בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

נויטרופילים, הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם, ממלאים תפקיד חשוב בהגנה המארחת נגד מיקרואורגניזמים פולשים. בנוסף, נויטרופילים לשחק תפקיד מרכזי במעקב חיסוני של תאים סרטניים. יש להם את היכולת לזהות תאים סרטניים ולגרום למוות של תאים סרטניים או באמצעות מנגנון מגע תלוי תא מעורב מי חמצן או באמצעות רעיל נוגדנים תלויים בתיווך תא (ADCC). נויטרופילים עם פעילות אנטי-סרטנית יכולים להיות מבודדים מהדם היקפי של חולי סרטן ושל עכברי נושאות גידולים. נויטרופילים אלה מכונים נויטרופילים-entrained גידול (TEN) כדי להבחין ביניהם הנויטרופילים של נבדקים בריאים או עכברים נאיביים שלא מראים פעילות ציטוטוקסיות גידול משמעותית. בהשוואה לתאי דם לבנים אחרים, נויטרופילים להראות ציפה שונה שהופכים אותו אפשרי על מנת להשיג> 98% מאוכלוסיית נויטרופילים הטהורים כאשר נתון שיפוע צפיפות. עם זאת, בתוספתלאוכלוסיית נויטרופילים בצפיפות גבוהה הנורמלית (HDN), בחולי סרטן, בעכברי נושאי גידול, כמו גם בתנאים דלקתיים כרוניים, אוכלוסיות מובחנות נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) מופיעות במחזור הדם. LDN שיתוף לטהר עם חלק mononuclear ויכול להיות מופרד מתאי mononuclear או באמצעות אסטרטגיות בחירה חיוביות או שליליות. ברגע שטוהר נויטרופילים המבודדים נקבע על ידי cytometry זרימה, הם יכולים לשמש במבחנה ובמבחנים פונקציונליים vivo. אנו מתארים טכניקות לניטור הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים, היכולת שלהם להעביר ולייצר מיני חמצן מגיבים, כמו גם ניטור קיבולת phagocytic vivo לשעבר. בנוסף, אנו מתארים טכניקות לתייג נויטרופילים למעקב in vivo, וכדי לקבוע את היכולת אנטי-גרורתי שלהם in vivo. כל הטכניקות האלה הן חיוניות להבנה כיצד להשיג ולאפיין נויטרופילים עם אנטי-סרטניפונקציה.

Introduction

נויטרופילים תחילה התאפיינו כתאים חיסוניים המולדים המשמשים כהגנה שורה הראשונה נגד מיקרואורגניזמים פולשים. היום ידוע שנויטרופילים יש יותר מרחיק לכת פונקציות, שהיה מעורב בהרכבת מערכת חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים זרים 1,2, המסדיר hematopoiesis 3, אנגיוגנזה 4 וריפוי פצעי 5. בנוסף, נויטרופילים עשויים להשפיע גידול והתקדמות גרורתי מכוח הפעילות פרו ואנטי-סרטנית שלהם 6,7. נויטרופילים מתאפיינים בגרעין מפולח צורות (ומכאן נקרא polymorphonuclear (לויקוציטים PMN)) ומכיל לפחות שלושה subclasses השונה של גרגירים כמו גם שלפוחית ​​הפרשה 8 (1A-C איור).

נויטרופילים יש יכולת phagocytic גבוהה ופעילות מונואמין הגבוה NADPH קריטי לחיסול חיידקים, ומפרישים מגוון רחב של כמוקינים חשובים במתיחה של נויטרופילים נוספים ותאים אחרים של מערכת חיסון לאתר של דלקת 8,9. נויטרופילים מאופיינים בביטוי של כמות גדולה של קולטני משטח כולל קולטני-כמו אגרה (TLRs), C-סוג הקטינים רצפטורים (CLRs), משלימים קולט 3 (CD11b / CD18) ומולקולות דבקות אחרות (למשל, L-selectin, LFA-1, VLA-4 ומולקולת carcinoembryonic הקשורים לאנטיגן הידבקות תא 3 (CEACAM3 / CD66b)), קולטני chemokine (למשל, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), קולטני chemoattractant (למשל, PAFR, LTB 4 R וC5aR) , קולטני ציטוקינים (למשל, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18r, TNFR), formyl-פפטיד קולטנים (למשל, FPR1-3), וקולטני Fc (למשל, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII), וCD64 (FcγRI) 10. בעכברים, נויטרופילים בדרך כלל מזוהים כCD11b + Ly6G +, ואילו נויטרופילים אדם מזוהים באמצעות סמני יקוציט CD11b, CD15, CD16 וCD66b. הוא גם מקובל להכתים לMyeloperoxidase חלבוני גרגיר (MPO) ואלסטט נויטרופילים (NE) לגילוי של נויטרופילים ברקמות.

זה עדיין לא ברור אם הפונקציות המגוונות של נויטרופילים מתווכות על ידי אותו התא או על ידי תת-אוכלוסיות תאים שונות. נתוני צבירה מציעים לנוכחותה של אוכלוסייה הטרוגנית נויטרופילים שמציגה רמה גבוהה של הגמישות מושפעת גירויים פרו-דלקתיים ומייקרו-הסביבה 11,12. Fridlender et al. 13 חילקו באופן בוטה את הנויטרופילים בסרטן לשתי תת-אוכלוסיות גדולות כינו N1 עם תכונות אנטי-סרטניים וN2 עם תכונות פרו-סרטנית. בסרטן, כמו גם בדלקת כרונית, יש תת-אוכלוסייה נוספת מורכבת מתאי granulocytic נגזר מיאלואידית מדכאת (G-MDSCs) המדכאים תגובות תא T 14. G-MDSCs נחשב לתאים בוגרים מיאלואידית מתאפיינים CD11b + Ly6Cפנוטיפ הנמוך Ly6G היי בעכברים 15, בזמן שיש CD15 + / CD16 פנוטיפ הנמוך ב -16 בני אדם. G-MDSCs להביע רמות גבוהות יותר של arginase וMyeloperoxidase, רמות נמוכות יותר של ציטוקינים בזמן וכמוקינים מ נויטרופילים במחזור נורמלים. הם פחות phagocytic ונודד, אך מייצרים רמות גבוהות יותר של ROS 15,17,18. בעבודה הנוכחית נתאר כמה שיטות בסיסיות לבידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית.

בעוד נויטרופילים מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם (45 - 70%; 1800 - 6000 / μl), בעכברים, בתנאים רגילים, הם די דלילים (10 - 15%; 300-500 / μl ). עליות ספירת נויטרופילים בעקביות על דלקת ולעתים בסרטן, המייצג את המדינה של דלקת כרונית 7. נויטרופילים לפתח ממבשר מיאלואידית הנפוצה multipotent לסה"נ (CMP)LLS במח העצם, בתהליך בידול עובר שלבי myeloblasts (MB), promyelocytes (PM), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) ותאי להקה (BC) 8. נויטרופילים הבוגרים, לאחר mitotic עשויים להישאר בתוך מח העצם עבור 4-7 ימים לפני שהם שוחררו למחזור 8. מחזור נויטרופילים בדם הוא בדרך כלל מהיר עם מחצית חיים ממוצע של 6 - 12 שעות, אשר עשוי להיות ממושכת בתנאים דלקתיים. נויטרופילים unstimulated מוגבלים פעילות אנטי-סרטנית, תכונה שניתן לרכוש על ידי חשיפת נויטרופילים הנאיביים כמוקינים IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 וCXCL5 6,19 או באופן מלאכותי, על ידי חשיפתם לphorbol אסתר phorbol 12 13-אצטט -myristate (PMA) 6.

זמן מחצית החיים הקצרים של נויטרופילים יחד דם עם המספר הנמוך של נויטרופילים (~ 3-5 x 10 5) השיגו מ1 מיליליטר דם של 6 נאיבי - עכבר בן 8 שבוע, הפכו אותוקשה לחקור את הפונקציה של מחזורי נויטרופילים עכבר במבחנה. כדי להתגבר על קושי זה, מקורות אחרים כבר בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבל מספר גדול של נויטרופילים ממח עצם 20 או הצפק הבא האינדוקציה של דלקת סטרילית (למשל, לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate מרק או Zymosan). יש לציין כי נויטרופילים מתקבלים מחלל הצפק לא להפעיל כל פעילות אנטי-סרטנית (תצפית לא פורסם).

. גרנות ואח '6 ציינו כי עכברי BALB / ג מחוסן orthotopically עם קו תא קרצינומה 4T1 שד העכבר לפתח neutrophilia שמחריף עם התקדמות גידול 6 (איור 2 א), כך ש-20 - ניתן לבודד 40 מיליון נויטרופילים דם בקלות מהדם 1 מיליליטר 3 - 4 שבועות חיסון לאחר גידול. נויטרופילים אלה שרכשו את פעילות אנטי-סרטנית, והיה בהתאם coiנויטרופילים נד-entrained גידול (עשר), כדי להבדיל אותם מנויטרופילים נאיביים 6 (איור 2). בעוד נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN, איור 1 א) הם מאוד אנטי-סרטניים, נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN, איור 1) שנוצרו בהקשר של הסרטן הם לא 21. כמו כן, יש לי נויטרופילים בצפיפות גבוהה ממח העצם והטחול של עכברי נושאי גידול פעילות אנטי-סרטני (נתונים שלא פורסמו). יש לציין כי עם התקדמות גידול הטחול המוגדל הופך בהדרגה (splenomegaly), עם הגדלת כמויות של נויטרופילים.

יש לציין כי עשר נוצרים גם בדגמים אחרים של סרטן, כולל שני (גידולי MMTV-PyMT וMMTV-Wnt1 החלב וגידולי ריאה מונעים k-ראס) ספונטניים ומוזרקים (AT-3 (MMTV-PyMT) וסרטן שד E0771 תאים, תאי LLC לואיס סרטן הריאות ותאים מלנומה B16-F10). עם זאת, היקף הגיוס נויטרופילים בקיבה אלהאו מודלים הוא הרבה פחות מעכברים מחוסן-4T1, הגיעו 5 - 10 x 10 6 נויטרופילים בדם מיליליטר 1 לאחר 3 שבועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי חיים: עכברים ישנים 5-7 שבועות / ג BALB נרכשים מהרלן (ישראל). כל הניסויים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת עברית המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). דגימות אנושיות: אוסף של דם מחולי הסרטן ומתנדבים בריאים אושרו על ידי המרכז הרפואי הדסה Institutional Review Board (IRB).

1. אינדוקציה של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית in vivo שימוש סרטן שד עכבר דגם.

הערה: יש לבצע כל הפעולות המשתמשות בפתרוני סטרילי בזרימת האוויר למינרית (צבא לבנון) ביו-בטיחות.

  1. זרע 5 x 10 5 4T1 תאים בצלחת תרבית רקמת 100 מ"מ ב 10 מיליליטר של מדיום הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 גר '/ D-גלוקוז L בתוספת 10% בסרום שור עוברי חום מומת (FBS), 2 מ"מ D- גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / פניצילין G מיליליטר ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סולפט סטרפטומיצין. דגירה התאי דואר על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified המכילה 5% CO 2 למשך 3 עד 4 ימים. ודא שהתאים 50-100% ומחוברות ביום של הניסוי.
  2. כדי לנתק את תאי גידול מצלחת תרבית הרקמה, לשאוב את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר PBS, לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של פתרון טריפסין 2.5 g / L. דגירה התאים 2 - 3 דקות עם טריפסין על 37 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 10 מיליליטר בינוני סרום המכיל לנטרל את טריפסין ופיפטה למעלה ולמטה עד שכל התאים הופרדו. מעבירים את ההשעיה תאים לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר.
  4. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות על RT. לשאוב את המדיום עוזב 200 בינוני μl מעל התא גלולה. Resuspend התאים בהיקף השייר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS. להפוך את הצינור 2-3 פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית ולהוציא 10 μl לספור את התאים בhemocytometer. השתמש trypan הכחול להבחין בין תאי חיים ומתים. צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 200 XG ב RT. לשאוב PBS וresuspend תאי PBS בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. ודא שיש לו את ההשעיה התא בודדת לא clumping.
  5. הזרק 1 x 10 6 תאים 4T1 או 4T1 תאים ב -50 μl PBS orthotopically לתוך כרית השמאל מפשעתי החלב השומן של עכברים / ג הנשיים BALB באמצעות מזרק 0.3 מיליליטר עם מחט 8mm x 30G להביע בלוציפראז.
    1. לפני ההזרקה, להרדים את העכברים בחדר אינדוקציה מקבלים קצב זרימה איטי של isoflurane (3-5%) ב100% חמצן.
    2. הנח את העכבר על משטח ניתוח סטרילי ולוודא הראש ממוקם כראוי בתוך חרטום isoflurane. אשר הרדמה תקינה על ידי צובט את הכף. השתמש משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לגלח את השיער באזור ההזרקה ולחטא עם EtOH 70%.
    3. כ שימוש בערכה סטרילית של כלים כירורגיים לעשות חתך אופקי קטן (5 מ"מ)במחצית הדרך בין imately מפשעתי ופטמות בטן, לחשוף את כרית השומן ולהזריק 1 x 10 6 תאים ב4T1 50 μl. סגור את החתכים עם קליפים 9 מ"מ שיש להסיר את שבוע לאחר מכן. הזרקה של תאים לבטא בלוציפראז מאפשרת ניטור של גודל גידול וגרור על ידי הדמיה פליטת אור.
      הערה: הליך פולשנית זו אינו דורש כל טיפול לאחר ניתוח והעכברים שהוזרקו להתאושש בתוך 2-3 דקות.
    4. צג העכברים עד שתחזרו להכרה, ולוודא שהם יחזרו להכרה מלאה לפני שהצטרף לחברה של עכברים אחרים.
  6. לאחר 3-4 שבועות, כאשר הגידול הראשוני הגיע נפח של 2 סנטימטר 3, להקריב את העכברים על ידי CO 2 זרם איטי, ומייד לאחר הנשימה האחרונה, להשיג דם על ידי לנקב לב באמצעות מחט 25G 5/8 x " מחובר למזרק טוברקולין 1 מיליליטר קודם לכן בהפרין. שמור את הפה של המחט כלפי מעלה בעת ההכנסהמזרק במצב אופקי דרך הסרעפת לכיוון הלב, ולאט ובהדרגה לצייר דם הימנעות לחץ עודף (איור 3).

2. בידוד נויטרופילים

  1. בידוד של נויטרופילים ציטוטוקסיות מהדם של עכברי נושאות גידולים.
    1. לדלל 1 מיליליטר דם שנלקח מעכבר גידול נושאות (ראה פרוטוקול 1.11) בPBS המכיל 0.5% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) לנפח סופי של 6 מיליליטר.
    2. חלוקה של דם מדולל בשיפוע סוכרוז רציף מוכן טרי:
      1. להוסיף 3 מיליליטר של סוכרוז-מסונן סטרילי 1.119 g / ml לתחתית צינור צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 15 מיליליטר.
      2. לאט ובזהירות, שכבת 3 מיליליטר של סוכרוז-מסונן סטרילי 1.077 g / ml על גבי גרם / מיליליטר השכבה 1.119. לאחר מכן, להוסיף לאט ובזהירות 6 מיליליטר של דם מדולל (פרוטוקול 2.1.1) על גבי 1.077 g / ml השכבה (איור 4 א). מומלץ להחזיק השפופרת מוטה וdding הרכיבים השונים על ידי זרימה איטית, אבל רציפה, שמירה על הפה של פיפטה לעבר הקיר התחתון של הצינור, כך שאין מערבולת נוצר.
    3. צנטריפוגה הצינור המכיל הדם המדולל בשיפוע סוכרוז ב 700 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם.
    4. מוציא בזהירות את הצינור מצנטריפוגות מבלי לגרום למערבולת. רוב אריתרוציטים יהיו בחלק התחתון של הצינור. נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN) נמצאים כטבעת לבנה לאדום בממשק שבין 1.119 g / ml ו1.077 g / שכבות מיליליטר (כ 3 מיליליטר הסימן), ואילו כדוריות דם לבנות בצפיפות נמוכה נמצאות ב טבעת לבנה בממשק שבין 1.077g / שכבת מיליליטר וPBS BSA המכיל (סביב סימן 6 מיליליטר, ראה איור 4).
    5. לשאוב BSA PBS + 0.5% עד שמגיע 5 מ"מ מעל שכבת תאים בצפיפות נמוכה. פיפטה את התאים בצפיפות נמוכה על ידי שאיבה איטית לקצה מיליליטר 1 עד מתערבל באיטיות סביב התאים.להעביר את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS עם BSA 0.5%.
    6. לשאוב את השכבה העליונה באותו צינור השיפוע עד שמגיע 5 מ"מ מעל להקת התא בצפיפות גבוהה. פיפטה את התאים בצפיפות גבוהה, שהם בעיקר נויטרופילים בצפיפות גבוהה, ולהעביר את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS המכיל BSA 0.5%.
    7. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    8. לשאוב אריתרוציטים supernatant וlyse ידי resuspending התאים ב -36 מיליליטר מים כיתה HPLC סטרילי במשך 30 שניות. Isotonicity צריך להיות משוחזר על ידי הוספת 9 מיליליטר של 5x מרוכז PBS בתוספת 2.5% (w / v) BSA.
    9. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    10. לשאוב supernatant, וresuspend תאי PBS-BSA. לספור את מספר הנויטרופילים בhemocytometer ולהשתמש trypan הכחול להבחין בין תאי חיים ומתים.
    11. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT וresuspend נויטרופילים במדיום דגירה רצוי לצפיפות תא סופית. שימושנויטרופילים מייד.
    12. ואז, לאחר צנטריפוגה אחרת, resuspend נויטרופילים במדיום דגירה לצפיפות תא סופי. השתמש בנויטרופילים מייד.
  2. בידוד של מחזור נויטרופילים מחולי הסרטן.
    1. לערבב 10 מיליליטר של heparinized (20 U / ml) דם אדם עם נפח שווה של 3% T500 Dextran מלוחים ודגירה במשך 30 דקות ב RT. במהלך דגירה זה אריתרוציטים יהיו משקעים.
    2. הכן צינור פוליפרופילן חרוטי 50 מיליליטר עם ז 1.077 10 מיליליטר סוכרוז / מיליליטר ושכבה לאט supernatant יקוציט עשיר על גבי / מיליליטר שכבת 1.077 גרם סוכרוז (איור 4C).
    3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם. נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN) יופיעו בגלולה. נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) שיתוף לטהר עם מונוציטים וימפוציטים בממשק שבין 1.077 g / שכבת מיליליטר סוכרוז והפלזמה (איור 4D).
    4. Resuspend נויטרופילים ב 10 מיליליטר 0.2% NaCl למשך 30 שניות לlyse אריתרוציטים לזהם, ולשחזר isotonicity על ידי הוספת 10 מיליליטר של 1.6% NaCl ולהפוך פעם אחת.
    5. צנטריפוגה 5 דקות ב160 XG ב RT, ולשטוף שלוש פעמים ב 20 מיליליטר תמיסת מלח המאוזן "הנקס. צנטריפוגה לאחר כל שטיפה ולשאוב supernatant.
    6. ספירת הנויטרופילים וresuspend תאי RPMI-1640 בתוספת 2% FBS ב 2 x 10 6 נויטרופילים / מיליליטר או כרצויים.

3. העשרה של דם נויטרופילים באמצעות חרוזים מגנטיים

  1. סלקציה חיובית
    1. קח 1 מיליליטר של דם מעכבר כמתואר בפרוטוקול 1.8, עם מזרק heparinized.
    2. צנטריפוגה הדם בצינור חרוטי 15 מיליליטר ב 400 XG במשך 5 דקות על RT.
    3. לשאוב supernatant או לשמור על הפלזמה הדם למחקרים נוספים.
    4. Lyse אריתרוציטים ידי resuspending התאים במי HPLC כיתה 8 מיליליטר. לאחר 30 שניות לשחזר isotonicity על ידי הוספת 2 מיליליטר של conce 5xntrated PBS המכיל BSA 2.5%. ספירת התאים.
    5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות על RT.
    6. Resuspend התא גלולה ב200 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו -2 EDTA מ"מ לכל 10 8 תאים.
    7. הוסף 50 μl של נוגדן אנטי Ly6G biotinylated. מערבבים היטב ודגירה של 10 דקות במקרר (לא על קרח).
    8. להוסיף 150 μl PBS הקר המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    9. וורטקס פתרון המניות אנטי-ביוטין המצופה microbead המגנטי. העבר את 100 μl להשעית התא. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (לא על קרח).
    10. לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    11. לשאוב supernatant לחלוטין, וגלול ב500 μl PBS הקר המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    12. הכנס עמודת הפרדה מגנטית לבעל מגנט שמחובר לדוכן מגנטי, ולשטוף אותו עם PBS הקר 500 μl מכיל 0.BSA 5% ו -2 מ"מ EDTA.
    13. החל ההשעיה התא על הטור. הזרימה דרך מכיל תאי LyG6 שלילי ללא תווית.
    14. לשטוף את העמודה עם 500 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA. תאים ללא תווית נוסף יהיו בזרימה דרך.
    15. חזור על שלב הכביסה עם עוד 500 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    16. הסר את העמודה מהמגנט ומניח אותו על צינור איסוף 15 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, ולשטוף את התאים שכותרתו מגנטית בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. הזרימה דרך מכילה נויטרופילים Ly6G +.
  2. סלקציה שלילית
    1. הכן לויקוציטים דם על פי צעדים 3.1.1 ל3.1.5.
    2. Resuspend 1 x 10 8 תאים ב 1 מיליליטר PBS המכילים BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA בצינור עגול תחתון-5 מיליליטר קלקר.
    3. הוסף 50 μl סרום חולדה נורמלי.
    4. הוסף 50 μl העשרת נויטרופילים גocktail (המכיל נוגדני biotinylated ספציפיים לתאי דם לבנים שאינם נויטרופילים), מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות במקרר.
    5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 4 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, וXG 400 צנטריפוגות במשך 10 דקות.
    6. בטל supernatant וresuspend תאי מיליליטר 1 PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    7. הוסף 50 μl של מתחמי נוגדן המכוונים נגד tetrameric ביוטין וdextran. מערבבים היטב ודגירה של 10 דקות במקרר.
    8. המערבולת גם הצינור המכיל חרוזים מגנטיים מצופה dextran לפני הוספת 150 μl להשעית התא. מערבבים היטב דגירה 10 דקות במקרר.
    9. להביא את ההשעיה תא בהיקף כולל של 2.5 מיליליטר על ידי הוספת PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA. מערבבים בעדינות כדי לקבל השעיה תא הומוגנית.
    10. הכנס את הצינור (ללא כובע) לתוך המגנט, ולתת לעמוד במשך 3 דקות.
    11. הפוך את המגנט עם הצינור באחד רציףתנועה כך שהתאים מאוגד בנוזל יועברו לצינור חדש. השאר את המגנט וצינור הפוך 2 - 3 שניות, ואז לחזור למצב זקוף. התאים לא רצויים שכותרתו מגנטית יישארו כבול לקיר של הצינור המקורי, תוך נויטרופילים מאוגד יהיו בנוזל שהועבר.

4. ציטולוגית הכתמה של נויטרופילים

  1. Resuspend 1x10 5 נויטרופילים ב -50 μl PBS ולהעביר את ההשעיה התא לתא מתאם הכנת שכבה דקה כגון Cytospin. צנטריפוגה המתאם ב XG 150 במשך 5 דקות. הפרד את שקופיות זכוכית שכותרתו מראש מהמתאם.
  2. תקן תאים על ידי טבילת שקופיות הזכוכית באתנול 70% למשך 2 דקות. לאפשר את ההכנות מהמתאם (ראה שלב 4.1) לייבוש על RT לפני הצביעה. טובלים את השקופיות 5 - 6 פעמים במים מזוקקים.
  3. כתם 1 - 2 דקות בתמיסה של מאיר Hematoxylin. יש לשטוף 1 דקות במים ברז. כתם 10 שניות בפתרון Eosin Y . לשטוף במים ברז. מייבש על ידי שטיפת השקופיות בהגדלת ריכוזי אתנול (70%, 96% ו -100%). בואו שקופיות זכוכית האוויר יבשות זמן קצר ולבדוק את השקופיות תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: יש Hematoxylin צבע כחול עמוק, סגול וכתמי חומצות גרעין, ואילו eosin הוא ורוד וכתמי חלבוני nonspecifically. גרגרי cytoplasmic של נויטרופילים יישארו בלא כתם על ידי צבעי חומצי או בסיסיים, המהווה את המקור לשם "אוהב להיות ניטראלי". בעוד כחול כהה basophilic כתם גרנולוציטים עם hematoxylin ו eosin וeosinophilc גרנולוציטים אדום בהיר, נויטרופילים מופיעים ורוד ניטראלי (ראה איור 1 א). נויטרופילים בוגרים מאופיינים בגרעין polymorphonuclear, שהוא באופן כללי גדול עם 2-5 'נויטרופילים מפולחים' האונות (איור 1 א ו1C). נויטרופילים בוגרים מאופיינים בגרעין מעוקל או בצורת טבעת-אונות אחד (איור 1).
ve_title "> 5. קביעת טוהר נויטרופילים ידי cytometry הזרימה.

  1. Resuspend 1x10 6 תאים במאגר של FACS 100 μl (PBS המכיל BSA 0.5%, 2 מ"מ EDTA ו0.02% NaN 3). לדגימות דם כל, נדרש המוליזה לפני הצביעה (השלבים 3.1.1 ל3.1.5). הוסף 10 μl של מגיב חסימת FCR למשך 5 דקות.
  2. הוסף 0.5 מיקרוגרם של נוגדן שכותרתו ניאון עם סגוליות לLy-6G לנויטרופילים עכבר או לCD11b וCD66b לנויטרופילים אנושיים, מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
  3. להתאים את עוצמת הקול עד 500 μl עם PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA ולנתח הכתמה על ידי cytometry זרימה.

6. מעקב נויטרופילים שער in vivo

  1. בתיוג BrdU vivo של נויטרופילים
    1. הזרק של 10 מ"ג bromodeoxyuridine מיליליטר פתרון / (BrdU) ב PBS סטרילי 100 μl intraperitoneally לעכברי נושאות גידולים.
    2. לבודד נויטרופילים בדם 48 שעות לאחר הזרקהccording לפרוטוקול 2.1. כתם BrdU שכותרתו נויטרופילים באמצעות זרימת BrdU ערכה.
  2. תיוג CFSE של נויטרופילים
    1. Resuspend 10 7 נויטרופילים ב 1 מיליליטר של PBS מראש חימם.
    2. הוסף 2 μl של 5 מניות פתרון מ"מ CFSE לנויטרופילים מושעים לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. 5 מ"מ CFSE הוא הוכן על ידי המסת 2.8 מ"ג של CFSE (5 (ו 6 -) - diacetate Carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר) בDMSO 1 מיליליטר. המחלקים ל -10 aliquots μl בצינורות סטרילי 200 μl וחנות בחושך ב -20 ° C.
    3. לנטרל CFSE העודף על ידי הוספת נפח שווה של RPMI-1640 המכילים 10% FBS. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה נויטרופילים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. שטוף את הנויטרופילים פעמיים ב 10 מיליליטר של RPMI-1640 המכיל 10% FBS.
    4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות וגלולות בנפח מתאים של PBS. נויטרופילים (למשל, 1 x 10 7

7. במבחנה לוציפראז Assay כדי לפקח על הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים המבודדים.

  1. לטפח תאים סרטניים שכותרתו לוציפראז כפי שתואר עבור 4T1 תאים בפרוטוקול 1.1-1.5, אבל resuspend התאים-ניתק טריפסין באופטימיזציה בינוני סרום מופחת בתוספת 2% FBS. התאם את צפיפות תאי 5 x 10 4 תאים לכל מיליליטר.
  2. 5,000 תאים סרטניים שכותרתו לוציפראז זרע ב100 μl מותאמים בינוני סרום מופחת המכיל 0.5% FBS בכל טוב של צלחת גם לבנה 96-שטוח תחתונה רקמות תרבות.
  3. 4 שעות לאחר זריעת התאים הסרטניים, להוסיף 1 x 10 5 נויטרופילים ב -50 μl מותאם בינוני סרום מופחת המכיל 0.5% FBS, ודגירת O / N. הכן השעיה תא נויטרופילים עם צפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. בארות בקרה צריכה לקבל 50 בינוניות μl ללא נויטרופילים. האםחזרות מרובות של כל הגדרה ניסיונית.
  4. בבוקר הבא, בעדינות לשאוב supernatant ולשטוף היטב עם כל 200 μl PBS. לשאוב PBS ולהוסיף 50 μl של חיץ תמוגה הפסיבי. לתאי ניתוק בקלות (כגון AT-3 תאים), לא לשטוף בPBS ולהוסיף למאגר תמוגה תרבית תאים מייד לאחר aspirating מדיום הגידול.
  5. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום ודגירה אותו על שייקר מסלולית ב 150 סל"ד במשך 20 דקות ב RT.
  6. מניחים את הצלחת בקורא צלחת הארה. הזרק 50-חכם גם פתרון assay בלוציפראז μl, ולקרוא את chemiluminescence במשך 10 שניות בכל טוב.
  7. לחשב את תמוגה גידול% על ידי הנוסחה הבאה: תמוגה גידול% = (1- [הארה של דגימות עם נויטרופילים] / [הארה של דגימות במדיום]) x 100%.

הערה: כדי להעריך את התרומה של נויטרופילים לזריעה גרורתי, נויטרופילים עשויים להיות מדולדלים כמתואר בפרוטוקול 8.1. לdepl היעילetion לנהל נוגדנים המדללים את נויטרופילים מתחילים ביום 7 engraftment הודעה גידולים.

פעילות 8. אנטי-גרורתי של נויטרופילים בסרטן שד עכבר דגם.

  1. בדלדול vivo של נויטרופילים.
    1. טרי להכין 12.5 מיקרוגרם של נוגדן אנטי Ly6G חולדה (נוגדן מדלדל נויטרופילים) או של נוגדן שליטת אלוטיפ חולדה (2a IgG, Κ) בתמיסת מלח בנפח סופי של כל עכבר 100 μl.
    2. החל ביום 3 engraftment הודעה גידולים להזריק יומי במינון intraperitoneal של נוגדן 12.5 מיקרוגרם עכברוש אנטי-Ly6G (100 μl). הזרק עכברי שליטה עם או 12.5 מיקרוגרם (100 μl) נוגדן שליטת אלוטיפ חולדה (2a IgG, Κ).
    3. החל ביום 14, לנהל את הנוגדנים פעמיים ביום, כקצב ייצור נויטרופילים מגדיל באופן דרמטי כאשר הגידול גדל 4T1.
    4. בכל יום אחר, להשיג דגימת דם (2-3 טיפות) על ידי שסחב את הזנב-הווריד לרוחב. לאסוף את הדם לתוך אנטיצינור -coagulant מכיל (הפרין, ציטראט או EDTA).
    5. ודא דלדול נויטרופילים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בפרוטוקול 5.
  2. מבחן נטרול גידול (השתנה Winn Assay)
    1. לבודד נויטרופילים מעכברי נושאי גידול. לערבב 1 x 10 6 תאים סרטניים ו- 3 x 10 6 נויטרופילים מלוחים μl 50 (לכל עכבר).
    2. להזריק את התאים מתחת לעור לאגף של 6-8 שבועות עכברי BALB / ג נאיביים ישנים. לגלח את האגף לפני engraftment גידול לאפשר מדידות מדויקות של גודל גידול. למדוד התחלה יומית גודל גידול ביום 5 לאחר קליטתם.
  3. העברת המאמצת נויטרופילים
    1. להזריק 2 x 10 4 תאים סרטניים המבטא בלוציפראז ב200 μl PBS לוריד הזנב.
    2. העברת נויטרופילים יש לבצע 4 שעות לאחר הזרקת תאים סרטניים. לפיכך, להתחיל טיהור HDN מעכברי גידול נושאות (פרוטוקול 2.1) כ 2 שעות לפני מתוכנן שלהם בהעברת vivo. Resuspend נויטרופילים בPBS בריכוז סופי של 2.5 x 10 7 תאים / מיליליטר.
    3. 4 שעות לאחר החדרת תאי הגידול למקם את העכברים תחת מנורת חום במשך 5 דקות. מניחים את העכברים בעוצרים ולהזריק 5 x 10 6 HDN (200 μl) דרך וריד הזנב. עכברי בקרה מוזרקים עם רכב (PBS).
    4. צג ההיווצרות של גרורות ריאות בנקודות זמן שונות על ידי שימוש במערכת ההדמיה פליטת אור vivo או על ידי אימונוהיסטוכימיה.
  4. assay זריעה גרורתי ריאות
    1. הזרק 0.5-1 x 10 6 תאי 4T1 הורים orthotopically לתוך כרית שומן השמאל מפשעתי החלב כפי שתואר בפרוטוקול 1.
    2. ביום 10, resuspend 4T1 להביע תאים GFP בPBS בריכוז סופי של 5 x 10 5 תאים / מיליליטר. מניחים את העכברים תחת מנורת חום במשך 5 דקות.
    3. מניחים את העכברים בעוצרים ולהזריק 1x10 5 תאי 4T1 להביע GFP (200 μl) לוריד כדי 4T1 עכברי נושאי גידול או עכברים נאיביים.
    4. ביום הבא, להרדים את העכברים וינקבו ריאות עם 20 מיליליטר PBS להסיר RBCs שנותר.
    5. בלו הריאות לניתוח של תאי GFP חיובי על ידי אימונוהיסטוכימיה.
      הערה: כדי להעריך את התרומה של נויטרופילים לזריעה גרורתי, נויטרופילים עשויים להיות מדולדלים כמתואר בפרוטוקול 8.1. לדלדול יעיל לנהל נוגדנים המדללים את נויטרופילים מתחילים ביום 7 engraftment הודעה גידולים.

9. דיכוי של התפשטות תאי T על ידי נויטרופילים מעכברי נושאי גידול.

  1. הסר את הטחול מBALB / עכבר מורדמים נאיבי ג ומקום 10 מיליליטר PBS.
  2. מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר שהוא בכושר על צלחת פטרי מלא בRPMI-1640. שימוש בסוף הבוכנה של המזרק, מועך את הטחול דרך תאי מסננת לתוך צלחת פטרי. יש לשטוף את מסננת התא עם RPMI 5 מיליליטר. מחק את המסננת.
  3. להעביר את תאי resuspended לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר וXG 400 צנטריפוגות במשך 10 דקות.
  4. בטל supernatant, וlyse אריתרוציטים ידי השעיית התאים לתוך 36 מיליליטר של מים טהורים למשך 20 שניות, ולהתאים לisotonicity ידי הוספת 4 מיליליטר של PBS מרוכז x 10. לחלופין, lyse אריתרוציטים ידי השעיית את התאים לתוך 5 מיליליטר של כדורית אדומה lysing חיץ (ACK), דגירה 5 דקות ב RT. לנטרל את ACK על ידי הוספת 10 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. Resuspend תאי 5 מיליליטר PBS ולספור את התאים.
  5. Resuspend splenocytes בPBS לצפיפות סופית של 4 × 10 7 תאים / 2 מיליליטר בשפופרת 15 מיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של פתרון CFSE 2.5 מיקרומטר בPBS. במהירות להפוך את הצינור ודגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כאשר מדי פעם ערבוב (כל 2 דקות), מוגנות מפני אור.
  6. להרוות CFSE העודף על ידי הוספת 4 מיליליטר של FBS המחומם מראש (100%) ודגירת דקות 1 ב RT. הוסף 3 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10דקות.
  7. לשטוף את התאים עם 30 מיליליטר PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות.
  8. סנן את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ולשטוף שוב עם PBS.
  9. Resuspend התאים בינוניים RPMI-1640 בתוספת 10% FBS לצפיפות סופית של 2 x 10 7 תאים / מיליליטר.
  10. זרע 2 x 10 6 / טוב (200 μl) בצלחת רקמות תרבות 24 גם.
  11. לעורר את התאים על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של נוגדן אנטי העכבר CD3ε אוגר ארמני מטוהר ב500 μl RPMI-1640 עם 10% FBS.
  12. הוסף 2 x 10 6 HDN או LDN ב300 μl RPMI-1640 עם 10% FBS לsplenocytes כותרת CFSE, ודגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. ולס ללא נויטרופילים צריך לקבל 300 בינוני μl. נפח כולל של כל טוב צריך להיות 1 מיליליטר.
  13. לאסוף את התאים ולהכין אותם לcytometry זרימה. Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ (פרוטוקול 5), ולהוסיף 10 μl של מגיב חסימת FCR. דגירה של 5 דקות על RT.
  14. הוסף 1 &# 956; L של נוגדן אנטי CD8α APC-מצומדות ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
  15. לקבוע את עוצמת הקרינה CFSE על CD8 + T תאים על ידי cytometry זרימה (איור 5). עוצמת CFSE היא חצוי על כל חלוקת תא. לפיכך, מספר חלוקות תא ניתן לקבוע על ידי העצמה של מכתים CFSE.

10. נויטרופילים ההגירה Assay

  1. זרעי 5x10 5 4T1 תאים במ"ל 7 מותאמים בינוני סרום מופחת בתוספת 0.5% FBS בבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים ודגירה 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. העבר את 800 μl של supernatant לתא התחתון של צלחת הגירה עם גודל נקבובית של 5 מיקרומטר.
  3. Resuspend 2 x 10 5 נויטרופילים ב400 μl של אופטימיזציה בינוני סרום מופחת בתוספת 0.5% FBS. החל ההשעיה התא לתא העליון ודגירה של 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. בסוף הדגירה, להסיר את התא העליון ולספור את מספר הנויטרופילים שהגרו לתא התחתון.

11. ניטור נויטרופילים ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS).

  1. הכן 1.1 x 10 6 / מיליליטר נויטרופילים בתמיסת מלח המאוזן של האנק ללא פנול אדום. צלחת 180 μl המכיל 2 x 10 5 נויטרופילים בכל טוב של צלחת גם 96-שטוח תחתונה לבנה.
  2. מניחים את הצלחת בקורא צלחת הארה. הוסף 20 μl של פתרון לומינול 500 מיקרומטר ב PBS היטב כל אחד כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרומטר. קראו chemiluminescence הבסיס ל1sec במהלך זמן של 5 דקות עם 10 מרווחי שניות.
  3. הוסף ממריץ (למשל, PMA בריכוז של 10 ננומטר או 100 ננומטר או fMLP בריכוז של 10 מיקרומטר). הכן פתרון מרוכז 10x של כל סוכן בתמיסת מלח המאוזן של האנק ללא פנול האדום ולהוסיף 22 μl לבארות בהתאמה. בארות לשלוט להוסיף 22 רכב μl.
  4. Measuמחדש chemiluminescence בקורא הצלחת. לעשות את שניהם ארוכות (כל 10 שניות למשך 5 דקות) קצרות ו( כל דקה לשעה 1) כמובן זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר שנערך לאחרונה זיהינו פונקציה אנטי-גרורתי לנויטרופילים 6. נויטרופילים מעכברי נושאי גידול לרכוש פנוטיפ ציטוטוקסיות ויש לו את היכולת להרוג תאים סרטניים 6. זאת בניגוד לנויטרופילים מעכברים נאיביים שאין להם השפעה אנטי-סרטנית משמעותית 6. כמה מהטכניקות המתוארות בסעיף הפרוטוקול שימש ללימוד פונקצית נויטרופילים אנטי-סרטני במבחנת in vivo 6.

ניתן להשיג נויטרופילים ציטוטוקסיות גידול מעכברי נושאי גידול 6. כדי להשיג מטרה זו, עכברים הוזרקו orthotopically עם 4T1 תאים לתוך כרית שומן השמאל מפשעתי החלב (1 פרוטוקול). ביום 21 בחיסון שלאחר גידול-, הגידול הראשוני הגיע לגודל של 1 - 2 סנטימטר 3 (איור 3 - הגידול ניכר בבטן השמאלית התחתון). בשלב זה, העכברים מורדמים ודם מיליליטר 1 נמשך (לכל עכבר)על ידי לנקב לב (איור 3). במקביל, דם מעכבר-גידול-שאינם נושאים נאיביים, נמשך. HDN אז היו מטוהר על שיפוע צפיפות (פרוטוקול 2.1 ואיור 4) להניב (> 98%) מאוכלוסייה טהורה ביותר של נויטרופילים. כדאיות נויטרופילים נקבעה על ידי צביעת Trypan הכחול (פרוטוקול 2.1). נויטרופילים אז היו resuspended באופטימיזציה בינוני סרום מופחת המכילים FBS 0.5% ב 2 x 10 6 מיליליטר / נויטרופילים.

כדי לבדוק את מידת רעילה נויטרופילים, הוספנו 10 5 נויטרופילים (50 μl מx 10 6 נויטרופילים / מיליליטר פתרון מניות 2) ללוציפראז להביע 4T1 תאי מטרה (5,000 תאים גם ב/ 100 μl) בבעלת תחתית לבנה 96 צלחת "טוב (פרוטוקול 7). בעקבות דגירה O / N, התאים נשטפו ב- PBS וlysed במאגר תמוגה התא פסיבי ופעילות לוציפראז בכל דגימה נבדקה להעריך (היקף רעיל נויטרופילים (איור 2, גידול חינם), נויטרופילים מטוהרים מעכברי נושאי גידול להראות רעיל משמעותי (איור 2, נושאת גידול).

כדי לבדוק את התכונות מדכאות החיסון בLDN וHDN השתמשנו assay התפשטות תאי T (9 לפרוטוקול). הערכנו אתמספר התאים CD8 + בsplenocytes שלא טופל ובsplenocytes שטופל בנוגדן αCD3, שהיו בתרבית לבד ותאים שהיו בתרבית בנוכחות של LDN או בנוכחות HDN (איור 5 א-ד). הערה העלייה הדרמטית בתאי CD8 + CFSE + בעקבות גירוי אנטי CD3 (השווה פנל ימני עליון בA ו- B) ההשפעה המעכבת הדרמטית של מדכא LDN (השווה פנל ימני העליון בB ו- C) וחוסר ההשפעה מעכבת של HDN (פנל D). גם הערכנו את היקף החזקת CFSE, כאינדיקציה לשגשוג. באיור 5E, העקומה הכתומה מציגה CD8 תאים שלא טופלו +, העקומה הכחולה CD8 + תאים, שטופלה בנוגדני αCD3, העקומה האדומה CD8 + תאי מגורה עם αCD3 בנוכחות LDN והעקומה הירוקה מייצג תאי CD8 + מגורה עם α; CD3 בנוכחות HDN. שים לב לשינוי שמאלה בתאים שטופלו αCD3 (העקומה כחולה) וαCD3 טופלו תאים בתרבית עם HDN (עקומה ירוקה), המצביעים על התפשטות תאי CD8 +.

איור 1
אלקטרון תמונת איור 1. נויטרופילים מורפולוגיה. תמונה מיקרוסקופית אור של צפיפות גבוהה () ונויטרופילים בצפיפות נמוכה (B) מוכתם בHematoxylin ו Eosin (H & E) הבאים הכנת תא דקה שכבה. (ג) העברת מיקרוסקופיה (TEM) של נויטרופילים בצפיפות גבוהה. בר מייצג 1,000 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור ספירת נויטרופילים 2. דם תגדל עם הגידול עמ 'rogression ונויטרופילים לרכוש פנוטיפ ציטוטוקסיות. (א) מספר נויטרופילים במחזור לכל 1 מיליליטר נספר על ידי FACS בימים שונים הבאים חיסון תאים סרטני בעכברים / ג BALB. מספר + + Ly6G נויטרופילים CD11b במחזור ברציפות עולים עם התקדמות 4T1 גידול. 4T1 תאי סרטן שד (ב) היו שיתוף תרבותיים עם נויטרופילים צפיפות גבוהים משני עכברים נאיביים (גידול בחינם) או 4T1 עכברי נושאי גידול (נושאת גידול) עכברים, או מודגרות במדיום בהעדר של נויטרופילים (המשך.) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. נויטרופילים לעכברי גידול נושאות, אבל לא מעכברים ללא גידול, להראות רעילים משמעותי לקראת 4T1 תאים סרטניים. ברים שגיאה מייצגים ± SEM ** p <0.01 באמצעות מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"איור איור 3. אוסף של דם עכברי באמצעות לנקב לב. העכבר היה מורדמים בחדר אינדוקציה תחת CO 2 זרימה איטית. מייד לאחר העכבר לקח נשימת מסופו, הוא הניח על גבה ומזרק heparinized 1 מיליליטר הוכנס בבסיס של עצם החזה עד שמגיע ללב. לאט למשוך את הבוכנה כדי לשאוב הדם. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. טיהור נויטרופילים מכל דם. () 3 מיליליטר של 1.077 / מיליליטר סוכרוז הוא שכבות ז זהירות על גבי 3 מיליליטר 1.119 g / מיליליטר סוכרוז כדי ליצור שיפוע רציף. הדם עכברי כל, מדולל PBS-BSA (0.5%) לנפח סופי של 6 מיליליטר, אז שכבות על גבי 1.077 גרם / מיליליטר סוכרוז (ב ') בעקבות ספין 30 דקות ב XG 700 ללא הפסקה, ניתן להבחין 3 ברים שונים.; R - תאי דם אדומים בגלולה, G - חלק granulocytic מכיל נויטרופילים בצפיפות גבוהה, M -. דם אדם שבריר mononuclear המכילים תאי mononuclear ונויטרופילים בצפיפות נמוכה (C) נמשך טרי מעורבב עם נפח שווה של Dextran 500 ( 3%) וטופחו על RT למשך 30 דקות. החלק העליון מכיל את תאי דם הלבנים (מעיל באפי) לאחר מכן שכבות על גבי 10 מיליליטר 1.077 g / מיליליטר סוכרוז (ד ') בעקבות ספין 30 דקות ב 400 XG ללא הפסקה, אפשר לראות 2 שברים שונים.; R + G - גלולה המכילים תאי דם אדומים ונויטרופילים בצפיפות גבוהה, M -. חלק mononuclear המכיל תאי mononuclear ונויטרופילים בצפיפות נמוכה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5
איור 5. דיכוי של התפשטות תאי T. Cytometry זרימת ניתוח המציג את מספר התאים + CD8 כותרת CFSE תרבותיים בהיעדר הגירוי (), בעקבות גירוי עם נוגדן αCD3 בהעדר (ב) או הנוכחות של LDN (C) או HDN (ד) הצגת היסטוגרמה (ה) של עוצמת CFSE בCD8 + תאים מפנלים -.. D אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים ומגישי העזרה הראשונות במקרים של זיהום ודלקת. ככזה, הם רגישים מאוד לרמזים חיצוניים ומופעלים בקלות. בנוסף, יש לי נויטרופילים מחצית חיים קצרים מאוד ותחלופה מהירה. יחד, מאפיינים אלה מעלים מספר קשיים בעבודה עם נויטרופילים, כך שאסטרטגיות ניסיוניות ייחודיות נדרשות. לדוגמא, יש כמה אסטרטגיות טיהור נויטרופילים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות.

שלב קריטי בעבודה עם נויטרופילים הוא טיהורם מכל דם. נויטרופילים ניתן יהיו לטהר ביעילות תוך שימוש במילויי צפיפות או אסטרטגיות המבוסס על נוגדן (חיוביות או שלילית בחירה). שיטת בחירה שלנו היא השימוש במילויי צפיפות שכן הוא מניב מספרים גבוהים של נויטרופילים הנקיים במיוחד עם הפעלה שאינה ספציפית מינימאלית. עם זאת, כפי שאנו מראים במחקר שנערך לאחרונה 21, שנינותנויטרופילים התקדמות גידול h מצטברים במספרים גבוהים בשבריר בצפיפות נמוכה mononuclear. בתנאים אלה את השימוש בשיפוע צפיפות מספק חלק נויטרופילים בצפיפות גבוהה טהור ביותר, שאינו מייצג את כל רפרטואר מחזור נויטרופילים, וחלק נויטרופילים בצפיפות נמוכה שמזוהם בכבדות עם תאי mononuclear אחרים (לימפוציטים ומונוציטים). בנסיבות אלה בשיטה של ​​בחירה היא טיהור מבוססת נוגדנים, רצוי סלקציה שלילית. השימוש בנוגדנים כדי לטהר נויטרופילים מניב נויטרופילים טהורים ביותר וטובים יותר מייצג את כל רפרטואר נויטרופילים במחזור. עם זאת, שמו לב שכבר נויטרופילים מודגרת עם הנוגדנים, הסיכויים לעליית הפעלה שאינה ספציפית. לכן אנו מציעים כי לתוצאות הטובות ביותר, טיהור נויטרופילים מבוסס נוגדן צריכה להתבצע במהירות אפשרית. טיהור נויטרופילים מבוססי נוגדנים היא גם שיטת הבחירה כאשר purifying נויטרופילים מרקמות או גידולים.

בלי קשר להליך הטיהור נבחר, הטוהר, כדאיות ושלמות פונקציונלית צריך להיות מוערך בקפדנות. טוהר של נויטרופילים יכול להיקבע על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים שמגיבים עם סמני משטח נויטרופילים. בעכבר, Ly-6G הוא ספציפי לנויטרופילים, המתאפיינים בשפל Ly-6C CD11b + Ly-6G + F4 / 80 - פנוטיפ. נויטרופילים אדם אינם מבטאים סמן מקביל לLy-6G ולעתים קרובות מאופיינים בביטוי של CD11b, CD15, CD16, וCD66b. מאז יש לי נויטרופילים קולטני Fc, אלה צריכים להיות חסומים לפני immunostaining. ניתן גם להבחין בין תאי דם לבנים האחרים נויטרופילים על ידי בעל SSC גבוה יותר. כדאיות צריכה להיקבע בסוף תהליך הטיהור (trypan כחול, פרוטוקול 2.1) וצריך להיות גדול באופן עקבי מ 98%. שלמות פונקציונלית צריכה להיקבע על ידי Puriשינוי מקום של נויטרופילים מעכברים נאיביים. נויטרופילים אלה לא הופעלו ולספק שליטה שאינה רעילה לתאים לנויטרופילים-entrained גידול בהגדרת שיתוף תרבות עם תאים סרטניים (פרוטוקול 7).

זמן מחצית החיים הקצרים של נויטרופילים יחד דם עם המספר הנמוך של נויטרופילים (~ 3-5 x 10 5) השיגו מ1 מיליליטר דם של 6 נאיבי - עכבר בן 8 שבוע, עשו את זה קשה לחקור פונקצית נויטרופילים דם עכבר ב מבחנה. מספרי נויטרופילים לעלות בהתמדה במדינות של דלקת ולעתים בסרטן, המייצג את המדינה של דלקת כרונית 7. כמה חוקרים ניסו למצוא מקורות חלופיים לנויטרופילים, כגון מח העצם 20. מספר גבוה של נויטרופילים עכבר ניתן לקבל בתוך 4-24 שעות לאחר הזרקת intraperitoneal של 1 מיליליטר של פתרון מרק thioglycollate 3% או 1 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר Zymosan פתרון מלוחים. אבל נויטרופילים שהושרו אלה לא להפעילניו יורק פעילות אנטי-סרטנית (תצפית לא פורסם).

. גרנות ואח '6 ציינו כי עכברי BALB / ג מחוסן orthotopically עם סרטן שד העכבר 4T1 לפתח neutrophilia שמחמיר על הזמן (איור 2 א), כך ש-20 - ניתן לבודד 40 מיליון נויטרופילים דם בקלות מהדם 1 מיליליטר 3 - 4 שבועות חיסון לאחר גידול. נויטרופילים אלה שרכשו את פעילות אנטי-סרטנית, ויש לי בהתאם לכינוי נויטרופילים-entrained גידול (עשר), כדי להבדיל אותם מנויטרופילים נאיביים (איור 2). בעוד נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN) הם מאוד אנטי-סרטניים, נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) שנוצרו בהקשר של הסרטן הם לא 21. נויטרופילים בצפיפות גבוהה ממח עצם וטחול של עכברי נושאי גידול גם פעילות אנטי-סרטני (נתונים שלא פורסמו). יש לציין כי עם התקדמות גידול הטחול המוגדל הופך בהדרגה (splenomegaly), עם בקמטי כמויות של נויטרופילים.

על מנת לעקוב אחר גורלם של נויטרופילים הבאים העברת המאמצת שלהם, אלה צריכים להיות מסומנים. יכולים להיות מתויגים נויטרופילים in vivo על ידי הזרקת bromodeoxyuridine (BrdU) לגידול נושאות או עכברים נאיביים 2 ימים לפני הבידוד. BrdU הוא אנלוגי של תימידין מבשר DNA אשר שולב לתוך ה- DNA מסונתז חדש בתאים מתרבים. במקרה של נויטרופילים, BrdU ישולב תאים מתרבים מבשר ששומרים צביעת BrdU כאשר הבחנה לתוך נויטרופילים לאחר mitotic בוגרים. BrdU המשולב יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדני ניאון אנטי BrdU ספציפיים. אז יכולים להיות מנותחים תאי BrdU + על ידי cytometry זרימה. גישה נוספת היא לתייג נויטרופילים המבודדים עם צבע גשש תא כגון אסתר N-succinimidyl 5-carboxyfluorescein (CFSE). CFSE הוא מתחם אסתר שיכול לעבור דרך קרום תא ובת קיימא. יש לו succinimid אמינו-reactiveקבוצת י"ל שמובילה לקוולנטיים המחייב של והעמסת לחלבונים וקבוצות אמינו אחרות בתא ותא השטח. ניתן לנתח את תאי שכותרתו CFSE ידי cytometry זרימה באמצעות לייזר ארגון 488 ננומטר. שתי טכניקות התיוג שונות בעובדה שתיוג BrdU תלוי בתאים מתרבים מבשר, ולא כל נויטרופילים במחזור יהיה מסומן, ואילו CFSE יכתים את כל נויטרופילים. איתור של CFSE הוא יותר פשוט מאשר צביעת BrdU, אולם תיוג BrdU הוא אמצעי טוב למעקב בשלה להתבגר המרת נויטרופילים.

יש לנו גם תיארו כמה שיטות כדי לקבוע את הפונקציה אנטי-סרטנית ואנטי-גרורתי של נויטרופילים. אלה כוללים דלדול נויטרופילים, העברת מאמצת נויטרופילים, מבחן נטרול גידול וגרור ריאות זריעת assay. כל אחד מהמבחנים הללו משיג היבט מסוים של פונקציות נויטרופילים אנטי-סרטניים. לדוגמא, גרנות ואח '. 6 ציינה כי על DEPletion של נויטרופילים, מספר גרורות ריאות ב4T1 עכברי נושאי גידול גדל, דבר המצביע על תפקיד אנטי-גרורתי של נויטרופילים. עם העברת מאמצת נויטרופילים, התאים הסרטניים מוזרקים לוריד 4 שעות לפני ההזרקה של HDN המטוהר. היכולת של התאים הסרטניים כדי ליצור גרורות ריאות וכבד הם מיושמים במחקר בזמן כמובן באמצעות in vivo מערכת הדמיה אופטית. עכברים שקיבלו HDN הראו מוקדים גרורתי פחות מאשר עכברי שליטה 6. במבחן נטרול הגידול, תאי הגידול מוזרקים מתחת לעור עם או בלי HDN, הנוכחות של HDN מפחיתה את צמיחת גידול 21. בassay הזריעה גרורתי, תאים סרטניים שכותרת GFP מוזרקים לוריד לשליטה או עכברי נושאי גידול טרום גרורתי מדולדל נויטרופילים, ואת היכולת של התאים שכותרת GFP זרע בריאות נקבעה. הריאות של עכברי נושאי גידול טרום גרורתי מתאפיינות בחדירת נויטרופילים גבוהה המונעת גידולזריעת תאים באיבר הספציפי 6. זה מתורגם למוקדים גרורתי יותר בעכברים מדולדלים נויטרופילים בהשוואה לעכברי נושאי גידול שליטה.

הפרוטוקולים מתוארים דגש על לימוד פונקצית נויטרופילים בהקשר של הסרטן ולספק אסטרטגיות להעריך מאפייני נויטרופילים הקשורים לסרטן הן במבחנה in vivo. עם זאת, אסטרטגיות טיהור נויטרופילים, כמו גם חלק מהפרוצדורות המתוארות עשוי לשמש ללימוד פונקצית נויטרופילים במגוון רחב של הגדרות ניסיוניות שבי נויטרופילים לשחק תפקיד קריטי (כלומר, דלקת וזיהום).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ZG נתמך על ידי מענקים מתכנית I-CORE של הקרן הלאומית למדע (מס '41/11 גרנט), הקרן אביש-פרנקל, נאמנות Rosetrees, למלחמה בסרטן קרן המחקר (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס) ו בסיס לדאגה. ZGF נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית לחקר הסרטן (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס), מדען הראשי של משרד בריאות הישראלי וישראל איגוד הריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics