Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories
Bioengineering
 

Summary

Vi har udviklet en øjenirritation test, som udnytter en tredimensional rekonstrueret human cornea-lignende epitelial (RHCE) væv model. Testen er i stand til at skelne mellem okulær lokalirriterende og ætsende materialer (GHS kategori 1 og 2 kombineret), og dem, der ikke kræver mærkning (GHS ingen kategori).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaluzhny, Y., Kandárová, H., d’Argembeau-Thornton, L., Kearney, P., Klausner, M. Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model. J. Vis. Exp. (102), e52979, doi:10.3791/52979 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

For at overholde den syvende Ændring af kosmetikdirektivet og EU REACH-lovgivningen EU, er der behov for validerede uden dyreforsøg alternative metoder til pålidelig og præcis vurdering af okulær toksicitet i mennesket. For at imødekomme dette behov, har vi udviklet en øjenirritationsprøve (EIT), som udnytter en tredimensional rekonstrueret human cornea-lignende epitelial (RHCE) væv model, der er baseret på normale humane celler. EIT er i stand til at adskille okulære irriterende stoffer og ætsende (GHS kategori 1 og 2 kombineret), og dem, der ikke kræver mærkning (GHS ingen kategori). Testen benytter to separate protokoller, hvoraf den ene er beregnet til flydende kemikalier og en anden, lignende protokol til faste testartikler. ETI forudsigelsesmodel anvender en enkelt eksponering tidsrum (30 min til væsker, 6 timer for faste stoffer) og en enkelt vævslevedygtighed cut-off (60,0% som bestemt ved MTT-assayet). Baseret på resultaterne for 83 kemikalier (44 væsker og faste stoffer 39) EIT opnåede 95,5 / 68,2 / 81,8% og sensitivity / specificitet og nøjagtighed (SS & A) for væsker, 100,0 / 68,4 / og 84,6% SS & A for faste stoffer, og 97,6 / 68,3 / og 83,1% for den samlede SS & A. EIT vil bidrage væsentligt til at kvalificere øjenirritation potentialet i en bred vifte af flydende og faste stoffer uden brug af dyr til at opfylde regulatoriske testkrav. Den EpiOcular EIT-metoden blev implementeret i 2015 i OECD Test Guidelines som TG 492.

Introduction

Forbrugerprodukter såsom kosmetik, rengøringsmidler og rengøringsmidler omfatter en lang række kemikalier, som kan fremkalde alvorlige skader, hvis de kontakter øjnene. Derfor er afprøvning af disse agenter for øjenirritation kræves af reguleringsorganer USA og EU til at sikre forbrugernes sikkerhed 1. En vurdering af øjenirritation potentiale blandinger og formuleringer er også et krav for at overholde REACH (registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier) lovgivning for mærkning af kosmetiske ingredienser i henhold til direktiv EU kosmetik til transport af kemikalier, og for mærkning af pesticider og husholdningsprodukter 2. I øjeblikket reguleringsorganer kræver okulær farevurdering hjælp af globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) 3. GHS er hovedsageligt baseret på Draize øjenirritation test, den mest udbredte øjenirritation assay, hvor fremmede stoffer og midriftsmateriel indføres direkte i den konjunktivale sæk i kaninøjne 4. Ifølge GHS-klassificering, GHS kategori 1 (okulære ætsende stoffer) henviser til at teste kemikalier, der forårsager alvorlige indledende skade øjet væv eller alvorlig skade på øjet og vision, som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter eksponering 3,5. GHS kategori 2 henviser til at teste kemikalier, der producerer væsentlige ændringer i øjet, der er fuldt reversible inden for 21 dage eksponering. Test kemikalier, som ikke er ætsende eller irriterende stoffer benævnes GHS Kategori.

I mere end 40 år har Draize kaninøje test blevet kritiseret for sin manglende reproducerbarhed, overvurdering af menneskelige reaktioner, og brugen af levende dyr 5-8. Disse bekymringer har tilskyndet mange forslag til raffinement, reduktion, og udskiftning af in vivo-test 9. Behovet for validerede alternativer uden dyreforsøg blev yderligere styrketmed vedtagelsen af det syvende Ændring af kosmetikdirektivet, som forbød anvendelsen af dyr i sikkerhedsvurdering af kosmetiske produkter (i 2005) og ingredienser (i 2009) 2.

Siden 1996 har rekonstrueret hornhinde-lignende væv model er ofte blevet brugt af kosmetikindustrien at evaluere irritationspotentiale af råvarer, overfladeaktive-baserede formuleringer, og forværres blandinger, der er designet til brug i eller i nærheden af, øjet 10-13. Anvendelse af RHCE vævsmodellen giver mulighed for direkte topisk påføring af testmaterialet på vævsoverfladen i dets native, ufortyndet form. På denne måde kan ikke-vandopløselige formuleringer afprøves uden at fortynde dem med opløsningsmidler. Som svar på EURL ECVAM s (EU-referencelaboratoriet Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder) anmodning om en bredt anvendelig, ligetil og økonomisk metode øjenirritationsprøve (EIT), som anvender en enkee eksponeringstid og er i stand til at adskille okulære irriterende og ætsende af materialer, der ikke kræver mærkning blev udviklet (figur 1) 14. Baseret på resultaterne for 83 kemikalier (44 væsker og 39 faste stoffer), opnåede EIT 95.5 / 68.2 / og 81,8% sensitivitet / specificitet og nøjagtighed (SS & A) for væsker, 100,0 / 68,4 / og 84,6% SS & A for faste stoffer, og 97,6 / 68.3 / og 83,1% for den samlede SS & A.

