परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और समर्थित लिपिड bilayers के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) एक बहुत तेज टिप 1 के साथ एक ब्रैकट का उपयोग कर नमूने की एक क्षेत्र भर में स्कैनिंग द्वारा एक सतह की एक छवि उत्पन्न करता है। ब्रैकट के आंदोलन के नमूने की सतह टोपोलॉजी को जांचता है। तरल 2-5 में हवा या पास देशी राज्य में तय नमूनों का विश्लेषण में अपनी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, प्रोटीन, डीएनए, और झिल्ली सहित - AFM के लिए व्यापक रूप से जैविक अणुओं के लिए लागू किया गया है।

इसके अलावा नैनोमीटर रेंज में अपने उच्च संकल्प इमेजिंग क्षमता से, AFM ब्रैकट बातचीत बल (आसंजन और प्रतिकर्षण) और नमूना 5,6 के यांत्रिक गुणों की जांच के लिए एक वसंत के रूप में कार्य करता है। इस बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में जाना जाता है। इस मोड में, जांच के पहले यह नमूना (चित्रा 1 ए) के साथ संपर्क खो देता है जब तक फिर मुकर गया है, नमूना दृष्टिकोण और उस पर एक बल डाल रही है। उत्पन्न घटता एप्लिकेशन दोनों के लिए ब्रैकट की दूरी के एक समारोह के रूप में बल दिखानेएक प्रकार की मछली और त्याग। लोचदार मापांक सहित कई गुण एक सामग्री की कठोरता को मापने के लिए, और आसंजन बलों प्राप्त किया जा सकता है।

समर्थित लिपिड bilayers एक ठोस समर्थन के शीर्ष पर झूठ बोल जैविक मॉडल झिल्ली हैं - आम तौर पर अभ्रक, borosilicate ग्लास, सिलिका, या सिलिकॉन 7 ऑक्सीकरण। वे पुटिका बयान की तरह विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं, Langmuir-Blodgett विधि और 8,9 स्पिन कोटिंग। AFM इमेजिंग इन समर्थित bilayers 10 के गठन का पालन करें, और विभिन्न रचनाओं 11-15 की झिल्ली द्वारा गठित विभिन्न संरचनाओं की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है।

दृष्टिकोण की अवस्था में एक चोटी में समर्थित bilayers परिणामों पर बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन। इस शिखर बाईलेयर बेध करने के लिए आवश्यक बल को इंगित करता है, और सफलता के बल कहा जाता है। बाईलेयर मोटाई भी बल वक्र 6 का उपयोग करके मापा जा सकता है। bilayers के विशिष्ट सफलता बल1-50 के बीच सीमा एन 6। इन गुणों के लिपिड पैकिंग (तरल या जेल चरण) और संरचना (एसाइल श्रृंखला लंबाई और unsaturation की डिग्री) और झिल्ली सक्रिय एजेंटों 16 द्वारा बदल पर निर्भर करते हैं। टूटना पीछे सिद्धांत 17 समझाया गया है और इस तरह के ब्रैकट कोमलता, टिप त्रिज्या और दृष्टिकोण गति के रूप में अन्य प्रयोगात्मक मानकों को भी सफलता बल 15,16,18 प्रभावित करते हैं। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी झिल्ली 21 की स्थिरता पर, विभिन्न लिपिड चरणों 11,19, पेप्टाइड्स की तरह संरचना पर निर्भर परिवर्तन 12,20, साथ ही अन्य biomolecules के प्रभाव, के गुणों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

समर्थित bilayers के फ्लैट अभिविन्यास बेहतर संरचना और झिल्ली के गुणों को चिह्नित करने के लिए इस तरह की सतह plasmon अनुनाद 22 और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 11,19 के रूप में अन्य तरीकों के साथ AFM के संयोजन के लिए लाभदायक है।

इस विस्तृत वीडियो आद्यकर्नल पुटिका बयान का उपयोग कर समर्थित लिपिड bilayers तैयार करने और AFM और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ उनका विश्लेषण करने का इरादा है। विभिन्न आकारों की पुटिकाओं bilayers तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल के छोटे और बड़े unilamellar पुटिकाओं पर केंद्रित है। चरण तरल का आदेश दिया (एल ओ) और तरल अव्यवस्थित (एल डी) चरणों में अलग समर्थन किया है कि bilayers 11,15 विशेषता थे। : 2: 1 के अनुपात झिल्ली 2 में डि-oleoyl-Phosphatidylcholine (DOPC), sphingomyelin (एस), और कोलेस्ट्रॉल (चोल) से बना है। इस रचना मॉडल प्रोटीन की तस्करी और छँटाई, कोशिका संकेतन और अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं 23,24 के लिए महत्वपूर्ण प्लेटफॉर्म के रूप में व्यवहार करने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं जो लिपिड राफ्ट,।

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Protocol

समर्थित लिपिड bilayers 1. तैयारी (SLB) 11,12,21

  1. लिपिड मिश्रण और Multilamellar पुटिका निलंबन की तैयारी
    1. पहले से निम्नलिखित बफ़र्स तैयार करें।
      1. 2.7 मिमी KCl, की सांद्रता में पीबीएस बफर तैयार 1.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 8 मिमी ना 2 HPO 4, और 137 मिमी NaCl, पीएच 7.2।
      2. 150 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.4 की सांद्रता में SLB (समर्थित लिपिड bilayer) बफर तैयार करें।
      3. 1 एम 2 CaCl के समाधान तैयार है।
    2. एक वांछित एकाग्रता में क्लोरोफॉर्म में निम्नलिखित लिपिड भंग: उदाहरण के लिए, DI-oleoyl-Phosphatidylcholine 10 मिलीग्राम / एमएल पर 25 मिलीग्राम / एमएल और कोलेस्ट्रॉल (चोल) में 25 मिलीग्राम / एमएल, sphingomyelin (एस) पर (DOPC)।
    3. : 2: 1 DOPC: एसएम: चोल दाढ़ अनुपात एक 2 में कुल लिपिड के 1 मिलीग्राम के साथ एक समाधान बनाने के लिए DOPC के 18.38 μl, एसएम के 17.10 μl और चोल के 11.30 μl ले लो। Conce के आधार पर तदनुसार संस्करणों वैरी1.1.2 में तैयार लिपिड ntrations। : 2: 1 DOPC: एसएम: चोल, झिल्ली 25 के चरण विशेषताओं बदल जाएगा दाढ़ अनुपात बदलने के रूप में हालांकि, 2 पर दाढ़ अनुपात को बनाए रखने।
    4. Vortexing द्वारा पूरी तरह से समाधान मिलाएं। एक एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा बाईलेयर कल्पना करने के लिए चाहता है तो 0.05 मोल% से कम एक फ्लोरोसेंट lipídic डाई जोड़ें।
      नोट: लंबी श्रृंखला dialkylcarbocyanines के परिवार की तरह किया, DiI और डियो तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला अवधि और आदर्श लिपिड झिल्ली लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, rhodamine-phosphatidylethanolamine या BODIPY-कोलेस्ट्रॉल की तरह fluorescently लेबल लिपिड, इस्तेमाल किया जा सकता है। किसी भी मामले में, डाई की एकाग्रता लिपिड के लिए बाध्य फ्लोरोफोरे की उच्च सांद्रता लिपिड व्यवहार 19 को बदल सकते हैं कि ध्यान में रखते हुए, माइक्रोस्कोपी सेटिंग के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    5. एन 2 गैस का उपयोग क्लोरोफॉर्म (या किसी भी उपलब्ध अक्रिय गैस ऐसे एर के रूप में और वह) बंद सूखी।
    6. इसके अलावा ड्राई टीवह कम से कम 1 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत मिश्रण लिपिड।
      नोट: इस लिपिड मिश्रण के भंडारण, तो अक्रिय गैस के साथ (एन 2, अर या वह) हवा शुद्ध और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। छोटे भूरे शीशियों में अतिरिक्त लिपिड में क्लोरोफॉर्म विभाज्य। -20 डिग्री सेल्सियस पर अक्रिय गैस के साथ (एन 2, अर या वह) और दुकान हवा विस्थापित, लिपिड मिश्रण के रूप में एक समान तरीके से उन्हें सूखी।
    7. 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए पीबीएस बफर में सूखे लिपिड भंग।
    8. भंवर 1 मिनट के बारे में 20 सेकंड के लिए सख्ती मिश्रण multilamellar पुटिकाओं युक्त, एक बादल निलंबन पाने के लिए। शीशी के पक्षों को चिपका कोई लिपिड फिल्मों रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
    9. 10 μl aliquots (लिपिड की 1 मिलीग्राम 10 aliquots बनाता है) में इस निलंबन को वितरित करें।
    10. आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. Unilamellar vesicles की तैयारी
    नोट: unilamellar vesicles के विभिन्न आकारों में sonication के विधि या बाहर निकालना विधि का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है। Sonication एस का उपयोग करता हैound ऊर्जा मिश्रण आंदोलन और multilamellar निलंबन की परतों को अलग करने के लिए। यह धुंधला निलंबन के समाशोधन ने संकेत दिया है। बाहर निकालना एक निश्चित छेद के आकार के साथ एक झिल्ली फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए multilamellar पुटिकाओं मजबूर करता है।
    1. Sonication विधि
      1. Multilamellar लिपिड निलंबन के 10 μl ले लो और SLB बफर के 150 μl जोड़ें।
      2. छोटे (2 मिलीलीटर) छाया हुआ कांच की शीशियों में मिश्रण स्थानांतरण और Parafilm के साथ सील।
      3. 10 मिनट के लिए या यह (व्यास में 50 एनएम से नीचे, एसयूवी) छोटे unilamellar पुटिकाओं उपज के लिए स्पष्ट हो जाता है जब तक एक स्नान sonicator में कमरे के तापमान पर मिश्रण Sonicate।
    2. बाहर निकालना विधि
      1. Multilamellar लिपिड निलंबन के 10 μl ले लो और SLB बफर के 150 μl जोड़ें।
      2. एक क्रायोजेनिक ट्यूब में निलंबन स्थानांतरण।
      3. तरल नाइट्रोजन में कुछ सेकंड के लिए क्रायोजेनिक ट्यूब जलमग्न द्वारा लिपिड निलंबन रुक।
      4. पिघलनाकुछ मिनट के लिए एक पानी कमरे के तापमान पर स्नान या 37 डिग्री सेल्सियस में क्रायोजेनिक ट्यूब जलमग्न द्वारा लिपिड निलंबन। फ्रीज पिघलना चरणों में कम से कम 10 बार दोहराएँ।
      5. लिपिड निलंबन हटा देना करने के लिए, 200 एनएम ताकना आकार के साथ एक polycarbonate झिल्ली का उपयोग करें और एक वाणिज्यिक बाहर निकालना डिवाइस 26 (अन्य रोमकूप आकार, 100 एनएम या 400 एनएम की तरह उपलब्ध हैं)।
        नोट: वर्तमान में, दो extruder के उपकरणों के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होते हैं: एक पुस्तिका extruder के छोटे संस्करणों (कुछ मिलीलीटर के लिए 200 μl) के लिए उपलब्ध है। इस मामले में, नमूना मैन्युअल रूप से दो सीरिंज के बीच आगे और पीछे के निलंबन को धक्का देकर झिल्ली के माध्यम से extruded है। निर्माता पर निर्भर करता है, लिपिड aliquots के सेट अप की न्यूनतम मात्रा तक पहुँचने के लिए जोड़ा जा करने की आवश्यकता होगी। बड़ा संस्करणों के लिए (अप करने के लिए 50 मिलीलीटर) और अधिक परिष्कृत उपकरणों का उपयोग किया जाता है, जिसमें निलंबन संकुचित गैस का उपयोग करके पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से मजबूर है। सेट अप और बाहर निकालना शर्तों आधुनिक विपणन के अनुसार बदल सकते हैंएल। उपयोग करने से पहले निर्माता से निर्देश का संदर्भ लें। इस प्रोटोकॉल छोटे संस्करणों के लिए मैनुअल extruder के लिए संदर्भित करता है।
      6. Extruder के माध्यम से पानी गुजर रहा पानी में extruder के संतुलित करना। पानी में झिल्ली विसर्जित कर दिया।
      7. , दो पिस्टन के बीच झिल्ली प्लेस डिवाइस को इकट्ठा करने और एक सिरिंज से दूसरे के लिए, extruder के माध्यम से बफर से गुजर रहा, बफर में संतुलित। यह कदम इसके अतिरिक्त प्रणाली की leakiness परीक्षण की अनुमति देता। यह लीक हो, तो अलग करना और इसे फिर से झिल्ली को बदलने पुनः।
      8. Extruder के एक सिरिंज ('गंदा ओर') का उपयोग लिपिड निलंबन ले लो।
      9. एक कक्ष पर लिपिड निलंबन और विरोध कक्ष पर खाली सिरिंज युक्त सिरिंज संलग्न।
      10. एक छोर पर सिरिंज पुश। झिल्ली के माध्यम से और विरोध सिरिंज में समाधान गुजरती हैं। यह 1 सेंट पास है।
      11. 31 बार इस तरह की कुल के लिए झिल्ली के माध्यम से पारितसमाधान विरोध सिरिंज ('स्वच्छ ओर') पर समाप्त होता है।
        नोट: extruding के बाद झिल्ली की जाँच करें। यह टूट गया है, तो बाहर निकालना प्रक्रिया सफल नहीं रहा था और बार-बार जाने की जरूरत है।
      12. एक छोटी ट्यूब में सिरिंज खाली। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा यदि बड़े unilamellar पुटिकाओं (luvs) 1-2 दिनों के लिए स्थिर रहे हैं।
  3. मीका और Coverslips की तैयारी
    1. धो इथेनॉल में पहली बार पानी में और फिर coverslips। वायु शुष्क।
    2. मीका डिस्क ले लो और चिपकने वाला टेप का उपयोग बाहरी परत छील।
    3. Coverslip पर मीका डिस्क संलग्न। एक एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी साथ bilayers जांच कर सकते हैं कि इतना पारदर्शी ऑप्टिकल glues के इष्टतम है।
    4. ऑप्टिकल गोंद / तेल का उपयोग कर प्लास्टिक सिलेंडरों (2.5 सेमी बाहरी व्यास, 2 सेमी भीतरी व्यास, और 0.5 सेमी ऊंचाई) देते हैं। सब कुछ बंद है कि और कोई लीक कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। वे आसानी वें से अलग किया जा सकता है के रूप में सिलेंडरों का फिर से उपयोग करने के लिए इच्छुक है, जब तेल का प्रयोग करेंई coverslip और धोया। प्लास्टिक सिलेंडरों के आयामों की AFM ब्रैकट धारक के आकार पर निर्भर करते हैं और उसी के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. ठोस समर्थन पर unilamellar vesicles के बयान
    1. Pipet मीका पर सीधे पूरे liposome समाधान। 300 μl की एक मात्रा तक पहुँचने के लिए और अधिक SLB बफर जोड़ें।
    2. 3 मिमी सीए 2 + के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 1 एम कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 0.9 μl जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए और फिर कम से कम 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। हमेशा बफर के साथ bilayers को कवर किया। हवा और हवा के बुलबुले के साथ संपर्क में इसे नष्ट कर देगा। यदि आवश्यक हो तो ऊष्मायन के दौरान, उच्च तापमान पर incubating है, खासकर अगर अधिक बफर जोड़ें।
      नोट: ऊष्मायन तापमान की आवश्यकता लिपिड मिश्रण और चरणों के अनुसार बदलती हैं। कम से कम 10 मिनट की ऊष्मायन समय समर्थित bilayers फार्म की जरूरत है, लेकिन यह तापमान और संरचना पर निर्भर करता है, लंबे समय तक हो सकता है।
    4. धुलाईगर्म (65 डिग्री सेल्सियस) के साथ दोहरी परत SLB बफर 15-20 गुना कैल्शियम और unfused पुटिकाओं दूर करने के लिए। बफर के तहत बाईलेयर रखने के लिए वाशिंग चरणों के दौरान अतिरिक्त ख्याल रखना और धीरे बाईलेयर को नष्ट करने से बचने के लिए धोने के समाधान pipet।
    5. AFM के माप से पहले कमरे के तापमान को शांत समर्थित bilayers। यह झिल्ली के विभिन्न चरणों के फार्म के रूप में अच्छी तरह से साधन में थर्मल बहाव को कम करने की जरूरत है।

2. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी माप 11,12

  1. इमेजिंग
    नोट: संपर्क मोड या मोड दोहन में परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। समाधान में छवि समर्थित bilayers; इस bilayers को नष्ट कर देगा के रूप में समाधान पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति नहीं है। एक बफर के साथ काम किया जाएगा के रूप में, किसी भी AFM के हिस्सा तरल फैल से सुरक्षित है यह सुनिश्चित करें कि बनाने में सुरक्षा सावधानियों का पालन करें।
    1. एक नरम ब्रैकट का चयन करें (0.2 एन / मी लगातार वसंत की सलाह दी है नीचे) और टी करने के लिए इसे माउंटवह AFM के। ब्रैकट कठोरता के चुनाव को बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए और अधिक महत्वपूर्ण है (और इस पर बाद में चर्चा की जाएगी)।
    2. AFM के मंच पर नमूना पर्वत और सभी कंपन अलगाव मॉड्यूल पर बदल रहे हैं कि सुनिश्चित करें। संतुलित करना और इस प्रणाली के थर्मल बहाव को कम करने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। AFM के सेट-अप पर निर्भर करता है, ट्यूनिंग और इमेजिंग विनिर्देशों भिन्न हो सकते हैं। निर्माता की हैंडबुक परामर्श करें।
    3. संपर्क तक AFM टिप के साथ नमूना दृष्टिकोण।
    4. लिपिड bilayers आमतौर पर ऊंचाई में 4 समुद्री मील दूर कर रहे हैं, (उदाहरण के 1.5 माइक्रोन के लिए) उच्चतम Z संकल्प दे देंगे कि साधन की जेड श्रेणी का उपयोग करें।
    5. छवि के लिए एक क्षेत्र का चयन करें। लिपिड bilayer के एक सिंहावलोकन, एक्स 25 माइक्रोन क्षेत्र छवि के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हो जाएगा एक 50 माइक्रोन एक्स 50 माइक्रोन या 25 माइक्रोन पाने के लिए। छोटे सुविधाओं दिखाई देते हैं, छोटे क्षेत्रों में एक छवि (10 माइक्रोन एक्स 10 माइक्रोन, या 2 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन)। इमेजिंग क्षेत्र का चुनाव भी काम कर रहे आर पर निर्भर करता हैपीजोइलेक्ट्रिक स्कैनर की Ange। इस के लिए साधन का मार्गदर्शन से परामर्श करें।
    6. Bilayers बहुत ही कमजोर हैं, नमूने के साथ संपर्क बनाए रखते हुए, थर्मल बहाव के लिए कम से कम बल और सही रखने के लिए इमेजिंग के दौरान AFM टिप के सेट बिंदु को समायोजित। संपर्क मोड में, सेट बिंदु कम से कम। मोड दोहन में, सेट बिंदु को अधिकतम।
    7. बहुपद समतल कार्य करने के लिए प्रत्येक स्कैन लाइन फिटिंग द्वारा प्रक्रिया छवियों। AFM के विनिर्माण कंपनी के मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर झिल्ली के साथ संपर्क खो कि स्कैन के लिए लाइन हटाने प्रदर्शन।
  2. बल स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार निर्देशों का पालन ब्रैकट जांचना। कैलिब्रेशन photodiodes बल (चित्रा 1 बी) के बिजली के संकेत के रूपांतरण की अनुमति देता है।
      1. वोल्ट में टिप की संवेदनशीलता (लंबाई की इकाइयों में) Z-पीजो आंदोलन के रूप में नीचे को झुकाव को मापने के लिए के बजाय बिजली के संकेत जांचना।
      2. आमतौर पर AFM के सॉफ्टवेयर में शामिल थर्मल शोर आवृत्ति विधि का उपयोग कर, ब्रैकट निरंतर वसंत की गणना। इस विधि में, एक शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व की साजिश बनाने, दोलन की आवृत्ति को सम्मान के साथ शोर से कंपन के आयाम साजिश है। इस साजिश अनुनाद आवृत्ति के चारों ओर एक चोटी दिखाई देंगे। आवृत्ति जहां आयाम मैंसबसे बड़ी है अनुनाद आवृत्ति है। स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के द्वारा लगातार वसंत की गणना करने के चोटी के चारों ओर एक Lorentzian समारोह फ़िट। थर्मल शोर विधि के सिद्धांत के लिए कुछ उपयोगी संसाधन सन्दर्भ 27-30 में दिए गए हैं।
    2. बाईलेयर के एक क्षेत्र इमेजिंग के बाद, बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए दोहरी परत में एक 5 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन क्षेत्र का चयन करें।
    3. यह उस क्षेत्र की एक 16 x 16 ग्रिड में बल घटता लेता है तो यह है कि AFM के सेट करें। इस क्षेत्र में प्रति 256 बल घटता में यह परिणाम है। दो पड़ोसी अंक के बीच अंतरिक्ष झिल्ली क्षेत्र अगले अंक के साथ मेल खाना होगा एक बिंदु के द्वारा जांच की जा रही है कि बचने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। इस टिप त्रिज्या पर निर्भर है। दो अंक के बीच एक 100 एनएम दूरी आदर्श होगा। 16 एक्स 16 ग्रिड में 5 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन क्षेत्र फूट डालो। चरण के आकार पर निर्भर करता है, एक छोटे से एक या बड़ा क्षेत्र का चयन करें, और फिर उसके अनुसार ग्रिड आकार समायोजित कर सकते हैं।
    4. सेट करने के लिए Z-पीजो विस्थापन400 एनएम। इस Z-पीजो के आंदोलन की अधिकतम सीमा निर्धारित करता है। यह ब्रैकट पूरी तरह से माप के बीच में नमूना से दूर मुकर गया है कि सुनिश्चित करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए।
    5. 800 एनएम / सेक करने के लिए दृष्टिकोण गति सेट और 200 एनएम / सेकंड की गति को वापस लेना। बाईलेयर संरचना और लिपिड चरण 6,16 अध्ययन किया जा आधार पर 6000 एनएम / सेक करने के लिए 400 के बीच एक दृष्टिकोण गति का प्रयोग करें।
    6. सभी मापदंडों को स्थापित करने के बाद, AFM के सॉफ्टवेयर की "रन" बटन दबाने से, बल घटता अधिग्रहण।
    7. ऊंचाई से घटता बनाम शक्ति के रूप में बल घटता (Z-पीजो आंदोलन का एक उपाय) को बचाओ। ऐसा तब है जब नमूने के साथ संपर्क में खाते में ब्रैकट के झुकने नहीं ले करता है। डाटा प्रोसेसिंग चरण के दौरान, AFM के सॉफ्टवेयर बाईलेयर मोटाई के लिए उचित मूल्यों दे देंगे जो टिप नमूना जुदाई घटता (चित्रा 1C), बनाम बल प्राप्त करने के लिए झुकने ब्रैकट के लिए सुधार की अनुमति देता है। सुधार मूल्यों आमतौर पर calibr में शामिल कर रहे हैंप्रत्येक बल की अवस्था के साथ सहेजा जाता है, जो व्यावहारिक,। एक भी बिंदु पर पीजो आंदोलन से खड़ी विक्षेपन घटाकर की टिप-नमूना जुदाई की गणना।
      नोट: दृष्टिकोण बल की अवस्था में चोटी (बल मूल्य नीचे ब्रैकट आंदोलन दृष्टिकोण चक्र पर अब भी है, भले ही चला जाता है) झिल्ली की सफलता बल है, जबकि इस चोटी की स्थिति और बिंदु की स्थिति के बीच का अंतर बल उठ शुरू होता है, जहां फिर से झिल्ली की मोटाई प्रदान करता है।
    8. अच्छे आंकड़े प्राप्त करने के लिए हर हालत के लिए कम से कम 500 बल घटता मोल। उत्पत्ति या Matlab जैसे कार्यक्रमों का उपयोग कर मूल्यों का एक हिस्टोग्राम साजिश है, और वितरण के शिखर और चौड़ाई पाने के लिए एक गाऊसी वितरण के लिए histograms फिट बैठते हैं।

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Representative Results

DOPC से बना समर्थित लिपिड bilayers: एसएम: चोल (2: 2: 1) AFM के में imaged थे (चित्रा 2 एसी)। क्योंकि लिपिड रचना की, एसएम / चोल अमीर एल और DOPC अमीर एल डी चरणों मनाया गया। AFM इमेजिंग से ऊंचाई प्रोफाइल झिल्ली संरचना पर महत्वपूर्ण जानकारी दे सकता है। ऊंचाई प्रोफाइल को देखकर, बाईलेयर मोटाई प्रदान किया जा सकता झिल्ली (चित्रा 2 बी), या एल / एल डी चरणों के बीच ऊंचाई में अंतर में दोष की उपस्थिति में मापा जा सकता है। इसके अलावा, AFM के लिए विशेष रूप से चयन करें इन चरणों का प्रतिनिधित्व क्षेत्रों और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (- एफ चित्रा 2 डी) का उपयोग कर अपने यांत्रिक गुणों का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी मोड से व्युत्पन्न बल घटता बल की अवस्था (चित्रा 2 डी और ई) के शिखर पर बल मूल्य खोजने के द्वारा सफलता बल को मापने के लिए इस्तेमाल किया, और membr रहे हैंदूरी मूल्य के लिए बल की अवस्था के शिखर से दूरी मूल्य को घटाकर की ane मोटाई बल वक्र फिर से (चित्रा 2 डी और एफ) वृद्धि करने के लिए शुरू होता है।

AFM के माप की संवेदनशीलता piezoelectric सामग्री और इलेक्ट्रॉनिक प्रतिक्रिया छोरों पर निर्भर है। जैसे, कर प्रयोगों से पहले की स्थापना की AFM के साथ परिचित पाने के लिए महत्वपूर्ण है। Piezoelectric सामग्री के लिए गठित दो आम साधन हैं: (1) ट्यूब स्कैनर एक स्थिर नोक पर नमूना piezoelectric सामग्री के शीर्ष पर रखा गया है और नमूना जांच होती है, जिसमें; या (2) टिप के बजाय नमूने की piezoelectric सामग्री पर मुहिम शुरू की है, जहां वंक चरण। उत्तरार्द्ध मामले में, piezoelectric सामग्री और अन्य इलेक्ट्रॉनिक्स फैल से रक्षा कर रहे हैं। जैविक अनुप्रयोगों के लिए AFM के मॉडलों में से एक बहुत कुछ इस विन्यास है।

इमेजिंग के दौरान, AFM टिप नमूना के साथ संपर्क खो देते हैं और मुझे गलत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंasurements। खो रहे हैं कि कितने स्कैन पर निर्भर करता है, छवि स्कैन लाइनों को हटाने और आसपास के क्षेत्र (चित्रा 3) से नए मूल्यों को प्राप्त करने के लिए एक मतलब तीव्रता फिल्टर का उपयोग करके सुधारा जा सकता है। हालांकि ज्यादातर मामलों में, यह एक अच्छी छवि उपज नहीं है और यह केवल छवि त्यागने के लिए सिफारिश की है। निगरानी की जरूरत है कि अन्य कलाकृतियों कर रहे हैं। ये कुंद / क्षतिग्रस्त / गंदा सुझावों के साथ ही ब्रैकट 31 के पीछे लेजर स्थान के विवर्तन से उत्पन्न होती हैं। इन मामलों में, छवियों को खारिज किया जाना चाहिए और AFM टिप प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।

बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के दौरान, कई चुनौतियां उत्पन्न हो सकती है: चोटियों में से (1) अनुपस्थिति (चित्रा -4 ए), कंधे की (2) उपस्थिति की बजाय अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों (चित्रा 4 बी) बहुत कम से कम, (3) एक छोटे से वृद्धि और बाद में plateauing बल (चित्रा 4C - डी)। एक चोटी के अभाव में एक अरब के बिना एक क्षेत्र में मापने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैAyer या करने के लिए अधिग्रहण की शर्तों को अनुकूलित नहीं किया जा रहा। यह एक AFM छवि बाईलेयर वास्तव में मापा जा रहा है कि सुनिश्चित करने के लिए बल स्पेक्ट्रोस्कोपी करने से पहले हासिल कर ली है कि सिफारिश की है। अधिग्रहण की स्थिति के रूप में अच्छी तरह से टिप / ब्रैकट विनिर्देशों एक सफलता घटना 17 की संभावना को प्रभावित। एक तेज टिप आसानी से इस तरह के रूप में, सफलता बल कम दिखाई देते हैं या यह शोर के स्तर से नीचे है, क्योंकि सब पर प्रकट नहीं हो सकता, एक bilayer पंचर कर सकते हैं। । दृष्टिकोण की गति को बढ़ाने में भी सफलता बल 16 बढ़ जाती है। बाईलेयर टिप द्वारा दबाया जाता है, लिपिड अणु भी इस बल फैलने के लिए प्रतिक्रिया। एक कम दृष्टिकोण गति पर, लिपिड bilayer बल में अगले कदम से पहले संतुलित करने के लिए पर्याप्त समय है, और यह एक सफलता घटना भी हो सकता है कि संभावना बढ़ जाती है। एक उच्च दृष्टिकोण गति में, इस तरह के रूप में, लिपिड की प्रतिक्रिया से अधिक तेजी से और बल रैंप, एक सफलता घटना की संभावना को एक ही बल पर कम है। यह poss के हैउच्च दृष्टिकोण गति का उपयोग करके, सेट बिंदु कोई नमूदार चोटियों में जिसके परिणामस्वरूप बाईलेयर टूटता से पहले तक पहुँच जाता है कि ible। वहाँ की अवस्था पर कंधे की उपस्थिति की व्याख्या करने में कोई रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं, लेकिन हम इसे सफलता से पहले सामग्री संपीड़न के कारण हो सकता है कि मांगना। इसके अलावा, बहुत कम बलों पर एक पठार या विस्तृत चोटियों टिप में गंदगी या ढीले लिपिड सामग्री की उपस्थिति का संकेत हो सकता है। युक्तियाँ कई माप की अवधि में गंदगी और lipídic सामग्री जमा कर सकते हैं। टिप से जुड़ी गंदगी और सामग्री इस प्रकार सफलता बल बढ़ रही है, यह कुंद कर देता है।

यह इन चुनौतियों उठता है अगर बल घटता विभिन्न क्षेत्रों में अर्जित कर रहे हैं की सिफारिश की है। एक दूसरी सिफारिश (इस recalibration की आवश्यकता होगी) सुझावों को बदलने के लिए है। अन्त में, दृष्टिकोण गति समायोजित किया जा करने के लिए या अलग अलग विशेषताओं (टिप त्रिज्या और कठोरता) के साथ एक टिप के उपयोग पर विचार किया जा सकता है की जरूरत हो सकती है। सफलता बल इस तरह, टी के रूप में, 0-50 एन 6 के बीच होती हैवह 0.05-0.7 एन / मीटर की रेंज में हो सकता है ब्रैकट की लगातार वसंत। सबसे वाणिज्यिक cantilevers 20-40 एनएम के आसपास एक मामूली नोक त्रिज्या है। इसके बजाय पारंपरिक सुझावों का उपयोग कर के, tipless cantilevers भी खरीदा जा सकता है और (आमतौर पर आकार के वितरण में monodisperse जो कर रहे हैं) में जाना जाता त्रिज्या के क्षेत्रों उनमें से जुड़ा जा सकता है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए, हमेशा प्रयोगों के एक ही सेट के लिए एक ही अधिग्रहण की स्थिति और ब्रैकट विनिर्देशों का उपयोग करें।

चित्र 1
चित्रा 1: बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के सिद्धांतों के नमूने से ब्रैकट के दृष्टिकोण-त्याग की (ए) के अनुक्रम।। लाल रेखा अपने संतुलन की स्थिति (काला लाइन) से ब्रैकट विक्षेपन से पता चलता है। (बी) ब्रैकट अंशांकन (न्यूटन में) के लिए मजबूर करने के लिए (वोल्ट में) बिजली के संकेत धर्मान्तरित। ब्रैकट sensi के अधिग्रहण सेtivity और निरंतर वसंत (वोल्ट में) खड़ी विक्षेपन दूरी और हूक के कानून का उपयोग बल में दूरी में बदल जाती है। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप में संपर्क करने पर (सी), Z-पीजो स्कैन आंदोलन झुकने खाते में ब्रैकट नहीं ले करता है। इस के लिए एक सुधार Z-पीजो आंदोलन से (दूरी इकाइयों में) खड़ी विक्षेपन, एक्स घटाकर किया जा सकता है, जेड (भी दूरी इकाइयों में)। इस तरह, के बजाय केवल Z-पीजो आंदोलन की वास्तविक टिप नमूना जुदाई, दूरी का एक और अधिक सटीक उपाय है और नमूना की मोटाई मापने के लिए महत्वपूर्ण है, जो सूचना दी जा सकती है।

चित्र 2
एसएम: चित्रा 2:। DOPC से बना SLBs की SLBs की AFM के (ए) योजना चोल (2: 2: 1) बेक़ायदा तरल (एल डी) और तरल का आदेश दिया (एल ओ) चरणों में अलग। (बी (सी) बी में पीले वर्ग (10 माइक्रोन एक्स 10 माइक्रोन) से मेल खाती है। एल और एल डी चरणों चिह्नित कर रहे हैं। रेखा प्रोफाइल नीचे की छवि में पीले रंग की लाइन से मेल खाती है। एल चरण एल डी चरण की तुलना में 1-2 एनएम उच्च प्रकट होता है। (डी) सफलता बल और झिल्ली मोटाई प्राप्त कर रहे हैं दिखा कैसे एक नमूना बल की अवस्था। (ई) निर्णायक शक्ति और मात्रा का ठहराव के लिए गाऊसी फिटिंग के साथ एल डी एल चरणों के लिए (एफ) झिल्ली मोटाई वितरण।

चित्र तीन
चित्रा 3: इमेजिंग के दौरान संपर्क के नुकसान की ओर जाता है। एसएम: चोल छवि के बाकी के अनुरूप नहीं है कि लाइनों स्कैन एक DOPC से बना बाईलेयर समर्थित (2: 2: 1) कुछ लाइन स्कैन में संपर्क के नुकसान के साथ। स्केल बार 2 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4:। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी में चुनौतियां (ए) कुछ बल घटता कोई चोटियों होगा। (बी) की अवस्था के बजाय अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों के कंधों हो सकता है। एक पठार शिखर के अभाव में हो सकता है एक छोटे से वृद्धि के बाद (सी)। एक अच्छी तरह से परिभाषित चोटी के साथ एक साथ एक पठार (डी) सूरत।

झिल्ली क्षेत्र निर्णायक बल (एनएन) झिल्ली मोटाई (एनएम)
एल डी चरण 6 ± 1 4.7 &# 177; 0.5
एल चरण 8 ± 1 6 ± 1

तालिका 1: DOPC की झिल्ली गुण: एसएम: चोल (2: 2: 1)। SLBs एल डी चरण 6 ± 1 एन के एक सफलता बल और 4.7 ± 0.5 एनएम की मोटाई है। एल 8 ± 1 एन और 6 ± 1 एनएम की मोटाई है। दो चरणों के बीच ऊंचाई में अंतर 2 ± 1.4 एनएम है।

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Discussion

DOPC से बना SLBs: एसएम: चोल (2: 2: 1) कैल्शियम क्लोराइड द्वारा प्रेरित पुटिका सोखना और टूटना के बाद मीका पर गठन किया गया। इस लिपिड रचना एल डी एल चरणों में अलग कर दिया। एल चरण sphingomyelin और कोलेस्ट्रॉल में समृद्ध और एल डी चरण 11 से भी कम तरल पदार्थ / अधिक चिपचिपा (चित्रा 1 ए) है। एल डी चरण से एल की जुदाई के आस-पास (चित्रा 1 बी, सी) ऊपर ऊंचा के रूप में परिपत्र संरचनाओं प्रकट होता है। प्लेटफार्मों एल डी चरणों से घिरा एल चरणों में हैं। झिल्ली दोषों (या झिल्ली में छेद) भी (चित्रा 1 बी, नीले तीर) में देखा जाता है और इस दोष के पार एक ऊंचाई प्रोफाइल बाईलेयर की मोटाई से पता चलता है। एल डी / एल ऊंचाई अंतर भी एक AFM ऊंचाई प्रोफ़ाइल (चित्रा 1C) को देखकर जांच की जा सकती है।

लिपिड की तैयारीमिश्रण रचना बाईलेयर गुण निर्धारित करता है के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है। समर्थित बाईलेयर की तैयारी के दौरान, यह लिपिड चरणों (कदम 1.4.5) की उचित गठन के लिए संकेत दिया तापमान पर काम करने के लिए महत्वपूर्ण है। बाईलेयर नष्ट करने के लिए और न ही नोक पर गंदगी जमा नहीं करने के लिए इतनी के रूप में इमेजिंग के दौरान, एक कम बल रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

AFM इमेजिंग के बाद, SLB के क्षेत्रों का चयन किया है और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर जांच कर रहे हैं। बल स्पेक्ट्रोस्कोपी हमें झिल्ली के अन्य गुणों, विशेष रूप से सफलता बल (चित्रा -1) की जांच के लिए अनुमति देता है। चरणों एल डी और एल (चित्रा 1E, एफ) विभिन्न सफलता बल और मोटाई दिखा। गुण तालिका 1 में संक्षेप हैं। हम Chiantia एट अल। 11 की तुलना में, एल डी चरण में सफलता बल के लिए समान मूल्यों प्राप्त किया गया है कि ध्यान दें, लेकिन एल चरण के लिए एक कम मूल्य। यह हो सकता हैकारण हमारे झिल्ली में इस्तेमाल कोलेस्ट्रॉल की कम मात्रा के लिए (वे 1.5 का प्रयोग किया जाता है, जबकि 1::: एसएम: चोल अनुपात 2: 2 हम DOPC इस्तेमाल किया 1.5: 1)। परिणामों के reproducibility में एक महत्वपूर्ण कारक - यह भी सही लिपिड अनुपात मिश्रण के महत्व को दर्शाता है। इसके अलावा, विभिन्न लिपिड (श्रृंखला लंबाई, और unsaturation की डिग्री) का उपयोग भी बाईलेयर गुण 6,15,18 बदल जाता है।

सफलता बलों के वितरण की साजिश रचने के लिए उपयोगी है और पहले से ही बाईलेयर गुणों में अंतर दिखाने सकता है, सफलता बल वितरण के आगे के विश्लेषण लाइन तनाव सहित और दबाव 11,17,21 प्रसार अन्य यांत्रिक गुणों परिणाम निकालना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संक्षेप में, संभावना, पी एक निश्चित सफलता बल को मापने का (एफ), एफ, सातत्य न्यूक्लिएशन मॉडल 11,15,17 द्वारा वर्णित है:

1 समीकरण

जहां एक resona हैब्रैकट के nce आवृत्ति, कश्मीर ब्रैकट के वसंत स्थिर है, वी दृष्टिकोण की गति है, Γ लाइन टेंशन (झिल्ली खुले में एक छेद रखने के लिए आवश्यक बढ़त ऊर्जा), आर AFM की त्रिज्या है टिप, कश्मीर बी टी तापमान है, बोल्ट्जमान स्थिर है, और एस के प्रसार के दबाव या छेद बंद करने के लिए जुड़े ऊर्जा है (झिल्ली तनाव के विपरीत - एक छेद 32 को खोलने के लिए झिल्ली द्वारा लगाए जा करने के लिए आवश्यक ऊर्जा)। इस समीकरण एकीकृत किया जा सकता है और डी पी / DF रूप में गणना की जा सकती है:

2 समीकरण

एक, कश्मीर, आर ब्रैकट अंशांकन के माध्यम से हासिल किया जा सकता है कि AFM के ब्रैकट / टिप के गुण हैं। टी और वी प्रयोगों के दौरान स्थिर रखा जाना चाहिए कि प्रयोगात्मक मानकों हैं। डी पी / DF तो लाइन तनाव और प्रसार के दबाव के अधिग्रहण के लिए हिस्टोग्राम के लिए फिट है। के रूप में कई मापदंडों पी (एफ), अनुभव को प्रभावितmentalists लाइन तनाव और प्रसार के दबाव के लिए तुलनीय मूल्य नहीं है के लिए इसी तरह के सुझाव और अधिग्रहण शर्तों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। (इमेजिंग के दौरान अर्जित नोक पर गंदगी और unfused पुटिकाओं सहित) AFM टिप के संदूषण गैर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम होता है। इसके अलावा, समर्थन की पसंद झिल्ली 20 के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करता है।

लिपिड bilayer के यांत्रिक गुणों चिह्नित कर सकते हैं कि एक और तकनीक की दिग्गज कंपनी unilamellar पुटिकाओं (GUVs) 33 के micropipette आकांक्षा है। इस तकनीक में, झिल्ली तनाव आकांक्षा के दौरान GUVs के विरूपण से गणना की है। इसके अलावा, सक्शन बढ़ाने के द्वारा, एक तनाव गणना कर सकते हैं, जिस पर सातत्य न्यूक्लिएशन मॉडल में लाइन तनाव से संबंधित हो सकता है, जो guv ruptures (या सेल तनाव) 34,। इस तकनीक का एक दोष यह अलग पीएचए के रूप में, झिल्ली को अलग-अलग चरण के लिए झिल्ली तनाव की गणना की जटिलता हैसत्र विभिन्न यांत्रिक गुणों 35 है। इस व्यक्ति चरणों अलग-अलग लक्षण वर्णन किया जा सकता है, जहां AFM के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी, के विपरीत है। कई GUVs सांख्यिकीय प्रासंगिक परिणामों का निर्माण करने की आवश्यकता है, जबकि इसके अलावा, AFM के SLB प्रति एक वितरण का उत्पादन कर सकते हैं। हालांकि, (उदाहरण के लिए, tubulation और invaginations के लिए) झिल्ली remodeling प्रभाव और अधिक आसानी से, GUVs के साथ कल्पना यांत्रिक गुणों के साथ साथ इन आकार से संबंधित प्रभाव निस्र्पक के लिए उन्हें बेहतर सिस्टम बना रहे हैं।

बाईलेयर संपत्तियों पर झिल्ली प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आगे अनुप्रयोगों में, शुद्ध प्रोटीन proteoliposomes बनाने के लिए इन पुटिकाओं में शामिल किया जा सकता है। इस काम को करने के लिए एक तकनीक को स्थिर करने और झिल्ली में डालने के लिए प्रोटीन की मदद करने के लिए डिटर्जेंट का उपयोग करता है। डायलिसिस या आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बाद में शुद्धीकरण समाधान 36 में मुक्त प्रोटीन और डिटर्जेंट निकालता है। एक और दृष्टिकोण की टैगिंग की आवश्यकता हैऔर (निकल nitriloacetic एसिड (नी NTA) या biotinylated लिपिड) के साथ liposomes में इस टैग के लिए शामिल आत्मीयता भागीदारों (उदाहरण, हिस्टडीन या Streptavidin टैग के लिए) शुद्ध प्रोटीन।

सारांश में, हम लिपिड bilayers का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। कारण इसकी उच्च संकल्प करने के लिए, AFM के अन्य लोगों के अलावा लिपिड चरणों में शामिल हैं जो झिल्ली में उप-माइक्रोमीटर संरचनाओं, प्रकट कर सकते हैं। यहाँ लिपिड झिल्ली निस्र्पक के लिए प्रयोग किया जाता बल स्पेक्ट्रोस्कोपी, यह भी झिल्ली प्रोटीन और झिल्ली पर अन्य biomolecules पर इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgements

यह काम (नं। 0,312,040 अनुदान) मैक्स प्लैंक सोसायटी, जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर, विश्वविद्यालय के Tübingen, और Bundesministerium फर Bildung अंड Forschung द्वारा समर्थित किया गया।

हम हमें इस पांडुलिपि की सावधान पढ़ने के लिए बल की अवस्था डेटा और डॉ जैकब Suckale के विश्लेषण को स्वचालित मदद करने के लिए एडवर्ड हरमन धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

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