从胶囊集合仍然关于封装方法的大规模生产多能干细胞的应用的未解决的问题。先前的一份报告显示,该PLL涂层是必要的kEEP小鼠iPS细胞中7。如果海藻酸钠钙的水凝胶胶囊以及涂布有聚阳离子诸如锁相环(协议3.1 - 3.2),这将是困难的或者酶或螯合试剂来分解胶囊。在这种情况下,需要(协议4.3)的机械方法如移液由针。将回收的细胞可以分离从破碎膜在离心大于5,000×g下,虽然离心有可能会影响到细胞存活率由于高G力。因此,轻轻地从细胞中除去碎屑,​​以及破胶囊的技术是开发封装技术很重要。虽然一些进一步发展需要此方法应用到大规模生产细胞,封装是一种很有前途的技术为大规模生产和干细胞研究。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse embryo fibroblast Cell Biolabs SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell RIKEN Bio resorce centre iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose GIBCO 11995
ES qualified  FBS GIBCO 16141079
Antibacterial Antibiotics GIBCO 15240
Nonessential Amino Acid GIBCO 11140
2-mercaptoethanol GIBCO 21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor Merck Millipore ESG1107
Trypsin/EDTA GIBCO 25300
26 G/16 G needle Hoshiseido
10 ml Syringe TERUMO SS-10ESZ
Sodium  Chloride Wako 191-01665
HEPES SIGMA H4034
Sodium Alginate Wako 194-09955
Calcium Chloride Wako 039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) SIGMA P7890
EDTA DOJINDO 345-01865
Sylinge pump AS ONE
Microscope Olympus IX71
Microscope Leica DM IRB
Hispeed camera nac image technology Memrecam HX-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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