I 2007, en multi-laboratorium pre-validering undersøgelse sponsoreret af Kosmetik Europe (tidligere Colipa) i regi af den EURL ECVAM vurderede relevansen og pålideligheden af ETI med det mål at bringe den til formel validering 15. I denne undersøgelse blev 298 uafhængige forsøg udført i syv uafhængige laboratorier. Undersøgelsens resultater viste, 99,7% aftale forudsigelse med lave variationskoefficienter på tværs af alle deltagende laboratorier 15. Som et resultat, i 2010 ETI protokol indtastet en formel EURL ECVAMvalidering program. Valideringsundersøgelsen udnyttet 104 kodede test kemikalier, herunder individuelle stoffer og kemiske blandinger, for hvilke in vivo-referencedata (Draize øjenirritation data) var til rådighed. Baseret på succesen af ​​dette arbejde blev en OECD udkast test guideline fremlagt i 2014. Det forventes, at ETI vil bidrage væsentligt til klassificering af øjenirritation potentialet i en bred vifte af materialer ifølge FN GHS klassificering og mærkning system.

Protocol

1. Fremstilling af RHCE væv til behandling - Dag 0

  1. Ved modtagelse af den kommercielle menneskelige hornhinde-lignende epitelial (RHCE) kit, find ud af alle kit komponenter til integritet (for kit detaljer se Standard Assay Kit Components (tabel 1) og udstyr og materialer, der er nødvendige for at udføre EIT assay (Tabel 2). På dagen for modtagelsen, i ligevægt væv (i sin 24-godt skibsfart container) til RT i 15 min.

Beløb Reagens Betingelser Kilde Beskrivelse Udløbsdato
1 Sealed 24-brønds plade af EpiOcular væv
(OCL-200)
2-8 ° C Mattek Indeholder 24 Tissdier af cellekultur indsætter, pakke på agarose 72 timer
1 flaske,
200 ml
EpiOcular assaymedium
(OCL-200-ASY)
2-8 ° C Mattek DMEM medium baseret 21 dage
1 flaske,
100 ml
Ca ++ Mg ++-Free Dulbecco PBS (DPBS) RT Sigma-Aldrich, D5652, eller ækvivalent. Bruges til at skylle indstik 1 år
4 6-brønds plader RT Falcon Benyttes til opretholdelse af væv under assayprotokollen NA
2 Plader med 12 brønde RT Falcon Bruges under assayprotokollen NA
2 Plader med 24 brønde RT Falcon Bruges til at udføre MTT assay NA
1 hætteglas,
0,5 ml
Methylacetat
(CAS # 79-20-9)
RT Sigma-Aldrich,
Cat # 186.325
Anvendes som PC i assayet 1 måned

Tabel 1: Standard Assay Kit Components.

<td> Brug som NC
/ Materiale Nødvendig for:
Befugtet inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ± 10% fugtighed) Inkubere væv før og under analyser
Laminar flow hætte Sikker arbejde under sterile forhold
Vakuumpumpe (valgfrit) Sugning mellemstore og løsninger
Pladelæser fotometer (for 96-brønds plader) Reading OD
Pladeryster Uddragion af formazan
Sterile, stumpe kanter pincet Håndtering væv indsatse
Stop-ure Tidsfrist for anvendelse af testmaterialer og andre tidsindstillede trin i protokollen
Vandbad (37 ± 1 ° C) Opvarmning medier og MTT-opløsning
Morter og støder Slibning granulære faste stoffer
Positiv fortrængning pipette (50 pl) Anvendelse af tyktflydende og halvfaste materialer og suspensioner
Justerbare pipetter (200 pi-2 ml) Anvendelse af flydende materialer, assaymedium og MTT
Pre-steriliserede tips (200 pi og 20 pi), Rainin Cat # HR-200F og HR-20F (eller tilsvarende) Anvendelse af flydende materialer, assaymedium og MTT
Wide orifice præ-steriliseret tips (250 pi), Rainin Cat # HR-250WS (eller ækvivalentrende) Anvendelse af tyktflydende og halvfaste materialer og suspensioner
8 oz / 220 ml prøvebeholdere, Falcon Cat # 3.540.200 (eller tilsvarende) Skylning væv
Sterile engangssprøjter (f.eks 1 ml tuberkulin sprøjte Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, kat. Nr 9161406V) Levering af ~ 50 mg faste materialer (valgfrit)
Ted Pella mikro spatel / ske, Ted Pella Inc., Cat # 13504 (eller tilsvarende, skarpe ske eller knogle curette, f.eks Aesculap, No: FK 623) Levering af ~ 50 mg faste materialer
Ca ++ og Mg ++ fri Dulbeccos phosphatbufret saltvand (Ca ++ Mg ++ Free-DPBS): Sigma-Aldrich, kat # D5652 (eller tilsvarende) Skylning væv under assay
Sterilt deioniseret vand, vævskulturkvalitet (kvalitet biologiske eller tilsvarende)
96-brønds fladbundede plader, Falcon (eller tilsvarende) Til læsning OD
Vatpind swaps (steril) Til tørring af vævet overflade (valgfrit)
Klæbende tape eller Parafilm Dækker plader under formazan udvinding
MTT-100 assaykittet Indeholder MTT-thiazolyl-tetrazolium bromid reagens (Sigma # M-5655) og isopropanol ekstrakt.

Tabel 2: Udstyr og materialer, der er nødvendige for at udføre ETI.

  1. Under sterile forhold, skal du åbne plastikpose med 24-brønds plade med RHCE væv og fjern steril gaze. Undersøg alle væv for luftbobler mellem agarosegelen og indsæt. Brug ikke kulturer med luftbobler under indsatsen dækker> 50% af indsatsen området, defekte væv, eller væv whi ch er helt dækket med væske.
  2. Mærke de 6-brønds plader med testen artikel eller kontrol koder og eksponeringstider. Alikvote 1,0 ml assaymedium (leveret med kittet), opvarmet til ca. 37 ° C, i brøndene på præ-mærkede 6-brønds plader.
  3. Brug steril pincet til at fjerne hver indsats, der indeholder RHCE væv og placere indsatsen i det mærkede 6-brønds plade. Under dette trin, fjernes eventuelt resterende forsendelse agarose, der klæber til ydersiden af ​​indsatsen ved forsigtig blotting på sterilt filtrerpapir. Slip eventuelle luftbobler fanget under indlæggene.
  4. Præinkuberes de RHCE væv i 6-brønds plader til standard dyrkningsbetingelser (SCC, befugtet atmosfære med 5 ± 1% CO2 ved 37 ± 1 ° C) i 1 time.
  5. Efter 1 time erstatte assaymedium med 1,0 ml frisk assaymedium forvarmet til 37 ° C, og inkuber RHCE væv på SCC betingelser (natten = O / N) (16-24 timer).
. ove_title "> 2 Forbehandling - Dag 1

  1. Efter O / N inkubation anvendes 20 pi Ca2 + Mg2 + -fri-Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS, forudsat) under anvendelse af en passende pipetteindretning. Hvis DPBS ikke spredt over væv, tryk forsigtigt indsatsen på pladen for at sikre, at de DPBS befugter hele vævet overflade.
  2. Inkubér RHCE væv hos SCC i 30 ± 2 min.
    Bemærk: Dette trin er nødvendigt for vævshydrering og at efterligne in vivo betingelser.

3. testmateriale Procedurer Eksponering

  1. Anvend hver test artikel og kontroller at duplikere RHCE væv (n = 2). Testartiklen doseringsproceduren er forskellig for væsker og faste stoffer. Topisk anvendelse 50 pi flydende prøve artikler med en pipette. Eksponeringstiden for væsker er 30 min. Anvend 50 mg fast testartikler ved hjælp af en nivelleret skefuld (kalibreret til at holde 50 mg natriumchlorid). Exeksponeringen tid for faste stoffer er 6 timer.
    Bemærk: Væsker defineres som flydende stoffer (f.eks væsker, geler og cremer), der kan anvendes ved anvendelse af en pipetteindretning. Faststoffer er defineret som ikke-flydende stoffer (f.eks pulvere, harpikser eller voksagtige materialer), der ikke kan anvendes ved hjælp af en pipette.
    1. Hvis den fysiske tilstand af prøveemner er ikke let at afgøre, placere hætteglas med testartiklen i et vandbad i 15 minutter (37 ° C). Følg EIT protokol for væsker til disse test artikler, der bliver flydende ved 37 ° C.
    2. Brug en fortrængningspumpe pipette til særligt viskose materialer.
  2. Dosere den negative kontrol og positive kontroller først og derefter dosere teststofferne.
    1. Anvend 50 pi af den negative kontrol (NC) og den positive kontrol (PC) til RHCE væv ved hjælp af en standard pipette. NC er sterilt deioniseret vand; PC'en er methylacetat (CAS # 79-20-9). Påfør NC og PC i 30 min, når testing flydende testartikler og i 6 timer ved test af faste test artikler.

4. Test Artikel Eksponering - Dag 1

  1. Til behandling af flydende prøve artikler, følg timing tidsplan givet i tabel 3. Lad 1 min intervaller mellem anvendelser af hver test artikel for at sikre lige eksponering for alle væv.
    1. Efter 30 ± 2 min DPBS forbehandling, topisk anvendelse 50 pi NC og PC, og hver flydende prøve artiklen topisk på de RHCE væv under anvendelse af en passende pipetteindretning.
    2. Anvend 50 pi af flydende prøve artiklen direkte på vævet til at dække den øvre overflade. Skær den smalle punkt i pipettespidsen at udvide åbningen for viskose materialer. For meget viskose materialer, anvendes testen artikel til en doseringsindretning (en flad overskriften cylinder med en diameter lidt mindre end den indvendige diameter af vævet indsatsen eller en plastik Kortnål), invertere dosering device og placere den på vævet, således at testen artiklen jævnt kontakter vævet overflade.
    3. Hvis testen artikel ikke spredt over vævet, skal du trykke forsigtigt indsatsen for at sikre, at det breder sig på hele væv overfladen. Mekanisk spredning af test- artikler (f.eks, med en pipettespids) kan ikke anbefales, da det kan ødelægge væv.
    4. Inkubér væv på SCC i 30 ± 2 minutter.
  2. Til behandling af faste testartikler - Dag 1 Følg timingen tidsplanen angivet i tabel 4 Lad 2 min intervaller mellem anvendelser af hver test artikel for at sikre lige eksponering for alle væv..
    1. Efter 30 ± 2 min DPBS forbehandling, gælder 50 pi NC og PC topisk på RHCE væv under anvendelse af en passende pipetteindretning.
    2. Til faste testartikel anvendelse, fjernes indsatserne (n = 2) fra brønden og placerer dem på en steril overflade (f.eks låg amultiwell pladen) for at undgå en testartikel spilde i mediet.
    3. Ved hjælp af en nivelleret spoon, topisk anvendelse cirka 50 mg af testartiklen på vævsoverfladen; sørge for, at overfladen af ​​vævet er helt dækket af testartiklen. Hvis testen artiklen ikke spredes på tværs af vævet, ryste indsatsen forsigtigt fra side til side for at sikre, at vævet er helt dækket af testartiklen. Mekanisk spredning af test- artikler (f.eks, med en pipettespids) kan ikke anbefales, da det kan ødelægge væv.
      1. Hvis det er nødvendigt, male krystallinsk pulver med en morter og støder for at sikre en bedre kontakt mellem testartiklen og vævet.
      2. Alternativt sted pulvere direkte på vævskultur inden i indsatsen ved hjælp af en 1 ml sprøjte med hovedet skåret af. Stuff pulvere ind i sprøjten, når stemplet trækkes tilbage og derefter anvende ved at trykke stemplet ned.
      3. Hvis den ydre væg af indsatsen er Contaminated fx ved pulvere, tørre partiklerne med en steril gaze.
    4. Efter dosering, returnere væv til 6-brønds plader indeholdende dyrkningsmedium og inkuberes ved SCC i 6 timer ± 15 min.

5. Skylning

  1. Forbered et sæt af tre rene bægre (150 ml kapacitet) pr test artiklen og fylde hver af dem med 100 ml DPBS. For hver test artiklen, udnytte et andet sæt på tre bægre.
  2. Ved afslutningen af ​​30 ± 2 min udsættelse for flydende materialer eller 6 timer ± 15 min eksponering til faste materialer, fjernes og kasseres doseringsindretningen, hvis det blev brugt.
  3. Løft indsatserne indeholdende RHCE væv ud af mediet ved at gribe den øvre kant af plasten 'krave "med fine tænger. Brug buede pincet til at lette håndtering og dekantering. Skyl vævet to ad gangen ved at holde de dublerede indsatser sammen af ​​deres kraver hjælp pincet. Vær forsigtig nOT at beskadige væv med pincet.
  4. Dekanteres de prøveemner eller kontrol fra vævsoverfladen på et rent absorberende materiale (papir håndklæde, gaze, etc.)
  5. Dyp indsatserne i den første bæger af DPBS, hvirvel i en cirkulær bevægelse i DPBS i ca. 2 sek, løft indsatserne, så de er for det meste fyldt med DPBS, og dekanteres væsken tilbage i bægeret. Gentag denne proces tre gange i den første bægerglas.
  6. Skyl indsatserne i den anden og tredje bægerglas DPBS tre gange hver på samme måde.
  7. Dekanteres væske tilbage i indsatsen på det absorberende materiale. Drej indsatsen til en omtrentlig 45 ° vinkel (åbne ende ned) og tryk på overlæben til det absorberende materiale.
    Bemærk: Hvis det ikke er muligt at fjerne alle de synlige testmateriale, bør yderligere skylning gøres for at undgå vævsbeskadigelse på grund af overdreven håndtering.

6. Post-suge

  1. Efter skylning,straks fordybe væv i 5 ml assaymedium tidligere opvarmet til stuetemperatur i en præ-mærket 12-brønds plade.
  2. Inkubér væv til 12 ± 2 min for flydende materialer eller 25 ± 2 min for faste materialer nedsænket ved stuetemperatur for at lette fjernelse af enhver resterende testartikel.

7. Post-inkubation

  1. Ved afslutningen af ​​Post-Soak nedsænkningsperiode, dekanteres assaymedium fra væv og duppes indsatserne på et absorberende materiale.
  2. Overfør indsatserne i præ-mærkede 6-brønds plade indeholdende 1 ml varmt assaymedium.
    1. Inkubér væv til 120 ± 15 min ved SCC for flydende testmaterialer.
    2. Inkuber vævene i 18 ± 0,25 timer ved SCC til faste testmaterialer.

8. MTT Levedygtighed Assay - Dag 1 (Protokol til væsker) og Dag 2 (Protokol for Solids)

  1. Udfør MTT-assayet efter Post-Inkubation af 12077; 15 min til væsker og 18 ± 0,25 timer for faste stoffer, hhv.
  2. Forbered 1,0 mg / ml MTT-opløsning og 0,3 ml alikvot af opløsningen i hver brønd på en præ-mærket 24-brønds plade.
    1. Brug den kommercielle MTT kit (tabel 5):
    2. 2 timer inden brug, tø MTT koncentratet ved stuetemperatur. Kombiner 2 ml af MTT koncentrat og 8 ml MTT fortyndingsmiddel til frembringelse af 1,0 mg / ml MTT-opløsning.
    3. Opbevar MTT-opløsning ved 4 ° C i mørke indtil brug. Opbevar ikke MTT løsning til mere end 1 dag.
  3. Ved afslutningen af ​​Post inkubation fjernes hver indsats fra 6-brønds plade og forsigtigt blot med et absorberende materiale.
  4. Placer indsatserne i 24-brønds plade indeholdende 0,3 ml MTT-opløsning. Slip eventuelle luftbobler fanget under indlæggene. Inkubér pladen i 180 ± 10 minutter ved SCC.
  5. MTT udvinding
    1. Efter 180 ± 10 min inkubation i MTT-opløsning, fjerne hver indsatsfra 24-brønds plade og duppes bunden af ​​indsatsen på et absorberende materiale.
    2. For ikke-farvende flydende prøve artikler (neddykket udvinding): Overfør indsatserne i en præ-mærket plade med 24 brønde indeholdende 2,0 ml af en opløsning ekstraktionsmiddel (isopropanol), så den dykker indsatsen.
    3. For faste stoffer og flydende farvestoffer (ikke-neddykket ekstraktion for at undgå forurening af ekstraktionsmiddel opløsning): Overfør indsatserne i en præ-mærket 6-brønds plade indeholdende 1,0 ml ekstraktionsmidlet opløsning (isopropanol), så den ikke nedsænkes indsatsen.
      Bemærk: Udfør den samme ikke-neddykket udtræk for de tilsvarende negative og positive kontroller.
  6. Forsegl pladerne (f.eks med parafilm mellem pladen dæksel og overkanten af brøndene eller med en standard pladeforsegler). Placer pladerne på en orbital pladeryster og omrystes i 2 til 3 timer ved stuetemperatur for at ekstrahere MTT.
    1. Alternativt, udføre udvinding O / N ved 2-876; C i mørke uden omrystning.
  7. For ikke-farvende flydende prøve artikler (neddykket udvinding): Ved afslutningen af ​​ekstraktionen periode dekanteres væsken fra hver indsætte tilbage i brønden og kassér skær med de RHCE væv.
    1. Bland ekstraktopløsningen og overføre to 200 pi alikvoter i de relevante brønde i en præ-mærket 96-brønds plade ifølge pladen konfiguration (figur 2).
  8. For faste stoffer og flydende farvestoffer (ikke-neddykket udvinding): Ved slutningen af ​​udvinding periode, kassere væv (sørg for ikke at gennembore vævene).
    1. Tilsæt 1,0 ml ekstraktionsmidlet opløsning i hver brønd af 24-brønds plade indeholdende ekstraheret fra væv opløsning. Bland ekstraktionsmidlet opløsning og overføre to 200 pi alikvoter i de relevante brønde i en præ-mærket 96-brønds plade ifølge pladen konfiguration (figur 2).
  9. Bestem tHan optiske densitet (OD) af de ekstraherede prøver ved en enkelt bølgelængde mellem 550 og 590 nm (bør være konsistente inden for en laboratorium) på en plade-læser eller et spektrofotometer.
    1. I tilfælde af uklare ekstraktopløsninger forårsaget af uopløselige faste stoffer, centrifugeres opløsningerne forud for måling af OD (køle centrifugen til 4 ° C for at undgå fordampning). I tilfælde skylning fjerner ikke testen artiklen (TA) og TA forstyrrer MTT reduktion, skal yderligere kontroller anvendes. Der henvises til en detaljeret SOP at korrigere for MTT reduktion 16.
    2. I tilfælde a TA er vist at have eller udvikle farve, der kan interagere med MTT måling, skal en yderligere test udføres for at bestemme mængden af ​​farve bundet til, og efterfølgende ekstraheret fra væv. Der henvises til en detaljeret SOP at korrigere for farvede testartikler 16.

9. Beregninger for Tissue Levedygtighed Test (tabel 6 og figur 3) & #160;

  1. Generelle beregninger
    1. Beregn den gennemsnitlige OD værdi af de tomme kontrolbrønde (OD Blk) for hvert forsøg.
    2. Trække OD Blk fra hver OD-værdien for det samme forsøg (Blk korrigerede data).
    3. Beregn middelværdien af ​​de to portioner for hver væv (= korrigeret OD).
  2. Beregn procent levedygtighed hver af de to gentagne væv for hver kontrol- og test artiklen i forhold til den gennemsnitlige negative kontrol (100% kontrol).
    Levedygtighed (%) = [korrigeret OD behandlede væv / korrigeret OD negative kontrol] x 100%
  3. Beregn forskellen på levedygtigheden (levedygtighed forskellen mellem to gentagne væv).
  4. Beregne middelværdien testartikel levedygtighed (TA levedygtighed) og klassificere prøven artikel ifølge forudsigelsesmodel.

10. prognosemodel (figur 3)

  1. Hvis TA-behandlede væv levedygtighed er> 60,0 i forhold til NC-behandlede væv viability, mærke testen artiklen som ikke irriterende (NI) (GHS Kategori).
  2. Hvis TA-behandlede væv levedygtighed ≤ 60,0 i forhold til NC-behandlede væv levedygtighed, mærke testen artiklen som lokalirriterende (I) (GHS kategori 1 og 2).
    Bemærk: EIT testresultater De betragtes kvalificeret, hvis:
    • EIT NC OD den> 0,8 og <2,5;
    • EIT PC væv levedygtighed på (%, i forhold til NC), er ≤50.0%;
    • forskellen mellem de to gentagne væv (NC, PC, og test article) er <20,0%.

Representative Results

Repræsentative ETI resultater udført med 10 teststofferne (TA) og negative og positive kontroller er vist i tabel 6 og figur 3. Den gennemsnitlige OD = 1,31 for NC svarer til 100% vævslevedygtighed derfor PC'en (gennemsnitlig OD = 0,41) havde vævs relative levedygtighed på 31,2%. Når ETI protokol blev udført i 15 gyldige uafhængige forsøg i 7 laboratorier ved hjælp af den flydende eksponering protokol og i 8 uafhængige gyldige eksperimenter i 4 laboratorier ved hjælp af eksponeringen protokollen fast, den gennemsnitlige væv levedygtighed for pc'en ved hjælp af flydende protokol var 36,4 ± 4,0 % og 32,3 ± 6,4% for protokollen faste stoffer. I alle tilfælde de positive kontrolresultater lå under afskåret værdi på 60,0% 15.

Som vist i figur 3, TA1, TA2, TA4, TA7 og TA8 havde væv levedygtighed> 60,0% og blev derfor klassificeret som "NI". TA3, TA5, TA6, TA9, og TA10 havde væv levedygtighed X04, 60.0%, og derfor blev klassificeret som "I". Forskellen på levedygtighed væv mellem dublerede væv var <20,0% for alle AT'er med en undtagelse af TA2. Derfor resultater for alle de test artikler, med en undtagelse af TA2, blev anset for "kvalificeret", da de mødtes alle EIT acceptkriterier (afsnit 10.2) de. På grund af høj variabilitet mellem dobbeltbestemmelser væv til TA2 i den indledende eksperiment, var nødvendig for at opnå kvalificerede EIT resultater et andet eksperiment.

EIT testmetode som beskrevet heri udnytte RHCE vævet modellen blev brugt til vurdering af øjenirritation i flere multilaboratory valideringsundersøgelser, herunder formel validering af EURL ECVAM / Kosmetik Europe 15,17-19. I alle undersøgelserne blev ETI vist sig at være reproducerbar og var i stand til korrekt at identificere kemikalier (både stoffer og blandinger) ikke kræver klassificering og mærkning for øjenirritation eller alvorlig øjenskade acCording til UN GHS 15,17-19. EIT testmetode opfyldte acceptkriterier for Validering Management Group (VMG) for øjenirritation for følsomhed, specificitet, og den samlede nøjagtighed og i øjeblikket er det afventer formelle gennemførelse som en delvis erstatning for in vivo-kanin Draize test 19.

Figur 1
Figur 1: Oversigt over ETI protokol for flydende og faste testartikler Forkortelser anvendt: AM, assaymediet;. SCC, standard dyrkningsbetingelser; PBS Dulbeccos phosphatbufret saltvand; RT stuetemperatur.

Figur 2
Figur 2:. Den standardiserede 96-brønds plade konfiguration for MTT vævslevedygtighed test To 200 pi alikvoter transferred til de relevante brønde i en præ-mærket 96-brønds plade. Anvendte forkortelser: NC, negativ kontrol; PC, positiv kontrol; TA1-TA20, testartikler 1-20; Blank, ekstraktionsmiddel løsning. 96- MTT plade konfiguration anvendes med Excel-regneark designet til at beregne RHCE væv levedygtighed og ETI resultater.

Figur 3
Figur 3: EIT resultater opnået for 10 test artikler, NC og pc kontrol ved hjælp af RHCE vævsmodellen Grafen er genereret fra et Excel-regneark designet til at præsentere ETI resultater.. Test kemikalier, som reducerede levedygtighed væv ≤ 60,0% i forhold til NC er klassificeret som lokalirriterende ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 og TA10) og teste kemikalier, som havde vævslevedygtighed> 60,0% er klassificeret som ikke-Irritanter (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 og TA8).

Start tid for EIT protokol arbejdstrin de (én dags arbejde for én operatør)
Hver linje svarer til et par af væv
Rækkefølge af trin: 1 2 3 4 5 6 7
Væsker: PBS TA
Eksponering
Post-
Soak
Post-
MTT
Reaktion
MTT
Ekstraktion
Mål
30 min 30 min 12 min 120 min 180 min 120 min OD
NC 09:00 09:30 10:00 10:12 00:12 15:12 efter
PC 09:01 09:31 10:01 10:13 00:13 15:13 17:30
TA-1 09:02 09:32 10:02 10:14 00:14 15:14
TA-2 </ strong> 09:03 09:33 10:03 10:15 00:15 15:15
TA-3 09:04 09:34 10:04 10:16 00:16 15:16
TA-4 09:05 09:35 10:05 10:17 00:17 15:17
TA-5 09:06 09:36 10:06 10:18 00:18 15:18
TA-6 09:07 09:37 10:07 10:19 00:19 15:19
TA-7 09:08 09:38 10:08 10:20 12:20 15:20
ng> TA-8 09:09 09:39 10:09 10:21 00:21 15:21
TA-9 09:10 09:40 10:10 10:22 00:22 15:22
TA-10 09:11 09:41 10:11 10:23 00:23 15:23

Tabel 3:. Prøve tidsplan for testning af flydende testartikler protokol, herunder pre-fugte vævet med DPBS, Anvendelsen af Test Artikler (TAS), Skylning og Post-suge, Post-inkubationstid, MTT assay, Udvinding af MTT, og måling af MTT OD præsenteres i kolonner. Tider for de dublerede væv er organiseret i rækker. Hele assay test 10 AT'er og kontroller kan være færdig på én dag.

e_content ">

Start tid for EIT protokoltrin (2 dage arbejder for én operatør)
Hver linje svarer til et par af væv
Dag 1 Dag 2 (næste dag)
Rækkefølge af trin: 1 2 3 4 5 6 7
Tørstof: PBS TA
Eksponering
Post-
Soak
Post-
Incubaction
MTT
Reaktion
MTT
Ekstraktion
Mål
30 min 6 timer 26 min 18 timer 180 min 120 min OD
NC 09:00 09:30 15:30 15:56 09:56 00:56 efter
PC 09:02 09:32 15:32 15:58 09:58 00:58 15:30
TA-1 09:04 09:34 15:34 16:00 10:00 13:00
TA-2 09:06 09:36 15:36 16:02 10:02 13:02
TA-3 09:08 09:38 15:38 16:04 10:04 13:04
TA-4 09:10 09:40 15:40 16:06 10:06 13:06
TA-5 09:12 09:42 15:42 16:08 10:08 </ td> 13:08
TA-6 09:14 09:44 15:44 16:10 10:10 13:10
TA-7 09:16 09:46 15:46 16:12 10:12 13:12
TA-8 09:18 09:48 15:48 16:14 10:14 13:14
TA-9 09:20 09:50 15:50 16:16 10:16 13:16
TA-10 09:22 09:52 15:52 16:18 10:18 13:18

Tabel 4: Prøve tidsplan for testning af faste testartikler. Protokol, herunder pre-fugte vævet med DPBS, Anvendelsen af Test Artikler, Skylning og Post-suge, Post-inkubationstid, MTT assay, Udvinding af MTT, og måling af MTT OD præsenteres i kolonner. Tider for de dublerede væv er organiseret i rækker. Hele analysen teste 10 AT'er og kontroller udføres over en to dages periode.

Beløb Reagens Opbevaringsbetingelser Kilde Beskrivelse Udløbsdato
1 hætteglas,
2 ml
MTT Concentrate (MTT-100-CON) Beskyttet mod lys (-20ºC) Mattek Frosne MTT koncentrat 2 måneder
1 hætteglas,
8 ml
MTT fortynder 2-8 &# 186; C Mattek Til fortynding MTT koncentrat før anvendelse i MTT-assayet 2 måneder
1 flaske,
60 ml
Isopropanol
(CAS # 67-63-0)
RT Sigma-Aldrich Ekstraktionsmiddel løsning NA

Tabel 5: MTT-100 Assay Kit Components.

Kode N ° Væv Rådata Blank korrigerede data gennemsnit af OD % Af levedygtighed
n Aliq. 1 Aliq. 2 Aliq. 1 Aliq. 2
NC 1 1,316 1,352 1,316 1,352 1,334 101.6
2 1,277 1,309 1,277 1,309 1,293 98,4
PC 1 0,379 0,397 0,379 0,397 0,388 29,6
2 0,419 0,442 0,419 0,442 0,431 32,8
TA1 1 1,213 1,244 1,213 1,244 1,229 93,5
2 1,355 1,355 1,355 1,355 1,355 103.2
TA2 1 1.210 1,122 1.210 1,122 1,166 88.7
2 0,828 0,837 0,828 0,837 0,833 63,4
TA3 1 0,167 0,168 0,167 0,168 0,167 12.7
2 0,138 0,136 0,138 0,136 0,137 10.4
TA4 1 1,137 1.160 1,137 1.160 1,149 87,4
2 1,262 1,191 1,262 1,191 1,227 93,4
TA5 1 0.610 0,621 0.610 0,621 0,616 46,9
2 0.480 0,484 0.480 0,484 0,482 36,7
TA6 1 0,502 0,513 0,502 0,513 0,508 38,7
2 0,396 0,407 0,396 0,407 0,402 30.6
TA7 1 1,048 1.050 1,048 1.050 1,049 79.9
2 1,149 1.150 1,149 1.150 1.150 87,5
TA8 1 1,032 1.034 1,032 1.034 1.033 78,7
2 0,941 0,935 0,941 0,935 0,938 71,4
TA9 1 0,022 0,022 0,022 0,022 0,022 1.7
2 0,144 0,149 0,144 0,149 0,147 11.2
TA10 1 0,150 0,150 0,150 0,150 0,150 11.4
2 0,254 0,255 0,254 0,255 0,255 19.4
betyde Dif. gennemsnit af Dif. Dif. / 2 Klassifikation
af OD af OD levedygtigheder [%] af levedygtighed
NC 1,314 0,041 100,0 3.12 1.56 NI kvalificeret
PC 0.410 0,043 31.2 3.23 1.62 Jeg kvalificeret
TA1 1,292 0,127 98,3 9.63 4,81 NI kvalificeret
TA2 0,999 0,333 76,1 25.36 12,68 NI D> 20
TA3 0,152 0,030 11.6 2,32 1.16 Jeg kvalificeret
TA4 1,188 0,078 90,4 5,94 2,97 NI kvalificeret
TA5 0,549 0,134 41,8 10.16 5,08 Jeg kvalificeret
TA6 0,455 0,106 34,6 8,07 4.03 Jeg kvalificeret
TA7 1.100 0,101 83,7 7,65 3,82 NI kvalificeret
TA8 0,986 0,095 75.0 7,23 3,62 NI kvalificeret
TA9 0,085 0,125 6.4 9,48 4.74 Jeg kvalificeret
TA10 0,203 0,105 15.4 7,95 3,98 Jeg kvalificeret

Tabel 6:. EIT resultater opnået i 10 test artikler, NC og pc kontrol Tabellerne er produced af et Excel-regneark til formål at beregne vævslevedygtighed og ETI resultater. Test kemikalier, som reducerede levedygtighed væv ≤ 60,0% i forhold til NC er klassificeret som lokalirriterende ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 og TA10) og teste kemikalier, der havde vævslevedygtighed> 60,0% er klassificeret som ikke-Irritanter (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 og TA8).

Discussion

Vi har præsenteret den øjenirritationsprøve (figur 1), der blev udviklet til EpiOcular vævet model. EIT er i stand til at adskille okulære irriterende stoffer og ætsende (GHS kategori 1 og 2 kombineret) af materialer, der ikke kræver mærkning (GHS ingen kategori) med høj grad af følsomhed og specificitet 17. EIT, som præsenteres heri ikke diskriminerer mellem GHS kategori 1 fra kategori 2 kemikalier. EIT blev valideret for klassificering og mærkning af øjenirritation potentialet i en bred vifte af kemikalier, herunder kosmetiske og farmaceutiske ingredienser. Sammen med andre in vitro-forsøg, vil EIT fungere som en erstatning for in vivo-kanin øjenirritation test.

EIT bruger to lignende, men adskilte protokoller for flydende og faste materialer, som varierer i længden af eksponering og efter eksponering inkubationsperioder (Figur 1). Den endpoint anvendes i EITer vævslevedygtighed, bestemt ved MTT-assayet, der tidligere har været anvendt i validerede humane epitelvæv modeller 20,21. For at udføre denne analyse, er der ikke behov specialudstyr udover standard cellekultur-udstyr. På grund af det høje niveau af væv-til-væv reproducerbarhed, n = 2 væv i stedet for den normalt anbefalede n = 3 anvendes. Evnen til at bruge n = 2 væv er et kritisk aspekt af protokollen, da det giver mulighed for en erfaren operatør til at behandle to væv samtidigt, og derved minimere variabilitet af analysen, der kan opstå på grund af den forskellige håndtering af individuelle væv 14. Også ved anvendelse af N = 2 væv pr testartiklen, at irritation af 10 teststoffer af samme fysiske tilstand (flydende eller fast), sammen med de positive og negative kontroller, kan vurderes ved hjælp af en kit (24 væv).

Andre centrale punkter, der sikrer pålidelig klassificering af materialer er specifikationerne for den positive kontrol substance (vævslevedygtighed ≤50.0%), reproducerbarhed mellem dublerede væv (forskel <20,0%), og negative kontrol OD aflæsninger (> 0,8 og <2,5).

Når der udføres ETI test, er det vigtigt at holde sig til den validerede protokol og til den foreslåede dosering og skylning tidsplaner (tabel 3 og 4), da afvigelser fra protokollen eller ændringer i inkubationsperioder kan resultere i ændret resultat. Ligeledes vil afvigelser fra 3 hr tid til MTT inkubering resultere i forskellige MTT aflæsninger og kan påvirke analyseresultatet.

Indimellem kan en test kemisk have optiske eller andre egenskaber, som kan forstyrre MTT væv levedygtighed assay eller forårsage reduktion af MTT. For eksempel kan en teststof direkte reducere MTT til blå-lilla reaktionsprodukt, eller kan være et farvet stof, der absorberer lys i det samme område som MTT formazan (~ 570 nm). Men disse test kemikalier PRESENT kun et problem, hvis det på tidspunktet for MTT-assayet, er stadig til stede (eller absorberes af) vævet en tilstrækkelig mængde af materialet. For at undgå denne indblanding, er omfattende skylning procedurer indarbejdet i ETI protokol. Hvis skylning fjerner ikke TA og TA forstyrrer MTT reduktion, skal yderligere kontroller anvendes til at påvise og korrigere for det. Kort fortalt, hvis der er mistanke direkte reduktion af teststoffet MTT, 50 pi (eller 50 mg for faste stoffer) af det pågældende kemikalie inkuberes i 3 timer med arbejde MTT opløsning ved SCC (NC, 50 pi sterilt deioniseret vand, bør være køre samtidigt). Hvis MTT løsningen bliver blå-lilla, er testen artiklen formodes at have reduceret MTT. I dette tilfælde en funktionskontrol ved hjælp fryse-dræbt væv kontroller bør udføres for at vurdere, om testmaterialet er binding til vævet og fører til en falsk MTT reduktion signal. Hvis der er mærkbar MTT reduktion i TA-eksponerede, dræbt vævskontrolprøve(i forhold til mængden i den ubehandlede levedygtige væv), skal den gennemsnitlige væv levedygtighed testartiklen korrigeres ved at fratrække middelværdien levedygtighed dræbte kontrol.

EIT fejlagtigt på siden af sikkerhed, hvilket fremgår af den lave forekomst af falsk negative klassifikationer 14,15,18. Vigtigt er det, ingen af GHS kategori 1 kemikalier, som er ætsende for øjet, og som repræsenterer de mest alvorlige okulære fare, blev klassificeret som ikke-irriterende i denne analyse 14,15,18,19. Endelig er et af de store fordele ved RHCE in vitro testmetode er muligheden for at teste pæne flydende og faste materialer (hvilket ikke er muligt med todimensionale, nedsænkede cellekulturer).

EIT vil bidrage væsentligt til at bestemme øjenirritation potentialet i en bred vifte af materialer ifølge FN GHS klassificering og mærkning system. Udskiftningen af ​​dyr o fastlæggeCULAR toksicitet har været et mål for toksikologisk forskning i mange år. EIT testmetode har gennemført en formel valideringsundersøgelse støttet af EURL ECVAM i 2014 og EpiOcular EIT blev implementeret i OECD-retningslinjer som OECD TG 492 i 2015.

Disclosures

Offentliggørelse gebyrer for denne artikel er betalt af Mattek Corporation.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Dr. John Harbell for hans videnskabelig støtte og tid dedikeret til EIT-projektet. Forfatterne vil også gerne takke Beiersdorf AG (Tyskland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Schweiz), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrig), Harlan Laboratories (Det Forenede Kongerige), og LVMH Parfume (Frankrig) til deltagelse i Multi-center International Pre og validering Undersøgelser af øjenirritationsprøve 15.

References

  1. National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72, (109), 31582-31583 (2007).
  2. Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396, (49), European Commission. 1-849 (2006).
  3. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
  4. Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
  5. Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
  6. Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
  7. Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
  8. Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
  9. Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
  10. McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243 (2002).
  11. Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249 (2007).
  12. Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378 (2009).
  13. Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
  14. Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
  15. Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. (2013).
  16. MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. MatTek Corporation. (2014).
  17. Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43, (2), 101-127 (2015).
  18. Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
  19. Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. (2014).
  20. Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, (2003).
  21. Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics