फेज Phenomics: शारीरिक दृष्टिकोण उपन्यास वायरल प्रोटीन विशेषताएँ

Immunology and Infection
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Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

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Abstract

फेज मेजबान बातचीत में मौजूदा जांच (मेटा) जीनोम से ज्ञान extrapolating पर निर्भर हैं। दिलचस्प है, 60 - सभी फेज दृश्यों का 95% वर्तमान एनोटेट प्रोटीन के लिए कोई अनुरूपता साझा करें। नतीजतन, फेज जीनों का एक बड़ा हिस्सा काल्पनिक रूप एनोटेट कर रहे हैं। इस वास्तविकता को भारी दोनों संरचनात्मक और सहायक चयापचय जीनों का एनोटेशन को प्रभावित करता है। यहाँ हम इन अज्ञात फेज जीनों में से एक की अभिव्यक्ति के दौरान एक चयनित मेजबान की शारीरिक प्रतिक्रिया (एस) पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन phenomic विधियों प्रस्तुत करते हैं। Metabolomics मेटाबोलाइट बहुतायत और विविधता की निगरानी के द्वारा द्वि-उत्पाद विश्लेषण प्रदान करता है, जबकि मल्टी फेनोटाइप परख प्लेट्स (एमएपीएस), मेजबान सब्सट्रेट उपयोग और बाद में बायोमास के गठन की विविधता नजर रखने के लिए किया जाता है। दोनों उपकरण एक भी ख्यात फेज खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) की अभिव्यक्ति के साथ जुड़े एक प्ररूपी प्रोफ़ाइल उपलब्ध कराने के लिए एक साथ इस्तेमाल कर रहे हैं। दोनों तरीकों के लिए प्रतिनिधि परिणाम, highl तुलना कर रहे हैंख्यात संरचनात्मक या चयापचय फेज जीन या तो ले जाने के एक मेजबान के प्ररूपी प्रोफ़ाइल मतभेद ighting। इसके अलावा, प्रयोगात्मक विश्लेषण में मदद की है कि दृश्य तकनीकों और उच्च throughput कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों प्रस्तुत कर रहे हैं।

Introduction

(जीवाणुभोजी या फेज उर्फ) जीवाणु को संक्रमित वायरस है कि एक वातावरण 1,2 में विश्व स्तर पर कणों की तरह अधिक से अधिक 10 से 31 वायरस (VLPs) में मौजूद हैं और अन्य सभी जीवों की संख्या से बढ़ना का अनुमान है। समुद्री वातावरण के साथ जुड़े वायरल समुदायों की जांच पहले metagenomic अध्ययन वायरल अंश 3 के भीतर देखा विविधता बढ़ाता पर जोर दिया। इसके अतिरिक्त, Breitbart और उनके सहयोगियों ने वायरल समुदाय दृश्यों का 65% से अधिक सार्वजनिक डेटाबेस में उपलब्ध किसी भी दृश्यों के लिए कोई अनुरूपता साझा पाया। इसके बाद metagenomic पढ़ाई भी इसी तरह का सबूत नहीं मिला: सैन डिएगो में समुद्री तलछट से metagenomes, कैलिफोर्निया में 75% अज्ञात वायरल दृश्यों 4 होते हैं; Salton सागर के hypersaline झीलों से metagenomes 98% अज्ञात वायरल दृश्यों 5 होते हैं; 98% अज्ञात वायरल दृश्यों 6 - और प्रवाल-जुड़े metagenomes 95 होते हैं। Unannotated सूचना के इस संचय में हुई है7 "जैविक ब्रह्मांड के काले पदार्थ" होने फेज आनुवंशिक सामग्री।

फेज के जीनोमिक लक्षण वर्णन मौजूदा न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ तुलना के माध्यम से अनुक्रम समानता की पहचान पर निर्भर करता है। फेज-इनकोडिंग आनुवंशिक जानकारी मुख्य रूप से अज्ञात है, क्योंकि अनुरूपता आधारित विधियों अप्रभावी कर रहे हैं। प्रतिलेखन और नकल जीन, चयापचय जीन, और संरचनात्मक जीनों: उनके जीनोम के भीतर, फगेस आम तौर पर तीन प्रमुख जीन प्रकार के सांकेतिक शब्दों में बदलना। प्रतिलेखन और नकल जीन (कक्षा मैं / द्वितीय जीन 8) पीसीआर, primases, एंडो / एक्सो-न्युक्लिअसिज़, और kinases शामिल हैं। इन जीनों अत्यधिक transcribing और फेज आनुवंशिक सामग्री नकल, फेज संक्रमण में उनके महत्व की वजह से संरक्षित कर रहे हैं। फेज पीसीआर आसानी के कारण उनके वैश्विक संरक्षण 9 के लिए पारंपरिक अनुक्रम अनुरूपता तरीकों का उपयोग पहचान कर रहे हैं और के रूप में प्रभावी वंशावली मार्करों 10 सेवा करने के लिए दिखाया गया है।इसके विपरीत, फेज चयापचय और संरचनात्मक जीन में (कक्षा द्वितीय / तृतीय जीन 8) तेजी से भिन्न है और अक्सर काल्पनिक जीन के रूप में टिप्पणी किए हैं।

फेज चयापचय जीन मेजबान के चयापचय क्षमता प्रभावित करते हैं और जरूरी नहीं कि वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं। अक्सर के रूप में सहायक चयापचय जीन 11 (AMGs) करने के लिए भेजा इन जीनों, मेजबान चयापचय मिलाना और संक्रमण और विरिअन परिपक्वता की सफलता का इष्टतम प्रगति अनुमति देने के लिए दिखाई देते हैं। AMGs सीमित पोषक तत्वों की या ऊर्जा उत्पादन रास्ते में उपयोग और तेज के साथ संबद्ध किया गया है। कुछ उदाहरण प्रकाशतंत्र विभिन्न cyanophage 12-16 के जीनोम में पाया जीन, जीन से जुड़ा हुआ है और फॉस्फेट चयापचय 17,18, और फेज dNTP जैवसंश्लेषण 18,19 के लिए pentose फॉस्फेट मार्ग के उपयोग द्वारा विनियमित शामिल हैं। इसकी तुलना में, संरचनात्मक जीन संक्रमण के दौरान उत्पादन देर से जीन के मध्य में से हैं और अलग-अलग फेज-हो भर में अलग-अलग होसेंट सिस्टम। संरचनात्मक प्रोटीन के उत्पादन को उनके प्रतिलेखन, अनुवाद, और विधानसभा 8 के लिए वायरल dNTP की उपलब्धता, और ऊर्जा पूल पर निर्भर हैं। कैप्सिड और पूंछ फाइबर संरचनात्मक प्रोटीन सभी वायरल प्रोटीन एन्कोडिंग जीनों की सबसे भिन्न रूप में समझा जाता है और सफल विरिअन उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। उनके विचलन आम तौर पर वे वायरस मेजबान coevolution 20 को आकार देने में खेलने सक्रिय भूमिका को जिम्मेदार ठहराया है। पारंपरिक अनुरूपता और अनुक्रम संरेखण तकनीकों का उपयोग करते समय मुक़्तलिफ़ प्रोटीन, की परवाह किए बिना जीन वर्ग के, आसानी से अनदेखी कर रहे हैं। सख्त अनुक्रम तुलना के साथ देखा सीमाओं के लिए सही करने के प्रयास में इस तरह के कृत्रिम तंत्रिका जाल 21 के रूप में एसोसिएशन, यह निर्धारित करने के अनुक्रम विशेषताओं का उपयोग करने में सक्षम जैव सूचना विज्ञान उपकरण में हुई है। कृत्रिम तंत्रिका जाल (ANNs) संरचनात्मक और चयापचय जीन की भविष्यवाणी के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि, सीधे चिह्नित करने के लिए नीचे की ओर प्रायोगिक सत्यापन की आवश्यकताजीन समारोह।

इस पांडुलिपि के उद्देश्य से एक उपन्यास फेज जीन की अभिव्यक्ति के दौरान एक मेजबान के जीवाणु के दोनों catabolic और उपचय चयापचय की निगरानी करने में सक्षम phenomic प्रोटोकॉल प्रदान करना है, कार्यात्मक ANNs के माध्यम से भविष्यवाणी की। phenomics के क्षेत्र, सेलुलर phenotypes के साथ जुड़े जीव विज्ञान, अच्छी तरह से अज्ञात या pleiotropic समारोह के साथ प्रोटीन की जांच में सहायता करने के लिए सिस्टम जीव विज्ञान में स्थापित है। Phenomic उपकरण genotypic जानकारी के लिए प्ररूपी जानकारी जोड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। हम उनके कार्य (एस) के फेज जीन की अभिव्यक्ति के दौरान अवलोकन मेजबान मनोवैज्ञानिक प्रभाव के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है कि ख्यात फेज जीनों के लिए परिकल्पना है। इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, दो मात्रात्मक तरीकों चुने गए हैं। Metabolomics विशिष्ट वातावरण में विकास के दौरान मेजबान मेटाबोलाइट विविधता और रिश्तेदार बहुतायत मापा जाता है, जबकि मल्टी फेनोटाइप परख प्लेट्स (एमएपीएस) मेजबान सब्सट्रेट उपयोग और बाद में बायोमास के गठन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गयामानसिक स्थितियों। ख्यात संरचनात्मक और चयापचय प्रोटीन Escherichia कोलाई में overexpressed थे और दोनों प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणामों की तुलना कर रहे हैं। कई दृश्य तकनीक और उच्च throughput प्रसंस्करण पाइपलाइनों प्रयोगात्मक प्रतिकृति की सुविधा के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। अन्त में, प्रस्तुत तरीकों के reproducibility और सटीकता के एक एनोटेट कैप्सिड प्रोटीन और फेज चयापचय प्रोटीन, thioredoxin, प्लस दो ख्यात AMGs के लिए उम्मीद की मनोवैज्ञानिक प्रभाव के संदर्भ में चर्चा कर रहे हैं।

Protocol

मल्टी-फेनोटाइप परख प्लेट के 1. तैयारी (एमएपी) substrates, बेसल मीडिया, पूर्व विकास मीडिया, और बफर

  1. 1.25% सब्सट्रेट स्टॉक्स - 1.0 की 50 मिलीलीटर बनाओ।
    1. बाँझ पानी में ठोस सब्सट्रेट (w / v) (गर्मी यदि आवश्यक हो तो) 1.25% - 1.0 भंग। आरटी पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट और दुकान के स्टॉक के साथ समाधान बाँझ फ़िल्टर। इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया substrates के उदाहरण तालिका 2 में प्रदान की जाती हैं।
  2. सभी सब्सट्रेट वर्गों (कार्बन, नाइट्रोजन, सल्फर और फास्फोरस) के लिए 3x बेसल मीडिया की 250 मिलीलीटर बनाओ। (40 मिमी MOPS + 10 मिमी Tricine), 0.4% ग्लिसरॉल *, 9.5 मिमी एनएच 4 सीएल *, 0.25 मिमी naso 4 *, 1.0 1x MOPS: MOPS (3-morpholinopropane-1-सल्फ़ोनेट) आधारित बेसल मीडिया 22 निम्नलिखित शामिल मिमी MgSO 4 *, 1.32 मिमी कश्मीर 2 HPO 4 *, 10 मिमी KCl, 0.5 माइक्रोन 2 CaCl, 5 मिमी NaCl, 6 माइक्रोन FeCl 3, और 0.1% (डब्ल्यू / वी) एल arabinose ** (टेबल्स 1 और 2)
    नोट: * इन यौगिकों बेसल मीडिया के आधार पर शामिल नहीं हैं। उदाहरण के लिए, 0.4% ग्लिसरॉल कार्बन बेसल मीडिया में और बेसल मीडिया 1.0 मिमी MgSO 4 1.0 मिमी 2 MgCl द्वारा बदल दिया है सल्फर में नहीं किया जाता है। **-Arabinose एल एक आरा के रूप में तब्दील किया गया था जो pBAD प्रमोटर वेक्टर, pEMB11, के शामिल होने के लिए विशिष्ट है - ई कोलाई K-12 के तनाव (BW के 27,784) 23।
    1. एक बाँझ फ्लास्क बेसल मीडिया के प्रत्येक घटक जोड़ें और मात्रा का हल लाने के लिए। अच्छी तरह से मिश्रण। 0.22 माइक्रोन फिल्टर इकाई के साथ, फिल्टर एक बाँझ बोतल में प्रत्येक बेसल मीडिया बाँझ।
  3. MOPS पूर्व विकास मीडिया की 500 मिलीलीटर बनाओ। MOPS आधारित पूर्व विकास मीडिया 22 निम्नलिखित शामिल हैं: 1x MOPS (40 मिमी MOPS + 10 मिमी Tricine), 0.4% ग्लिसरॉल, 9.5 मिमी एनएच 4 सीएल, 0.25 मिमी naso 4, 1.0 मिमी MgSO 4, 1.32 मिमी कश्मीर 2 HPO 4, 10 मिमी KCl, 0.5 माइक्रोन 2 CaCl, 5 मिमी NaCl, और 6 माइक्रोन FeCl 3।
    1. प्रत्येक जोड़ेंएक बाँझ फ्लास्क पूर्व विकास मीडिया के घटक और मात्रा करने के लिए ले आओ। फिल्टर तो 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में एम्पीसिलीन जोड़ने के लिए, 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के साथ बाँझ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर समाधान।
  4. 0.5x Luria-Bertani (पौंड) अगर प्लेटों की 500 मिलीलीटर बनाओ। एक बाँझ फ्लास्क, एक 0.5x एकाग्रता (1.25 छ खमीर निकालने, 2.5 जी NaCl, 2.5 जी tryptone, 7.5 ग्राम अगर) बनाने के लिए लेग घटकों को जोड़ने। अच्छी तरह मिक्स और बाँझ आटोक्लेव।
    1. कूल अग्रवाल, तो मिश्रण के साथ एंटीबायोटिक एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ने। जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस, पेट्री डिश में अगर की ~ 25 एमएल डालो स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं, और दुकान।
  5. 10 मिमी Tris (7.4 पीएच) से अधिक 10 मिमी MgSO 4 बफर समाधान के 250 मिलीलीटर बनाओ। आरटी पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट, और दुकान के समाधान के साथ बाँझ फिल्टर।

बैक्टीरिया कोशिका निलंबन की 2. तैयारी

  1. ताजा कालोनियों तैयार करें। एक 12.5% ​​ग्लिसरॉल जमे हुए स्टॉक से, ताजा थाली कोलाई clon100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त 0.5x लेग अगर पर ते। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. तरल संस्कृतियों तैयार:
    1. पिपेट संस्कृति ट्यूबों में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त पूर्व विकास मीडिया के 3 मिलीलीटर। प्रत्येक क्लोन के लिए, जैविक triplicates का उपयोग करें।
    2. तैयार संस्कृति ट्यूबों में 2.1 अनुभाग से स्वतंत्र कालोनियों टीका लगाना। 22 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. गोली और बैक्टीरियल कोशिकाओं को धोने:
    1. स्थानांतरण हे / 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में एन संस्कृतियों। एक microcentrifuge में 2 मिनट के लिए अधिकतम गति (16,900 XG) पर centrifugation के माध्यम से गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला छानना और 10 मिमी Tris / 10 मिमी MgSO 4 बफर के 500 μl में फिर से निलंबित द्वारा कोशिकाओं को धो लें। दोहराएँ।
    2. पुन: गोली कोशिकाओं, निथारना सतह पर तैरनेवाला और 10 मिमी Tris / 10 मिमी MgSO 4 बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  4. सेल घनत्व को मापने और (यदि आवश्यक हो) कोशिकाओं ध्यान केंद्रित:
    1. खंड 2.3.3 से कोशिकाओं को पतला में 10 गुना10 मिमी Tris / 10 मिमी 4 बफर MgSO और एक क्युवेट में इस कमजोर पड़ने हस्तांतरण। ऑप्टिकल घनत्व इस कमजोर पड़ने और रिकार्ड की (आयुध डिपो 600 एनएम) को मापने।
    2. नक्शे में 0.07 (आयुध डिपो 600 एनएम) के अंतिम एकाग्रता (वे नक्शे के लिए जोड़ रहे हैं जब कोशिकाओं इसलिए कोशिकाओं आयुध डिपो 600 एनएम = 1.05 की एक शुरुआती एकाग्रता में रहने की जरूरत है, 15 गुना पतला हो जाएगा) प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को ध्यान लगाओ। एक जलाशय में केंद्रित सेल निलंबन स्थानांतरण और नक्शे तैयार करने के कदम 3.5 तक (आरटी पर) बचाने के लिए।

मल्टी-फेनोटाइप परख प्लेटें 3. तैयारी (एमएपीएस)

  1. मैप लेबल। एक के साथ लेबल बाँझ 96 अच्छी तरह से सूक्ष्म अनुमापांक प्लेटों कोलाई क्लोन पहचान संख्या और योजनाबद्ध प्रकार नक्शा।
  2. नक्शे में विभाज्य बाँझ पानी। एक तरल जलाशय में Aseptically स्थानांतरण बाँझ पानी। पिपेट एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग सूक्ष्म अनुमापांक थाली के प्रत्येक कुएं में 60 μl।
  3. विभाज्य बेसल मीडिया में intओ नक्शे। एक तरल जलाशय में बेसल मीडिया 3x Aseptically हस्तांतरण। पिपेट एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग सूक्ष्म अनुमापांक थाली के प्रत्येक कुएं में 50 μl। दोहराएँ एमएपी ढांच के रूप में प्रयोग किया जाता प्रत्येक बेसल मीडिया के लिए 3.2 और 3.3 दोहराएँ।
  4. नक्शे में विभाज्य substrates के। नक्शे का उचित कुएं में प्रत्येक सब्सट्रेट के 30 μl स्थानांतरण।
  5. नक्शे के लिए जीवाणु निलंबन जोड़ें। स्थानांतरण एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग नक्शा प्रत्येक कुएं में खंड 2.4.2 से बैक्टीरियल कोशिकाओं के 10 μl। वापस संस्कृति शेयर में फिर से शुरू करने पिपेट से पहले सुझावों को बदलें।
  6. चिपकने वाली फिल्म के साथ कवर नक्शे। एक भी चिपकने वाला थाली फिल्म के साथ प्रत्येक प्लेट कवर। मजबूती से एक भी और तंग सील बनाने के लिए थाली के कुओं के ऊपर और किनारों के साथ फिल्म दबाएँ। एक बाँझ धार के साथ सूक्ष्म अनुमापांक थाली के किनारों से अतिरिक्त फिल्म निकालें।
  7. नक्शे के ऑप्टिकल घनत्व को मापने:
    1. एक बहु-प्लेट SPECTRO की 'इनपुट' आस्तीन में तैयार मानचित्र स्थानदीप्तिमापी प्लेट रीडर। ओपन प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर और पढ़ता के बीच झटकों के 60 सेकंड के साथ, 32 घंटा की कुल के लिए absorbance के (आयुध डिपो के 600 एनएम) हर 30 मिनट, उपाय है कि एक प्रोटोकॉल बना सकते हैं।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए तंत्र में सेट तापमान। मैप तापमान सेट करने के लिए equilibrated एक बार प्रोटोकॉल प्रारंभ करें।
    3. 32 घंटे के बाद, प्लेट रीडर के "उत्पादन" आस्तीन के नक्शे से हटा दें। शामिल करने के लिए प्रत्येक डेटा पाठ फ़ाइल लेबल: ई कोलाई क्लोन पहचान संख्या, एमएपी चलाने की तिथि, और नक्शे योजनाबद्ध प्रकार।

4. मल्टी फेनोटाइप परख प्लेटें (एमएपीएस) प्रसंस्करण और parameterization

  1. एक स्वचालित क्यूए प्रक्रिया, जैसे, PMAnalyzer 24 का उपयोग कर विकास घटता का आकलन करें।
    1. सत्यापित करें कि विकास घटता आयुध डिपो 600 एनएम <पहले 2 घंटे में 0.20 है। कारण आम तौर पर हल करने के लिए जो संक्षेपण की कलाकृतियों को फिल्टर में प्रारंभिक समय बिंदु (टी 0) पर absorbance का उपयोग न करेंटी 1 (30 मिनट)।
    2. क्यूए फिल्टर का उल्लंघन करने वाले विकास घटता निकालें। वक्र जानकारी सहेजें (नमूना नाम, अच्छी तरह से संख्या, और आयुध डिपो 600 एनएम मान) भविष्य में संदर्भ के लिए एक अलग आउटपुट फ़ाइल में। विकास की अवस्था क्यूए फिल्टर गुजरता अगर विश्लेषण के साथ जारी रखें।
  2. मंझला विकास घटता गणना। प्रति अच्छी तरह से, डेटा को दोहराने का उपयोग करना, हर समय बिंदु पर मंझला ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट 600 एनएम) मान लेने से मंझला विकास की अवस्था की गणना। भविष्य में उपयोग के लिए एक अलग आउटपुट फ़ाइल में मंझला विकास घटता जिसके परिणामस्वरूप रिकॉर्ड।
  3. Zwietering 25 द्वारा प्रस्तावित समीकरण का एक अनुकूलन का उपयोग करते हुए प्रत्येक विकास की अवस्था के लिए सबसे अच्छा फिट रसद मॉडल की गणना। समय अंतराल, λ (मानव संसाधन), विकास की अधिकतम दर, μ मैक्स (आयुध डिपो 600 एनएम 100 -1), और अंतिम बायोमास उपज, α (आयुध डिपो 600 एनएम): रसद समीकरण बैक्टीरियल वृद्धि का वर्णन तीन पैरामीटर शामिल हैं। के रूप में समय = 30 मिनट (Y 1) में डेटा का उपयोग करें कारण संक्षेपण की कलाकृतियों के लिए प्रारंभिक मूल्य।
    1 समीकरण [1]
    1. एक सीधा खोज का उपयोग कर अधिक से अधिक विकास दर की गणना। डेटा के भीतर एक 90 मिनट के अंतराल पर परिवर्तन का सबसे बड़ा दर रिकॉर्ड।
      2 समीकरण [2]
    2. एक 90 मिनट की खिड़की के ऊपर सबसे बड़ा चल औसत के ऊपरी उपगामी मूल्य के लिए खोज के द्वारा अंतिम बायोमास पैदावार का अनुमान है। विशेष रूप से, विकास की अवस्था के asymptote के रूप में परिभाषित करते हैं।
      3 समीकरण [3]
    3. Μ अधिकतम और 4.3.1 और 4.3.2 से एक मूल्यों का प्रयोग, सभी मूल्यों λ कोशिश कर रहा द्वारा λ मूल्य मिल:
      समीकरण 4 [4]
      1. चुकता त्रुटि (एस) की राशि की गणना करने के लिए प्रत्येक λ मान का उपयोग करें। सबसे कम एस एस (λS) है का उपयोग करें:
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

नक्शे के 5. Phenotype विश्लेषण

  1. सब्सट्रेट प्रति क्लोन प्रति समग्र विकास का आकलन करने के लिए प्रत्येक विकास की अवस्था के लिए विकास के स्तर (जीएल) की गणना। स्थानांतरित कर दिया रसद-सज्जित मूल्यों के हार्मोनिक मतलब के रूप में जीएल परिभाषित करें:
    समीकरण 6 [6]
  2. जीएल मूल्यों के आधार पर प्रत्येक विकास की अवस्था के लिए एक phenotype निरुपित। इधर, इस्तेमाल किया चार phenotypes हैं: वृद्धि की उम्मीद, कोई विकास नहीं, समारोह के लाभ, और समारोह के नुकसान।
    1. दूर माध्य से मानक विचलन के मामले में एक विशिष्ट सब्सट्रेट पर सभी क्लोन भर में विकास की तुलना द्वारा phenotypes के निर्धारण करते हैं। विकास की अवस्था (चित्रा 1 ए, बी)। चित्रा 1C फेनोटाइप असाइनमेंट के उदाहरण प्रदान करता द्वारा प्रस्तुत फेनोटाइप नामित करने के लिए यह आँकड़ा और एक न्यूनतम वृद्धि दहलीज का प्रयोग करें।
    2. जीएल ≥ 0.4 (Figur के रूप में विकास को परिभाषित करेंई 1 ए, बी)। एक जीएल होने के रूप में कार्य का लाभ (हरी चित्रा 1C,)> परिभाषित मतलब है और एक मतलब> वृद्धि सीमा से ऊपर दो मानक विचलन। समारोह (लाल चित्रा 1C,) का नुकसान एक जीएल <दो मानक मतलब है नीचे विचलन और एक मतलब> विकास दहलीज होने के रूप में परिभाषित किया गया है।
  3. Phenotypes और विकास घटता के आधार पर डेटा सेट का दृश्य निरूपण बनाएँ।
    1. रंग के रूप में आयुध डिपो 600 एनएम मूल्यों में चित्रित दृश्य विकास की गतिशीलता जल्दी से कई क्लोन (चित्रा 2) के बीच विकास घटता तुलना करने के लिए।
    2. विकास की स्थिति (चित्रा 3) के आधार पर सभी क्लोन के बीच प्ररूपी वितरण देखें।

6. सतत संस्कृति उपकरण बिल्डिंग

  1. रिएक्टर बंदरगाह निर्माण (चित्रा -4 ए, बी)। में तीन 1/4। छेद ड्रिल में 3/4 स्थान दिया गया है। इसके अलावा, निरंतर संस्कृति रिएक्टर की टोपी में।
    1. एफओआर पोर्ट α: एक महिला luer धागा शैली पैनल में 1/16 को माउंट पेंच कंटिया कंटिया टोपी से बाहर है, ओर इशारा करते हुए के साथ टोपी के नीचे से।। एक 1/4 में। पैनल के साथ सुरक्षित कंटिया ताला अखरोट माउंट।
    2. पोर्ट β के लिए: एक महिला luer धागा शैली पैनल में 1/16 को माउंट पेंच कंटिया कंटिया टोपी से बाहर, ऊपर की ओर इशारा करते हैं।। एक 1/4 में। पैनल के साथ सुरक्षित कंटिया ताला अखरोट माउंट।
    3. पोर्ट γ के लिए:। कंटिया टोपी से बाहर, ऊपर इशारा कर रहा है, तो एक महिला luer धागा शैली पैनल टोपी के नीचे से कंटिया में 1/16 को माउंट पेंच। सुरक्षित कंटिया में 1/4 के साथ। पैनल ताला अखरोट माउंट। में 1/8 का अभिन्न अंग ताला अंगूठी के साथ एक पुरुष luer भाड़ में। विस्तृत बोर नली टोपी के अंदर पर ढाले कंटिया करने के लिए।
    4. बहिर्वाह बंदरगाह के लिए: में एक 5/16 ड्रिल निरंतर संस्कृति रिएक्टर के 75 एमएल निशान पर छेद।। में 3/4 काटें। में 1/4 का अखरोट अंत बंद। कांटेदार दिवार फिटिंग। में 1/4 में भाड़ में। कांटेदार दिवार फिटिंग (गैसकेट बोतल के बाहर पर है और अखरोट के अंदर, एफ पर हैigure 4 बी)।
  2. दूध पिलाने की बोतल बंदरगाह निर्माण (चित्रा 4C)। ड्रिल में दो 1/4। छेद में 1 स्थान दिया गया है। इसके अलावा दूध की बोतल की टोपी में।
    1. पोर्ट δ के लिए: एक महिला luer धागा शैली पैनल में 1/8 के लिए माउंट पेंच कंटिया कंटिया टोपी से बाहर, ऊपर की ओर इशारा करते हैं।। एक 1/4 में। पैनल के साथ सुरक्षित कंटिया ताला अखरोट माउंट।
    2. पोर्ट ε के लिए: एक महिला luer धागा शैली पैनल में 1/16 को माउंट पेंच कंटिया कंटिया टोपी से बाहर, ऊपर की ओर इशारा करते हैं।। एक 1/4 में। पैनल के साथ सुरक्षित कंटिया ताला अखरोट माउंट।
      1. में 1/8 का अभिन्न अंग ताला अंगूठी के साथ एक पुरुष luer भाड़ में। विस्तृत बोर नली फिटिंग कंटिया के लिए, टोपी के अंदर पर।
  3. ट्यूब और ट्यूब एक्सटेंशन दूध पिलाने:
    1. ट्यूबिंग के दो 1 में। टुकड़े काटें (में 1/8। बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) में 1/16 एक्स। भीतरी व्यास (आईडी))। बंदरगाहों पर फिट टुकड़े α और सतत संस्कृति रिएक्टर की γ खंड 5.2 में बनाया है।
    2. में एक भी 1 काटें। टी का टुकड़ा(में 1/4।। आईडी में आयुध डिपो एक्स 1/8) ubing। निरंतर संस्कृति रिएक्टर के बंदरगाह Β पर फिट टुकड़ा।
    3. में। ट्यूबिंग का टुकड़ा एक भी 3.5 कट में (1/8। में आयुध डिपो एक्स 1/16। आईडी)। में 1/8 का अभिन्न अंग ताला अंगूठी के साथ पुरुष luer पर, बंदरगाह γ के अंदर करने के लिए इस टुकड़ा फिट। विस्तृत बोर नली। पोर्ट γ निरंतर संस्कृति रिएक्टर का नमूना लेने के बंदरगाह है।
    4. में। ट्यूबिंग का टुकड़ा (में 1/4। में आयुध डिपो एक्स 1/8। आईडी) एक एकल 1 काटें। दूध की बोतल के δ बंदरगाह पर इस टुकड़ा फिट।
    5. (में 1/16। में आयुध डिपो एक्स 1/8। ID) में। ट्यूबिंग का टुकड़ा एक एकल 11 काटें। में 1/8 का अभिन्न अंग ताला अंगूठी के साथ पुरुष luer पर, दूध की बोतल के बंदरगाह ε के अंदर करने के लिए इस टुकड़ा फिट। विस्तृत बोर नली।
    6. (में 1/8। में आयुध डिपो एक्स 1/16। आईडी) ट्यूबिंग के दो 18 में। टुकड़े काट लें। दूध की बोतल के ε बंदरगाह के लिए एक टुकड़ा फिट। धारा 7 के लिए अन्य टुकड़ा बचाओ।

7. Metabolomics के लिए सतत संस्कृति रनिंग

  1. सामग्री जीवाणुरहित:
    1. Autocla30 मिनट के लिए सूखी सामग्री किया है। एल्यूमीनियम पन्नी में खंड 5 में की गई दूध की बोतल की टोपी रैप करने के लिए सुनिश्चित करें। संलग्न ट्यूबिंग को सीधा रखें।
      1. एल्यूमीनियम पन्नी में खंड 5 में बनाया निरंतर संस्कृति रिएक्टर की टोपी, लपेटें। संलग्न ट्यूबिंग को सीधा रखें। में 18 लपेटें। खंड 6.3.5 में ट्यूबिंग कटौती और एल्यूमीनियम पन्नी में सबसे छोटी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग एडाप्टर। ट्यूबिंग को सीधा रखें। 30 मिनट के लिए आटोक्लेव।
    2. 0.5x लेग शोरबा के 2 एल बनाओ। दूध की बोतल में, 0.5x लेग शोरबा बनाने के। पन्नी के साथ बोतल खिला कवर। 1 घंटे के लिए आटोक्लेव।
    3. 0.5x लेग शोरबा के 70 मिलीलीटर बनाओ। निरंतर संस्कृति रिएक्टर में शोरबा डालो। निरंतर संस्कृति रिएक्टर में एक हलचल पट्टी रखें। 30 मिनट के लिए पन्नी और आटोक्लेव के साथ रिएक्टर कवर।
  2. सतत संस्कृति सेट-अप:
    1. बैक्टीरिया कोशिका निलंबन।
      1. एक 12.5% ​​ग्लिसरॉल जमे हुए स्टॉक से, ताजा थाली 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त 0.5x लेग अगर पर कोलाई क्लोन। सेते24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
      2. 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त 0.5x लेग शोरबा के 3 मिलीलीटर में एक ही कॉलोनी टीका लगाना। प्रत्येक क्लोन के लिए जैविक triplicates का उपयोग करें। 22 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. भागों को एक साथ कनेक्ट करें।
      1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी autoclaved सामग्री प्लेस और मीडिया ठंडा जबकि पर पराबैंगनी प्रकाश बारी है। मीडिया ठंडा हो जाने के बाद, सभी 0.5x लेग शोरबा के लिए 0.1% एल arabinose और 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन जोड़ें।
      2. निरंतर संस्कृति रिएक्टर टोपी खोलना और रिएक्टर पर पेंच। नमूना ट्यूब को छूने से बचें। दूध की बोतल टोपी खोलना और दूध की बोतल पर पेंच। नमूना ट्यूब को छूने से बचें।
      3. में 18 रखें। बंदरगाह ε बाँझ से जुड़ी ट्यूबिंग। 18 में। ट्यूबिंग और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग एडाप्टर अन-लपेटो।
      4. में 18 वर्ष की एक मुक्त अंत फ़िट। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग एडाप्टर के एक छोर पर ट्यूबिंग। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग एडाप्टर के दूसरे छोर से फ़िट18 में। ट्यूबिंग दूध की बोतल टोपी के ε बंदरगाह से जुड़ी।
      5. बंदरगाहों β पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर इकाइयों पेंच और निरंतर संस्कृति रिएक्टर की δ। पोर्ट α की एडाप्टर पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट भाड़ में। 0.22 माइक्रोन फिल्टर इकाई के लिए,। ट्यूबिंग में 18 के मुक्त अंत फिट बैठते हैं।
    3. निरंतर संस्कृति को प्रारंभ करें।
      1. जैव सुरक्षा हुड में, खंड 7.2.1.1 में की गई हे / एन संस्कृति के 100 μl के साथ निरंतर संस्कृति रिएक्टर टीका लगाना।
      2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में निरंतर संस्कृति जाने से पहले बंद प्रणाली। इनक्यूबेटर में एक चुंबकीय हलचल प्लेट और मिनी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की स्थापना की है।
      3. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग एडाप्टर फ़िट। दूध की बोतल से ट्यूबिंग में शुरू होता है पक्ष और रिएक्टर के लिए अग्रणी ट्यूबिंग "आउट" पक्ष में शुरू होता है "में"।
      4. "फास्ट": करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप सेट करें। अनुसंधान के लिए स्विचन द्वारा क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू20; आगे "। मीडिया ट्यूबिंग के माध्यम से प्रवाह शुरू होता है कि जाँच करें।
      5. चुंबकीय हलचल प्लेट पर रिएक्टर प्लेस और मिश्रण शुरू करते हैं। सतत संस्कृति रिएक्टर नमूने से पहले 24 घंटे के लिए संतुलित करना चाहिए।
    4. निरंतर संस्कृति का नमूना। पोर्ट γ पर एक 5 एमएल luer लोक सिरिंज पेंच और 4.5 मिलीलीटर संस्कृति के पुल।
      1. घनत्व (आयुध डिपो 600 एनएम) को मापने के लिए संस्कृति के 500 μl का प्रयोग करें। आयुध डिपो के 600 एनएम पर 4 एक्स 1 मिलीलीटर संस्कृतियों = 0.35 बनाने के लिए कोशिकाओं पतला।
      2. विभाज्य 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में संस्कृतियों पतला। 4 दिनों के लिए हर 12 घंटा नमूने दोहराएँ।
    5. जीसी TOFMS के लिए नमूने तैयार:
      1. 2 मिनट के लिए अधिकतम गति (16,900 XG) पर centrifugation के माध्यम से गोली कोशिकाओं। छानना सतह पर तैरनेवाला। फॉस्फेट बफर खारा के 500 μl (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। इस चरण को दोहराएँ।
      2. एक अंतिम समय सतह पर तैरनेवाला छानना, और फिर बंद हो जाता है बुदबुदाती जब तक तरल नाइट्रोजन में pelleted कोशिकाओं के साथ microfuge ट्यूबों डूब। एसडिग्री सेल्सियस फ्रीजर में -80 नमूने फाड़ दिया।

8. Metabolomics के लिए सीरियल पारित होने बैच संस्कृति रनिंग

  1. बैक्टीरिया कोशिका निलंबन की तैयारी। एक 12.5% ​​ग्लिसरॉल जमे हुए स्टॉक से, ताजा थाली कोलाई 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त 0.5x लेग अगर पर क्लोन एम्पीसिलीन। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    1. में व्यक्तिगत कालोनियों टीका लगाना 3 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त 0.5x लेग शोरबा की मिलीलीटर एम्पीसिलीन। प्रत्येक क्लोन के लिए जैविक triplicates का प्रयोग करें।
  2. सीरियल बीतने के बैच संस्कृतियों।
    1. 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और 0.1% एल arabinose युक्त लेग शोरबा के 3 मिलीलीटर में एक 500 गुना कमजोर पड़ने के माध्यम से 8.1.1 से उपसंकृति हे / एन। उपसंकृति एक आयुध डिपो 600 एनएम <0,005 होनी चाहिए। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 2 और 2.5 घंटा में ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट 600 एनएम) की जाँच करें। आयुध डिपो के 600 एनएम = 0.35 हासिल करने के लिए कोशिकाओं को विकसित।
      1. एक 500 गुना डि माध्यम उपसंकृति50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और 0.1% एल arabinose युक्त लेग शोरबा के 3 मिलीलीटर में lution। उपसंकृति एक आयुध डिपो 600 एनएम <0,005 होनी चाहिए।
    3. 2 और 2.5 घंटा में ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट 600 एनएम) की जाँच करें। आयुध डिपो के 600 एनएम = 0.35 हासिल करने के लिए कोशिकाओं को विकसित।
  3. धारावाहिक बीतने के बैच संस्कृतियों नमूना।
    1. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक फिल्टर कई गुना के शीर्ष पर एक 0.22 झिल्ली फिल्टर जगह है। विभाज्य 1 फिल्टर पेपर पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के मिलीलीटर और फिर वैक्यूम पंप पर बारी।
    2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के अलावा दोहराएँ। फिल्टर पेपर पर खंड 8.2.3 से उपसंस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण। यहाँ से, तुरंत तरल नाइट्रोजन में नमूने प्राप्त करने के लिए तेजी से कदम। 1 मिनट में यह पूरा हो गया।
    3. फिल्टर पेपर पर पीबीएस के विभाज्य 1 मिलीलीटर नमूना धोने के लिए। फिल्टर पेपर के पक्षों पर नमूना spilling के बिना तेजी से फ्लश। दोहराएँ।
    4. ध्यान से फाई तह द्वारा एक 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में बाँझ संदंश जगह फिल्टर का प्रयोगlter। बंद हो जाता है बुदबुदाती जब तक तरल नाइट्रोजन में microfuge ट्यूब डूब। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर नमूना।

9. metabolite विश्लेषण और प्रसंस्करण

  1. पोत नमूना प्रसंस्करण, विश्लेषण और जीसी TOFMS को सामान्य बनाने के लिए एक metabolomics कोर की सुविधा के लिए सूखी बर्फ पर क्लोन प्रति 3 नमूने हैं।
  2. प्रत्येक नमूना के लिए दोहराने के डेटा का उपयोग कर, चयापचयों भर में भिन्नता का मतलब है, मंझला, मानक विचलन और गुणांक निर्धारित करते हैं।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मैन्युअल रूप से परिभाषित शर्तों का पालन नहीं करते कि चयापचयों दूर करने के लिए सशर्त बयान और दोहराव फांसी 26 का उपयोग कर एक क्यूए पाइप लाइन कोड।
    1. दशा के लिए 1, 2 से अधिक नमूने शून्य बहुतायत है, जिसमें चयापचयों को हटा दें। Metabolomic प्रोफाइल से आंतरिक मानकों निकालें।
    2. हालत 2 के लिए, ब्याज की कोशिकाओं में नहीं पाए जाते हैं कि उन चयापचयों को हटा दें। इधर, निम्नलिखित चयापचयों निकालें: इण्डोल 3 एसीटेट, dihydroabiet आईसी एसिड, nonadecanoic एसिड, चिरायता एसिड, salicylaldehyde, कोलेस्ट्रॉल, फिनोल, 1-monostearin, octadecanol, 1-monopalmitin, dodecane, dodecanol, 1-hexadecanol, 5-methoxytryptamine, benzoic एसिड, pentadecanoic एसिड, फॉस्फोरिक एसिड, pelargonic एसिड, पामिटिक एसिड, capric एसिड, hydroxylamine, स्टीयरिक अम्ल, Myristic एसिड, maleimide, levoglucosan, और 4-hydroxybutyric एसिड।
    3. हालत 3 के लिए, बदलाव की जिसका गुणांक 1 से अधिक है उन चयापचयों को हटा दें।
  4. मेटाबोलाइट रिश्तेदार abundances को देखकर वैश्विक metabolomics प्रभाव पर कब्जा।
    1. प्रत्येक मेटाबोलाइट (चित्रा 6) के लिए क्लोन प्रति मंझला मेटाबोलाइट बहुतायत के एक दृश्य प्रतिनिधित्व बनाएँ।
  5. क्लोन-मेटाबोलाइट जोड़ी आवृत्तियों देख कर outliers को पहचानें।
    1. एक क्लोन में हर मेटाबोलाइट में से प्रत्येक के औसत मूल्य के लिए जेड स्कोर की गणना। निम्न समीकरण का उपयोग जेड स्कोर की गणना:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      नोट: टर्म एक्स एम सी एक विशिष्ट क्लोन के लिए एक विशिष्ट मेटाबोलाइट की बहुतायत स्तर का प्रतिनिधित्व करता है। टर्म μ सी एक विशिष्ट मेटाबोलाइट के लिए सभी क्लोन का मतलब प्रतिनिधित्व करता है। टर्म σ सी जुड़े मानक विचलन है।
    2. Outliers डाला जाता है, जिसमें डेटा के एक दृश्य प्रतिनिधित्व बनाएँ (डेटा उपलब्ध नहीं कराया गया)।

Representative Results

इस अध्ययन में चयनित खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है सभी नमूनों स्टारबक द्वीप, साइट 7 (STAR7) और कैरोलीन एटोल, दक्षिणी लाइन द्वीपसमूह की साइट 9 (CAR9) से एकत्र किए गए थे। पहले से 5 वर्णित के रूप में इन साइटों से समुद्री जल के एक अनुमान के अनुसार 100 एल, मूंगा सीमा परत का उपयोग कर तोड़ लेना पंप नीचे एकत्र किया गया था। पंपों की सामग्री छोटे यूकेरियोट्स दूर करने के लिए बड़े pored फिल्टर के माध्यम से fractionalization के अधीन थे और बाद में केवल रोगाणुओं और कणों (VLPs) जैसे वायरल छोड़ने 100 केडीए स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर का उपयोग ध्यान केंद्रित किया। VLPs अलग करने के लिए शेष समुद्री जल virome में जिसके परिणामस्वरूप 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया था। क्लोरोफॉर्म किसी भी शेष कोशिकाओं के विकास को गिरफ्तार करने के लिए इस वायरल अंश के लिए शुरू की और 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो गया था।

VLPs घनत्व ढ़ाल centrifugation के माध्यम से अलग और वीर की वसूली के लिए अनुमति देते हैं जिसमें सीज़ियम क्लोराइड विधि, का उपयोग कर शुद्ध गयापर आयनों ~ 1.35 ग्राम / मिलीलीटर से 1.5 ग्राम / मिलीलीटर 3। वायरल डीएनए एक CTAB / फिनोल का उपयोग कर निकाला गया था: क्लोरोफॉर्म प्रोटोकॉल और Phi29 अभिकर्मकों का उपयोग कर एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन के माध्यम से परिलक्षित। Virome का अनुक्रमण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pyrosequencing प्रौद्योगिकी के साथ पूरा किया गया।

इस प्रकार इस अध्ययन के लिए प्रसंस्करण और वायरल ORFs के चयन में इस्तेमाल जैव सूचना विज्ञान रहे हैं। तीन पूर्व प्रसंस्करण कदम CAR9 और STAR7 वायरल metagenomes पर इस्तेमाल किया गया। पहला, सार्वजनिक सॉफ्टवेयर अनुक्रमण 27 करने से पहले वायरल डीएनए का प्रवर्धन से हुई कि टैग दृश्यों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। दूसरा, इस तरह के दृश्य डुप्लिकेट और कम प्रतिलिपि संख्या के रूप में आम अनुक्रमण कलाकृतियों एक अतिरिक्त जैव सूचना विज्ञान कार्यक्रम 28 के माध्यम से डाटासेट के बाहर फ़िल्टर किया गया। अन्त में, विदेशी अनुक्रम संदूषण 29 के हटाने ≥ 90% कवरेज और निम्न डेटाबेस में दृश्यों के साथ ≥ 94% पहचान थी कि उन दृश्यों के लिए प्रदर्शन किया गया था: RefSeq Virus जीनोम; मानव - संदर्भ GRCh37; मानव - Celera जीनोमिक्स; मानव - क्रेग वेंटर (HuRef); मानव - Seong जिन किम (कोरियाई); मानव - 7 गुणसूत्र संस्करण 2 (TCAG); और मानव - जेम्स वाटसन, Yanhuang (YH, एशियाई), योरूबा (NA18507; अफ्रीकी) संदर्भ दृश्यों 21। इन प्रक्रियाओं के बाद, CAR9 नमूनों से दृश्यों 591,600 कुल और STAR7 दृश्यों 939,311 कुल। इन दृश्यों MGRAST पर अपलोड की और डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग कर कोडांतरक सॉफ्टवेयर के माध्यम से इकट्ठे हुए थे। पहले से 21 के रूप में वर्णित Contigs, 6 पढ़ने फ्रेम और ख्यात खुला पढ़ने फ्रेम (pORFs) स्क्रिप्ट का उपयोग कर पहचाना गया में अनुवाद किया गया।

समानता आधारित खोजों के एक नंबर से जाना जाता समारोह की ORFs दूर करने के लिए प्रदर्शन किया गया अज्ञात ORFs की पहचान करने के लिए। संक्षेप में, निम्न खोजों उनके इसी खोज मापदंड 21 के साथ प्रदर्शन किया गया:

  1. ≥ से अधिक ≥ 95% पहचान का अहम समानता40 आधार जोड़ी M5NR डेटाबेस में MGRAST blat द्वारा (बीपी)।
  2. मेरा Metagenome डाटाबेस संसाधन के सभी सार्वजनिक metagenomes के खिलाफ TBLASTN द्वारा महत्वपूर्ण समानता (0.001 ≤ ई-मूल्य)।
  3. एनआर डेटाबेस के खिलाफ महत्वपूर्ण BLASTP से समानता (0.001 ≤ ई-मूल्य) और TBLASTN।
  4. उल्लेखनीय समानता संरक्षित डोमेन डेटाबेस के खिलाफ आर पी एस-विस्फोट से (0.001 ≤ ई-मूल्य)।
  5. प्रोटीन डाटा बैंक में हल प्रोटीन संरचनाओं के खिलाफ मुकाबले प्रत्येक डाटासेट के एक का चयन अंश से प्रोटीन में अनुवाद।
  6. डाईन्यूक्लियोटाइड हस्ताक्षर पैकेज का उपयोग कर डाईन्यूक्लियोटाइड आवृत्तियों की गणना।

जिसके परिणामस्वरूप pORFs में अभिव्यक्ति के लिए डिजाइन किए गए थे कोलाई सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीन डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। में अभिव्यक्ति को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन एक यूनिवर्सल कोडोन उपयोग तालिका कार्यरत एमिनो एसिड दृश्यों के पीछे-अनुवाद 2% की एक न्यूनतम उपयोग सीमारेखा के साथ कोलाई। प्रतिबंध एंजाइम मान्यता अनुक्रमBamHI और HindIII के लिए क्लोनिंग की सुविधा के लिए दृश्यों से बाहर रखा गया है। मानक प्रतिबंध एंजाइम क्लोनिंग के माध्यम से, एक कंपनी के बाहर से इंजीनियर जीन 30 दृश्यों संश्लेषित और फिर ORFs एक मध्यम प्रतिलिपि संख्या pBAD प्रमोटर वेक्टर, pEMB11 में क्लोन किया गया। सभी क्लोन में तब्दील हो गया कोलाई K-12 के तनाव BW के 27,784 23।

मल्टी-फेनोटाइप परख प्लेट्स (एमएपीएस)

एक उच्च throughput और मजबूत सॉफ्टवेयर पाइप लाइन के नक्शे, PMAnalyzer 24 के विश्लेषण के लिए leveraged किया गया था। पठनीय पाठ फ़ाइलें, गुणवत्ता आश्वासन के लिए विकास घटता (क्यूए) के पूर्व प्रसंस्करण, और विकास घटता का विश्लेषण करने के लिए गणितीय मॉडलिंग तकनीकों का प्रदर्शन करने में डेटा स्वरूपण, ऑप्टिकल घनत्व फाइलों की पार्स: पाइप लाइन सहित विभिन्न चरणों का एक लिनक्स सर्वर वातावरण में विकसित और प्रदर्शन किया गया था । प्राथमिक मॉडलिंग लिपियों PyLab मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए अजगर संस्करण 2.7.5 में विकसित किए गए।

(2A चित्रा) के लिए मानक त्रुटि (एसई) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। कच्चे विकास घटता प्रयोग के दौरान कार्यक्रम PMAnalyzer सही रूप parameterized और मॉडलिंग की क्लोन विकास (नहीं दिखाया डेटा) निर्धारित करने के लिए रसद विकास घटता की तुलना में थे। नक्शे और PMAnalyzer की सटीकता और वैधता पर अधिक जानकारी के लिए एट अल। 24 क्यूवास देखना

विधि के सत्यापन के बाद, नक्शे डाटा प्रोसेसिंग पाइप लाइन के द्वारा दी जाने वाली ऐसी अधिकतम वृद्धि दर (μ अधिकतम) और विकास के स्तर (जीएल) के रूप में कई मापदंडों का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया था। विकास घटता का तुलनात्मक दृश्य अक्सर विकास डेटा व्याख्या के लिए प्रयोग किया जाता है; हालांकि, तुलना के लिए एक समय में देखे जा सकते हैं कि घटता की संख्या सीमाएँ हैं। एक साथ कई विकास घटता का विश्लेषण करने के लिए, गर्मी के नक्शे व्युत्पन्न भूखंडों एक भी substrat पर हो क्लोन के दसियों तुलना करने के लिए implored गयास्थिति है कि 'औसत प्रतिक्रिया (चित्रा 2 बी) के खिलाफ ई। एक उपन्यास फेज प्रोटीन की overexpression द्वारा रखा प्रभाव विशेष रूप से, वक्र मापदंडों में परिवर्तन के माध्यम से मनाया जाता है: चरण, घातीय चरण और अधिकतम बायोमास उपज (asymptote) अंतराल। एक उदाहरण के रूप में, कैप्सिड प्रोटीन (2A चित्रा) के लिए विकास की अवस्था में मॉडलिंग घातीय चरण में अंतराल चरण से खड़ी चढ़ाई चित्रा 2B के गतिशील साजिश में एक ही क्लोन के लिए काले से सफेद रंग की तीव्रता में एक त्वरित बदलाव से reproduced है ।

Substrates के पार क्लोन वितरण की एक वैश्विक तस्वीर प्राप्त करने के लिए, जीएल से निकाली गई प्ररूपी वर्गीकरण (चित्रा 3) का इस्तेमाल किया गया था। इधर, चार phenotypes के प्रत्येक बार की ऊंचाई एक विशिष्ट सब्सट्रेट के लिए कि फेनोटाइप प्रदर्शित करने के क्लोन की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, जहां चार चार्ट में अलग कर रहे हैं। डेटा में Outliers फू की "लाभ में गिरने क्लोन के रूप में पहचाने जाते हैंnction "या" समारोह "श्रेणी के नुकसान। Outliers तो व्यक्तिगत रूप से बाहर की मांग की जा और प्रयोगात्मक और अधिक बारीकी से जांच की जा सकता है। इसके अलावा, वैश्विक विश्लेषण परख में सब्सट्रेट पूर्वाग्रहों को पहचानता है। ऐसे फेनिलएलनिन, सेब का तेज़ाब, और ग्लाइसिन के रूप में Substrates एक "कोई विकास नहीं" वर्गीकरण में हुई। लगातार सभी क्लोन के पार, कोई विकास वर्गीकरण में गिर जाते हैं कि Substrates, भारी बहाव के कार्यात्मक लक्षण वर्णन में भारित नहीं कर रहे हैं।

Metabolomics

अज्ञात फेज जीन व्यक्त क्लोन से catabolic उत्पादों metabolomics का उपयोग कर पहचान की गई। संक्षेप में, क्लोन से पहले एक metabolomics कोर सुविधा पर जीसी TOFMS विश्लेषण के लिए बाहर भेजा जा रहा करने के लिए बैच संस्कृति वातावरण में एक निरंतर संस्कृति या धारावाहिक बीतने या तो अधीन हो गया। चुना कोर सुविधा द्वारा कार्यान्वित जीसी TOFMS के लिए नमूना प्रोसेसिंग, विश्लेषण, और सामान्य बनाने पर जानकारी के लिए Fiehn एट अल। 31 Bri देखनाefly, ठंड निष्कर्षण विलायक के 1 मिलीलीटर नमूने vortexed और 5 मिनट के लिए एक ठंडा स्नान में sonicated कर रहे हैं, जिसके बाद प्रत्येक नमूने, के लिए जोड़ा है। नमूने अंत में centrifuged हैं और नमूना का आधा decanted और विश्लेषण के लिए नीचे सूख रहा है। अर्क शुद्ध और गैस chromatograph पर लादा और फिर बाद में मास स्पेक्ट्रोमीटर को हस्तांतरित किए जाने से पहले आंतरिक प्रतिधारण सूचकांक मार्कर के साथ नुकीला कर रहे हैं। प्रत्येक नमूने से डाटा वर्णलेख में सभी का पता चला संकेतों के लिए संकेत तीव्रता रिपोर्ट कर रहे हैं कि इस तरह का विश्लेषण किया जाता है। सामान्य बनाने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए चोटियों की बहुतायत अभिव्यक्त किया जाता है और कुल शिखर abundances सेट में सभी नमूनों के बीच औसत निकाला जाता है। नमूना प्रति metabolite abundances नमूना पीक बहुतायत से विभाजित और फिर नमूना सेट का औसत शिखर बहुतायत से गुणा कर रहे हैं। परिणामी डेटा पर चर्चा की अनुसंधान में metabolomics के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है।

Metabolomics reproducibility के सत्यापन के लिए आवश्यक थाप्रत्येक संवर्धन विधि के लिए उपयुक्त नमूने का आकार निर्धारित करते हैं। नमूने के भीतर देखा सटीक और नमूना भर में देखा भिन्नता का पता लगाने के लिए दोनों एन = 3 और एन = 6 डेटासेट की समीक्षा की गई (चित्रा 5 ब) के लिए मतलब (एस एम) की मानक त्रुटि आकार। भले ही निरंतर संस्कृति (सीसी) नमूना आकार के, डेटा के 1% से कम 1.5 ≤ एक एस एम किया था। माध्य एस एम एस 221 और 300 थे, और मान 0, 5 से 10 एक्स 7.55 करने के लिए और 3.74 एक्स 10 5 के लिए एन = 3 और एन = 6 क्रमशः से बताया गया। एस एम एस भी नमूने के प्रत्येक सेट के लिए गणना की गई धारावाहिक संस्कृति (अनुसूचित जाति) विधि में replicates। फिर, डेटा के 1% से कम 1.5 ≤ एक एस एम, 137 के एक औसत एस एम, और 0 एक्स 3.51 के लिए 10 5 से एक सीमा थी। एस एम प्रत्येक नमूना सेट के बीच वितरण (सीसी एन = 3 बनाम तुलना करने के लिए अनुसूचित जाति बनाम। सीसी एन = 6, सीसी एन = 3 बनाम अनुसूचित जाति एन = 3, और सीसी एन = 6 N = 3) एक क्रमचय परीक्षण किया गया था। distribया तो निरंतर संस्कृति एस एम डाटासेट मूल्यों का ution धारावाहिक संस्कृति एस एम मूल्यों (पी मूल्य = 0.0) के वितरण से काफी अलग नहीं था। हालांकि, निरंतर संस्कृति एन = 3 डेटा के लिए एस एम मूल्यों का वितरण (1.908804 एक्स 10 -49 = पी मूल्य) एस एम निरंतर संस्कृति के लिए मूल्यों एन = 6 डेटा के उस से काफी अलग था। अन्त में, मेटाबोलाइट प्रति विभिन्नता का गुणांक और एक गुणवत्ता आश्वासन (क्यूए) चरण के कार्यान्वयन के बाद (चित्रा 5C) से पहले की तुलना में किया गया था। कुल में, 210 चयापचयों क्यूए पाइपलाइन (डेटा का 40%) के कार्यान्वयन के बाद हटा दिया गया। हटा दिया डेटा का 1% से कम 2% ~ 5% चयापचयों से डेटा से पहले में कभी नहीं देखा गया था, आंतरिक मानक डेटा था ~, शून्य का एक मेटाबोलाइट बहुतायत थी कोलाई, और शेष चयापचयों (> 30%) 1 से अधिक परिवर्तन की एक गुणांक था।

मैप विश्लेषण के साथ, वैश्विक observatio के रूप मेंएनएस जानकारी metabolomics प्रस्तावों की गहराई का एक प्रारंभिक समझ प्रदान की है। एक वैश्विक तस्वीर प्राप्त करने के लिए, क्लोन पदानुक्रम क्लोन-मेटाबोलाइट प्रोफाइल, संबंधित कार्यों के साथ संभावित क्लोन, और क्लोन-मेटाबोलाइट outliers (चित्रा 6) के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के उनके रिश्तेदार मेटाबोलाइट abundances के आधार पर संकुल रहे थे। प्रोटीन कार्यों को उजागर करने के लिए, चयापचयों अलग कर दिया और आम चयापचय मार्ग के आधार पर वर्गीकृत किया है। प्रारंभिक परिणामों के साथ इस विश्लेषण का उपयोग करना, यह (क्लोन पर प्रकाश डाला, चित्रा 6) metabolomics विभिन्न वर्गों से जीन को अलग करने में सक्षम है कि स्पष्ट हो गया था। इसके अलावा, metabolomics डेटा के साथ ग़ैर पहचान प्रत्येक क्लोन-मेटाबोलाइट जोड़ी के लिए मानक के स्कोर (जेड स्कोर) की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था। सांख्यिकीय महत्व को सुनिश्चित करने के लिए, outliers के डेटा का केवल 5 प्रतिशत के लिए लेखांकन, 2 की एक जेड स्कोर मूल्य के साथ एक क्लोन-मेटाबोलाइट जोड़ी के रूप में परिभाषित किया गया (डेटा) नहीं दिखाया।

ether.within-पेज = "हमेशा"> चित्र 1
चित्रा phenotype के वर्गीकरण के 1. परिभाषाएं। विकास स्तर (जीएल) और अधिकतम वृद्धि दर के बीच (ए) के संबंध। लाल रंग में परिक्रमा डेटा बिंदुओं कोई सब्सट्रेट उपयोग करने के लिए छोटी दिखा विकास घटता प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) Boxplot प्रतिनिधित्व एक न्यूनतम वृद्धि दर (<0.15 आयुध डिपो / घंटा) के साथ विकास घटता के वितरण पर आधारित विकास दहलीज को परिभाषित। (सी) जीएल के विचरण और मानक विचलन सब्सट्रेट डी-गैलेक्टोज के लिए गणना की है। लघु धराशायी लाइनों दो मानक विचलन दूर माध्य से प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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सटीक और भेदभाव के माध्यम से चित्रा 2. मैप सत्यापन। (ए) एनोटेट संरचनात्मक (Capsid) और चयापचय क्लोन के लिए विकास घटता (Thioredoxin), दो उपन्यास चयापचय क्लोन (EDT2440, EDT2441), और क्लोन की औसत प्रतिक्रिया सुक्रोज, डी पर हो गैलेक्टोज और डी-mannose नक्शे में। नीली लाइनों को दोहराने के डेटा के बीच देखा मानक त्रुटि से संकेत मिलता है (एन = 3)। (बी) के 47 विभिन्न क्लोन के लिए विकास घटता सुक्रोज, डी-गैलेक्टोज और डी-mannose के लिए गर्मी नक्शे के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। एनोटेट संरचनात्मक (हरा वृत्त) और चयापचय क्लोन (नारंगी सर्कल), दो उपन्यास चयापचय क्लोन (गहरे और हल्के नीले रंग हलकों), और औसत प्रतिक्रिया (लाल वृत्त) डाला जाता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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कई substrates के पार एक phenotype के लिए चित्रा 3. क्लोन वितरण। फेनोटाइप-क्लोन 72 कार्बन-विशिष्ट विकास की स्थिति को भर में 47 क्लोन के लिए गिनती। तालिका प्रत्येक phenotype के लिए प्रत्यक्ष मायने रखता है प्रदान करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
निरंतर संस्कृति तंत्र के निर्माण का ब्यौरा चित्रा 4. आरेख। (ए) α-γ निरंतर संस्कृति रिएक्टर के बंदरगाहों का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कदम, (बी) के चरणों (सी बाहर प्रवाह निरंतर संस्कृति रिएक्टर के बंदरगाह, और निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया ) बंदरगाहों δ और सतत संस्कृति दूध की बोतल के ε का निर्माण करने के लिए कदम। = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
प्रस्तुत phenomic तरीकों में से 5 चित्रा तुलना करें। मल्टी फेनोटाइप परख प्लेट्स (एमएपीएस), सतत संस्कृतियों और धारावाहिक संस्कृतियों की तैयारी के लिए (ए) कार्यप्रवाह। (बी) के मतलब की मानक त्रुटि (एस एम) के प्रतिशत में गिना जाता है, दोनों के लिए एन = 3 और एन = metabolomics के लिए निरंतर संस्कृति (सीसी) और धारावाहिक संस्कृति (अनुसूचित जाति) तैयार करने के तरीकों के लिए 6 नमूना आकार। शाफ़्ट एक प्रवेश पैमाने पर है। (सी) मेटाबोलाइट प्रति भिन्नता (सीवी) के गुणांकों के वितरण से पहले और निरंतर संस्कृति (सीसी) विधि के लिए क्यूए पाइप लाइन के कार्यान्वयन के बाद।g5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
निरंतर संस्कृति में उगाया क्लोन के 6 चित्रा Metabolomic प्रोफाइल। चयापचयों का एक सेट के लिए औसत मेटाबोलाइट abundances निरंतर संस्कृतियों में उगाई जाने वाली 84 क्लोन के लिए योजना बनाई है। एनोटेट (Capsid) संरचनात्मक और चयापचय क्लोन (Thioredoxin), दो उपन्यास चयापचय क्लोन (EDT2440, EDT2441), और औसत चयापचय प्रतिक्रिया के लिए metabolite प्रोफाइल को लाल रंग में डाला जाता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक कार्बन नाइट्रोजन गंधक फास्फोरस
ग्लिसरॉल - 0.40% 0.40% 0.40%
अमोनियम क्लोराइड 9.5 मिमी - 9.5 मिमी 9.5 मिमी
सोडियम सल्फेट 0.250 मिमी 0.250 मिमी - 0.250 मिमी
मैग्नीशियम सल्फेट 1.0 मिमी 1.0 मिमी - 1.0 मिमी
पोटेशियम फास्फेट 1.32 मिमी 1.32 मिमी 1.32 मिमी -
मैग्नीशियम क्लोराइड - - * -
पोटेशियम क्लोराइड 10 मिमी 10 मिमी 10 मिमी 10 मिमी
कैल्शियम क्लोराइड 0.5 माइक्रोन 0.5 माइक्रोन 0.5 माइक्रोन
सोडियम क्लोराइड 5 मिमी 5 मिमी 5 मिमी 5 मिमी
फ़ेरिक क्लोराइड 6 माइक्रोन 6 माइक्रोन 6 माइक्रोन 6 माइक्रोन
एल arabinose 0.10% 0.10% 0.10% 0.10%
MOPS 7.4 पीएच 1x 1x 1x 1x

तालिका 1 यौगिकों और नक्शे में इस्तेमाल अलग बेसल मीडिया की सांद्रता। * मैग्नीशियम क्लोराइड की 1.0 मिमी प्रतिस्थापित है। 1x MOPS = 40 मिमी mops, 4 मिमी Tricine।

एल Lysine
कार्बन substrates के नाइट्रोजन के substrates सल्फर substrates के पीhosphorus substrates के
2 डिओक्सी-डी-राइबोज़ 2-डिओक्सी-डी-राइबोज़ 1-ब्यूटेन-सल्फोनिक एसिड एडेनोसाइन-5-monophoshate
4 हाइड्रोक्सी-फिनाइल एसिटिक एसिड acetamide एसिटाइल सिस्टीन बीटा-glycerophosphate
एसीटिक अम्ल एडिनाइन डी-सिस्टीन creatinephosphate
एडेनोसाइन-5-मोनोफास्फेट एडेनोसाइन डी-मेथिओनिन डी ग्लूकोज-6-फॉस्फेट
adonitol allantoin Diethyl-dithiophosphate Diethyl-dithiophosphate
अल्फा-डी ग्लूकोज बीटा-phenylethylamine डीएल-ethionine डीएल-अल्फा-glycerophosphate
अल्फा-डी-लैक्टोज biuret ग्लूटाथिऑन पोटेशियम फास्फेट
अल्फा-डी-melebiose cytidine isethionic एसिड सोडियम पाइरोफॉस्फेट
साइट्रिक एसिड साइटोसिन एल cysteic एसिड सोडियम thiophosphate
डी-एलनाइन डी-एलनाइन एल Cysteine
डी-arabinose डी-asparagine एल djenkolic एसिड
डी-arabitol डी-aspartate एल मेथिओनिन
डी-asparagine डी-सिस्टीन मैग्नीशियम सल्फेट
डी-aspartate डी-glucosamine मीथेन सल्फोनिक एसिड
डी-cellubiose डी-glutamic एसिड एन एसिटाइल-डीएल-मेथिओनिन
डी-सिस्टीन डीएल-अल्फा-अमीनो-एन-butyric एसिड एन एसिटाइल-एल सिस्टीन
डी-फ्रुक्टोज डी-मेथिओनिन पोटेशियम टेट्रा-thionate डी-गैलेक्टोज डी-सेरीन सोडियम थायोसल्फ़ेट
डी-glucosamine डी-वेलिन sulfanic एसिड
डी ग्लूकोज गामा अमीनो-एन-butyric एसिड बैल की तरह
डी ग्लूकोज-6-फॉस्फेट ग्लाइसिन taurocholic एसिड
डी-ग्लूटामेट guanidine Thiourea
डी-mannose हिस्टामिन
डी-raffinose Inosine
D-ribose एल एलनाइन
डी-salicin एल arginine
डी-सेरीन एल asparagine
डी-trehalose एल citrulline
डी-सिलोज़ एल सिस्टीन
dulcitol एल glutamic एसिड
ग्लिसरॉल एल glutamine
ग्लाइसिन एल ग्लूटाथिऑन
मैं-Erythritol एल हिस्टडीन
Inosine एल isoleucine
एल एलनाइन एल Leucine
एल arabinose एल Lysine
एल arabitol एल मेथिओनिन
एल asparagine एल ओर्निथिन
एल aspartate एल-फिनाइल-एलनाइन
एल cysteic एसिड एल प्रोलाइन
एल सिस्टीन एल आतिशबाज़ी-glutamic एसिड
एल fucose एल सेरीन; एल threonine
एल glutamic एसिड एल tryptophan
एल glutamine एल वेलिन
एल isoleucine एन एसिटाइल-डी-glucosamine
एल Leucine प्यूटर्साइन
Thiourea
एल मेथिओनिन thymidine
एल फेनिलएलनिन थाइमिन
एल आतिशबाज़ी-glutamic एसिड tyramine
एल rhamnose टाइरोसीन
एल सेरीन uridine
एल sorbose
एल threonine
एल tryptophan
एल वेलिन
एल सिलोज़
लैक्टेट
lactulose
Malate
Myo-inositol
ऑक्सालिक एसिड
पोटेशियम सॉर्बेट
प्रोपियॉनिक अम्ल
प्यूटर्साइन
quinic एसिड
सोडियम पाइरूवेट
सोडियम succinate
सूक्रोज
thymidine
xylitol

एमएपी प्रयोगों में इस्तेमाल किया substrates की तालिका 2 की सूची।

Discussion

यहाँ, हम ख्यात फेज जीन की कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए phenomic दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। तकनीकों निगरानी मेजबान उपचय चयापचय में सक्षम एक विकसित परख में शामिल हैं, मल्टी फेनोटाइप परख प्लेट्स (एमएपीएस), catabolic चयापचय के प्रभाव को मापने में सक्षम metabolomics की स्थापना की विधि, के अलावा। हम उच्च throughput प्रोसेसिंग और विश्लेषण 24 के लिए अनुमति देता है, इन प्रौद्योगिकियों से उत्पन्न बड़े डेटा सेट के प्रबंधन के लिए अतिरिक्त उपकरण प्रदान की है। अन्त में, एक एनोटेट फेज कैप्सिड प्रोटीन, फेज thioredoxin, दो ख्यात चयापचय फेज जीन, और औसत प्रयोगात्मक प्रतिक्रिया की तुलना के माध्यम से हम प्ररूपी प्रवृत्तियों और outliers की पहचान की पहचान पर जोर देने के साथ, डेटासेट और जीन वर्गों दोनों की व्याख्या करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का प्रस्ताव।

उल्लेख किया है, दोनों तरीकों मात्रात्मक मेजबान चयापचय का केवल आधा उपाय। में से किसी के रिश्तेदार समारोह की व्याख्या करने के लिएजांच के तहत उपन्यास प्रोटीन, दोनों तरीकों से डेटा समारोह के प्रमाण उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक है। यह हमारे वर्तमान पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित नहीं है, प्रत्येक phenomic विधि से डेटा outputs ऐसी बेतरतीब जंगल और प्रमुख घटक विश्लेषण के रूप में क्लस्टरिंग तकनीक पर ध्यान केंद्रित है कि combinatory विश्लेषण के माध्यम से दिया जाता है। इसके अलावा, संयुक्त विश्लेषण से उत्पन्न परिकल्पना बाद में परंपरागत जेनेटिक तरीके से मान्य किया जाना चाहिए।

अंत में, विधियों भारी जीवाणु शरीर क्रिया विज्ञान से प्रभावित हैं और इसलिए एक ही मानकों का पालन कर रहे हैं प्रस्तुत किया। किसी भी विधि के उपक्रम करते हैं, विचारों के साथ प्रयोग कर रहे हैं, स्वतंत्र, क्लोनल समूहों को सुनिश्चित करने के लिए किए जाने की जरूरत है; संदूषण को रोका जाता है; एक एकल चर का परीक्षण किया जा रहा है; और उचित नियंत्रण एक साथ भाग गया जा रहा है। इन बिंदुओं के लिए खाते में विफलता के लिए किसी भी शारीरिक परख करने के लिए इसी तरह स्पष्ट नहीं परिणामों में परिणाम होगा।

मल्टी-फेनोटाइप परख प्लेटें(एमएपीएस)

नक्शे के विकास के लिए एक उच्च throughput और वर्तमान में उपलब्ध टेक्नोलॉजी (चित्रा 5 ए और टेबल्स 1,2) की तुलना में अनुकूलनीय परख प्रदान करता है। परख सभी सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध सामग्री, उपकरण, और बुनियादी तकनीकों का उपयोग करता है। बाद में डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइप लाइन का समावेश, PMAnalyzer 24, तेजी से डेटा की व्याख्या करता है। इसके अलावा, दृष्टिकोण के दोनों प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक पहलुओं को आसानी से समायोजित किया जा सकता है या इच्छित प्रयोजनों के लिए देखते। डेटा का एक बड़ा हिस्सा धारा 4 में उल्लिखित छानने पारित करने में विफल रहता है, तो उदाहरण के लिए, एक मैन्युअल रूप से मुद्दों की पहचान करने के लिए विकास घटता के माध्यम से झारना कर सकते हैं। समस्या कड़े फिल्टर मापदंडों के कारण पैदा होती है, तो स्क्रिप्ट के लिए समायोजन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, समस्याओं प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं (यानी, लंबे समय तक संक्षेपण; अनुचित बैक्टीरियल सेल के हस्तांतरणरास, आदि) तो अतिरिक्त प्रतिकृति आसानी से दोहराया जा सकता है।

क्यूवास एट अल। 24 में वर्णित है, PMAnalyzer एक जोड़नेवाला, स्वचालित पाइप लाइन के रूप में पार्स और विश्लेषण स्क्रिप्ट कार्यान्वित कि एक आवरण स्क्रिप्ट के रूप में लिखा एक भी पार्टी की योजना बनाई कार्यक्रम है। सभी लिपियों तीन प्रतियों डेटा भर में हर समय बिंदु के लिए औसत मूल्य लेने के द्वारा 25 पर एक git भंडार से स्वतंत्र रूप से सुलभ हैं, और बाद में समय अंतराल प्राप्त करने के लिए रसद वक्र, अधिकतम वृद्धि दर, asymptote, और एक उपन्यास अवधि, विकास स्तर parameterizes। औसत मूल्य के बड़े outliers के प्रभाव को कम करने के लिए हमारे अध्ययन में मतलब पर चुना गया था, हालांकि, स्क्रिप्ट आसानी से दोहराने के डेटा का मतलब है की गणना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कम भिन्नता को दोहराने के डेटा (2A चित्रा) के पार देखा (एसई) की वजह से हम एक रसद वक्र ढाले के लिए PMAnalyzer में मंझला के उपयोग को बनाए रखा। इसके अतिरिक्त, इस अध्ययन में विकास के लिए काट (जीएल ≥ 0.4) देते थीडेटा विकास का स्तर और अधिक से अधिक विकास दर को भर में अलग हो कैसे की तुलना द्वारा rmined (चित्रा 1 ए, बी)। इस की पुनर्व्याख्या की आवश्यकता होती है इस अवधि भिन्न हो सकते हैं इस्तेमाल उपकरणों और मॉडल प्रणाली के आधार पर मूल्य काट दिया।

हमारे परख का एक प्रमुख लाभ हम विकास लेवल (जीएल) के रूप में परिभाषित है, जो समग्र माइक्रोबियल विकास, निस्र्पक एक एकल पैरामीटर का उपयोग कर phenotypes तुलना करने की क्षमता है। जीएल एक हार्मोनिक मतलब है, और इसलिए डेटा में बड़े outliers के प्रभाव को कम। स्थानांतरित कर दिया रसद-सज्जित मूल्यों के साथ एक हार्मोनिक मतलब के उपयोग के विकास का एक सारांश परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से पर आ गया था प्रदान करने के लिए। अन्य पद्धतियों के विकास शामिल अंतर करने का प्रयास किया: इसे ले लिया समय विशिष्ट वक्र मानकों (आधा μ मैक्स, μ मैक्स, और ले जाने की क्षमता), दृढ़ संकल्प (2 आर) के गुणांक, और विशिष्ट वक्र मापदंडों से गुणा 2 आर के संयोजन तक पहुँचने के लिए। स्थानांतरित कर दिया साथ एक हार्मोनिक मतलब का प्रयोगजीएल के लिए रसद-फिट मूल्यों इस प्रकार यह पसंद की विधि बन गया है, विकास का मूल्यांकन करने में सबसे बड़ी सीमा प्रदान की है। नोट करने के लिए एक विचार गतिशील विकास वक्र पैटर्न एक पैरामीटर या एक फिट मॉडल का उपयोग करते समय खो दिया जा रहा है की क्षमता है। उदाहरण के लिए, रसद की अवस्था और जीएल की व्यक्तिगत वक्र मापदंडों Biphasic वृद्धि का प्रतिनिधित्व करने के काबिल नहीं हैं। एक भी कार्बन वातावरण में, विकास पर इस आशय सब्सट्रेट उपयोग में सब्सट्रेट या बदलाव की या तो रूपांतरण पर वायरल प्रोटीन की मध्यस्थता निकलता है। कई विकास मापदंडों पर विचार नहीं जब संभावित खो अतिरिक्त प्रभाव शामिल हैं: लंबे समय तक समय अंतराल, वायरल मशीनरी या उत्पादों का एक बढ़ा बोझ प्रस्ताव; तेजी से ऊर्जा उत्पादन के रास्ते की मेजबानी करने के लिए मिलकर वायरल प्रोटीन, सुझाव घातीय चरण में तेजी; मेजबान पोषक तत्व तेज और उपचय में वायरल समर्थन जिसका अर्थ बायोमास गठन की या उच्च स्तर, (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, (नवजात विकास घटता साजिश रचने

नक्शे में संरचनात्मक और चयापचय जीन द्वारा योगदान अलग प्रतिक्रियाओं पर विचार कर, यह प्रश्न में अलग सब्सट्रेट कक्षाओं प्रोटीन समारोह के लिए सबसे बड़ा सबूत है कि उपलब्ध कराने मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, चयापचय प्रोटीन अक्सर केंद्रीय चयापचय 16,32 की मेजबानी के लिए unspecific हैं जो सीमित पोषक तत्वों, के अधिग्रहण के साथ जुड़े रहे हैं। प्रारंभिक एमएपी प्रयोगों केंद्रीय चयापचय कार्बन स्रोतों (2A चित्रा) पर हो जब ख्यात चयापचय फेज जीन को शरण देने के क्लोन एक बढ़ा अंतराल चरण है कि पता चलता है। इसके विपरीत, मेजबान ऊर्जा और dNTP पूल के बड़े अनुपात की आवश्यकता होती है जो ख्यात संरचनात्मक जीन, ले जाने के क्लोन फीसदी के लिए विकास पर एक झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया में परिणामRAL और अमीनो एसिड चयापचय कार्बन substrates के। (नहीं दिखाया 2A चित्रा और डेटा) माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया, क्योंकि यह कारण मेजबान filamentation और / या शामिल किए जाने के शरीर में जिसके परिणामस्वरूप अघुलनशील प्रोटीन का संचय करने की संभावना है। आगे के विश्लेषण के इन प्रारंभिक परिणामों को मान्य करने के लिए आवश्यक है, वहीं, नक्शे विशिष्ट फेज जीन वर्गों के कार्यों धारणा के लिए सहसंबंधी कि प्ररूपी प्रतिक्रियाओं को पुन: प्राप्त करने में सक्षम हैं।

अज्ञात वायरल प्रोटीन की व्याख्या करने के लिए इसके अलावा, नक्शे के एक व्यक्ति के जीवाणु के कार्यात्मक और चयापचय विविधता या बैक्टीरिया के एक समुदाय की जांच के लिए एक उपन्यास संसाधन हैं। एमएपी घटकों बैक्टीरिया की एक श्रृंखला के विकास का समर्थन करने के लिए आसान परिवर्तन के लिए तैयार कर रहे हैं; समुद्री, auxotrophic, और anaerobic रोगाणुओं भी शामिल है। एक अलग बैक्टीरियल जीनस नक्शे में समर्थन किया जा सकता से पहले परिभाषित बेसल और पूर्व विकास मीडिया अतिरिक्त या समायोजित रासायनिक प्रजातियों की आवश्यकता होती है इन प्रयासों में मदद करने के लिए।नक्शे के इस प्रयोग में एक नोट में इस तरह के tryptone, खमीर निकालने और peptone के रूप में सामग्री के उपयोग पर रोक लगाने, परिभाषित मीडिया को बनाए रखने के लिए है।

Metabolomics

metabolomics के क्षेत्र मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की पृथक चयापचयों में शामिल हैं जो मेटाबोलाइट डेटाबेस, पर निर्भर है। यहाँ चुना कोर सुविधा का सबसे बड़ा metabolomics डेटाबेस में से एक है। दूसरों से पहले हमारे मेजबान में दर्ज नहीं किया गया था, जबकि दिलचस्प बात यह है कि हमारे experimentations से उत्पन्न चयापचयों के आधे से अधिक, (~ 65%) पहचानने योग्य थे, Escherichia कोलाई (उदाहरणों में शामिल हैं: इण्डोल 3 एसिटिक एसिड 33, चिरायता एसिड 34, और dihydroabietic एसिड 35)। इस तथ्य को संयंत्र चयापचयों, या जांच के तहत विशिष्ट प्रोटीन की ओर डेटाबेस की एक मजबूत पूर्वाग्रह या तो के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। भले ही, परिणाम डेटा प्रतिनिधित्व और विश्लेषण के लिए उपलब्ध जाना जाता चयापचयों की एक सीमित संख्या है। फू मेंसंरचना, विभिन्न डेटाबेस का उपयोग कर कई metabolomics तरीकों का अधिक से अधिक मेटाबोलाइट कवरेज के लिए अनुमति होगी।

वर्तमान में, दोनों में जाना जाता है और तुलना की है और हमारे उपन्यास वायरल प्रोटीन विषम जब अज्ञात चयापचयों किया जाता है। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम कार्यात्मक इसी तरह प्रोटीन को शरण देने के क्लोन उनकी पूरी metabolomic प्रोफ़ाइल में एक वृद्धि की समानता का हिस्सा होगा कि परिकल्पना। प्रारंभिक metabolomics विश्लेषण संरचनात्मक और चयापचय जीन स्पष्ट रूप से एक दूसरे से अलग नहीं है, जबकि चित्रा (6) सहसंबंधी है overexpressed, जब उन जीनों मेजबान पर समान प्रभाव का प्रदर्शन करते हैं कि पता चला। उदाहरण के लिए, बारीकी से ख्यात चयापचय जीन के साथ एनोटेट Capsid जीन समूहों इस अध्ययन, EDT2440 और EDT2441 में प्रकाश डाला। एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध ट्रांसमेम्ब्रेन टोपोलॉजी और संकेत पेप्टाइड भविष्यवक्ता प्रोग्राम का उपयोग कर जांच दोनों ख्यात चयापचय जीन एक भी ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन बंदरगाह कि सबूत से पता चला है। दिलचस्प बात यह 5 वीं से बाहर(सबसे dendrogram के हिस्से को छोड़ दिया है) पहली क्लस्टर समूह में ई 9 क्लोन एक ही टोपोलॉजी प्रोग्राम का उपयोग कर ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के भविष्यवाणी की है। आगे की जांच की जरूरत है, हालांकि, यह इन क्लोन की overexpression के दौरान उपस्थित चयापचयों झिल्ली या संरचनात्मक बोझ से उत्पन्न सेलुलर तनाव की प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं की संभावना है। यह सबूत metabolomics डेटा शोर की वृद्धि हुई राशि के पास है, जबकि विधि के भीतर और एक जीन वर्ग में दोनों जीनों के सामान्य प्रभाव, को अलग संकेत है कि प्रकाश डाला करने में सक्षम है कि समर्थन करता है। विधि जीन समारोह के विशिष्ट जानकारी बाहर निकालने में सक्षम है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए, चयापचयों विशिष्ट चयापचय मार्ग में बांटा गया था। एक क्लोन एक भी मार्ग के लिए विशिष्ट चयापचयों को प्रभावित करता है अगर परिकल्पना जा रहा है, तो overexpressed जीन कि मार्ग में सक्रिय है। हमारे metabolomics गुणवत्ता आश्वासन पाइप लाइन की स्थापना करने से पहले, प्रारंभिक आंकड़ों एक ओवर में पता चला किडी underrepresented चयापचयों वे के साथ जुड़े रहे हैं रास्ते पर बहुत कम जानकारी उपलब्ध कराने, आम तौर पर "अज्ञात" थे (डेटा) नहीं दिखाया। Preprocessed metabolomics डेटा, हालांकि, मेटाबोलाइट प्रोफाइल के बहुमत के समान हैं और केवल अज्ञात और ज्ञात मेटाबोलाइट abundances की संख्या चुनें उदाहरण प्यूटर्साइन और uracil (चित्रा 6) के लिए, क्लोन भर में भिन्न है कि पता चलता है। प्रोटीन समारोह के प्रयासों का अधिक से अधिक संकल्प प्रदान करने के लिए प्रयोगात्मक कार्यात्मक लक्षण वर्णन के आधार मेटाबोलाइट की 'छेद' में भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो जाना जाता फेज जीन, के खिलाफ उपन्यास फेज जीन तुलना करने के लिए किए जा रहे हैं। इस तकनीक का उपयोग करना, ज्ञात वायरल जीनों की सौंपा समारोह अज्ञात जीन के समारोह के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है। बहरहाल, metabolomic विश्लेषण के सीमित कारक डेटाबेस का आकार और प्रासंगिकता है। इस शोध से संबंधित metabolomic डेटाबेस विकसित करने की आवश्यकता है कि इन सीमाओं, के लिए सही करने के लिए; ऐसा की ASKA संग्रह के लिए विशिष्ट चयापचयों का डेटाबेस और उनके abundances के रूप में कोलाई क्लोन जिसमें एक ओआरएफ 36 overexpressed है। Lawerence बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला में शोधकर्ताओं मॉडल बैक्टीरिया 37 के पूरे उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के लिए विशिष्ट चयापचयों के पहले व्यापक डेटाबेस संकलित जब इस तरह के डेटाबेस की जरूरत के लिए साक्ष्य 2013 में प्रदान किया गया। इस शोध phenotype और जीनोटाइप के बीच स्पष्ट संबंध का खुलासा, विशिष्ट चयापचयों के उपयोग के लिए आवश्यक जीन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

एक उपकरण के रूप में metabolomics पर विचार कर, यह प्रसंस्करण शासन कोर सुविधा पर पीछा परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की एक विरूपण साक्ष्य उपयोग के उपकरणों के साथ जुड़े दिन के लिए दिन के विचरण है। तिथि करने के लिए सभी जीसी एमएस विश्लेषण प्रत्येक विश्लेषणात्मक रन में शामिल हैं जो आंतरिक मानकों के प्रयोग को लागू; हालांकि, इस परियोजना विशिष्ट आंतरिक नमूने के अलावा </ Em> के प्रयोग के प्रत्येक दिन के अतिरिक्त विचरण को हटा भाग गया। इन विचारों को सामान्य बनाने की समस्याओं और पूर्वाग्रहों से बचने के लिए जल्दी संबोधित किया जाना चाहिए। एक अन्य समाधान एक ही मशीन पर एक कोर की सुविधा में और एक ही बैच, कोई कोर सुविधा पर उपलब्ध एक विकल्प के रूप में सभी के नमूने संसाधित करने के लिए है।

विभिन्न उपकरणों दोनों शुरू की है और उपन्यास स्क्रीन और कार्यात्मक अज्ञात फेज जीन चिह्नित करने के लिए साधन उपलब्ध कराने के लिए इस पांडुलिपि में फिर से पता लगाया। कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के कारगर बनाने के उपयोग के साथ प्रयोगात्मक तकनीक की सादगी और अनुकूलन क्षमता इन तरीकों अनुसंधान प्रयासों और क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं आश्वासन दिया। हमारा लक्ष्य यहाँ प्रस्तुत phenomic दृष्टिकोण समान रूप से कार्यात्मक अपरिभाषित हैं कि सिस्टम के अलावा उपन्यास फेज प्रोटीन की आगे की जांच में सहायता करेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

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