Brug af Caco-2 celler til at studere Lipid Transport af tarmen

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University
Published 8/20/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Undersøgelser af intestinal absorption af fedt i kosten, og lipidopløselige lægemidler og vitaminer kan udføres in vivo ved anvendelse af en lymfe fistel model 1 - 4. Men de kirurgiske teknikker, der er involveret, er ikke kun udfordrende, men også dyrt. Selv om in vivo tilgange baseret på fækal analyse kan anvendes, er de hovedsagelig anvendes til at bestemme den procentvise optagelse af mavetarmkanalen 2,5. In vitro-model, der er beskrevet i dette papir er mere omkostningseffektiv, og de ​​teknikker, der er involveret, er velsagtens mindre udfordrende. Gensplejsning undersøgelser er også mere økonomisk og mindre tidskrævende, når de udføres ved hjælp af denne in vitro model.

Da lipidopløselige materialer, der er optaget af enterocytter pakkes i lipoproteiner 6,7, effektiviteten af denne in vitro model til at producere lipoproteiner er afgørende. De to vigtigste intestinal lipoproteiner er chylomikroner og meget low-density lipoprotein (VLDL). Chylomikroner, defineret som lipoproteiner med 80 nm eller mere i diameter, er produceret strengt af tyndtarmen, når lipider er rigeligt til stede i mave lumen. Da de er de største lipoproteiner, chylomikroner er tænkes de mest effektive lipid transportører. Denne in vitro model, der er i stand til at producere chylomikroner 8, kan anvendes til at studere kosten fedt absorption, lipid-opløselige vitamin absorption af tarmen og oral lipofilt lægemiddel biotilgængelighed. Tilstedeværelsen af ​​lipidopløselige molekyler, vitaminer eller lægemidler i fraktionen lipoprotein er en indikator for deres absorption af tyndtarmen. Som tidligere omtalt kan denne model anvendes til at forbedre oral lipofilt lægemiddel biotilgængelighed 6.

Dette papir beskriver, hvordan Caco-2 celler bør opretholdes permeabel membran eller regelmæssige vævskulturskåle, hvordan lipid mixture til stimulering lipoproteinproduktion bør forberedes, hvordan lentivirus ekspressionssystem kan anvendes til at opnå en effektiv overekspression, og hvordan de isolerede lipoproteiner bør analyseres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedligeholdelse af Caco-2 celler

  1. Ved hjælp af regelmæssige vævskulturskåle
    1. Optø Caco-2 celler fra en frossen hætteglas ved at anbringe hætteglasset i et 37 ° C vandbad, og straks tilføje dem til en 10 cm vævskulturskål indeholdende 10 ml forvarmet vækstmedier (15% føtalt bovint serum (FBS ) i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM)).
      1. Når Caco-2-celler har nået 50-70% konfluens, opdele dem 1: 6 ved at inkubere cellerne med 3 ml 0,05% trypsin / 0,53 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) ved 37 ° C, indtil de fritliggende (15 min) . At undgå celle sammenklumpning, blandes cellerne flere gange ved forsigtig pipettering. Tilsæt 0,5 ml af de trypsiniserede celler til en 10 cm vævskulturskål indeholdende 10 ml forvarmet vækstmedium.
    2. Ryst forsigtigt retter flere gange i en fremadgående og bagudgående retning efterfulgt af en venstregående og højregående retning. Undgå hvirvlende retterda det kan resultere i en ulige celle spredning.
    3. Placer retter på en flad overflade i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2. Skrå overflader kan også resultere i en ulige celle dispersion.
    4. Skift medierne vækst dagen efter start af inkubation.
    5. Overvåg cellerne og registrere den dag, de nå sammenløb. Det vil tage omkring 1 uge for cellerne at nå sammenløbet fra den dag, de er opdelt.
    6. Ændre vækstmedierne to gange om ugen før cellerne når konfluens. Når cellerne har nået konfluens, ændre dyrkningsmediet hver anden dag. Efter cellerne er 7-dage post-konfluerende, ændre vækstmedierne dagligt.
      Bemærk: Cellerne er klar til eksperimenter, når de er 13 dage post-konfluerende (figur 1). Da cellerne i sidste ende vil blive mindre effektiv til at producere lipoproteiner anvende celler, som er mellem 13 til 17 dage post-konfluerende 8. Gå til trin 3 om, hvordan til at gennemføre forsøget.
  2. Brug af permeable membransystem
    1. Pode Caco-2-celler i den permeable membran insert som beskrevet i trin 1.1.1.1. ovenfor. Undgå at bruge celler fra en frossen hætteglas, fordi deres cellevækst normalt langsommere (restitutionsperiode). Kort beskrevet tilsættes 0,5 ml af de trypsiniserede celler til det apikale kammer (øvre kammer), der indeholder 10 ml foropvarmet vækstmedier. Også, tilsættes 10 ml foropvarmet vækstmedier til den basolaterale kammer (nedre kammer).
      Bemærk: bedste praksis, tilføje medierne vækst til det apikale kammer først og derefter til den basolaterale kammer. Når du fjerner de gamle medier, skal du fjerne den basolaterale medierne før de apikale medier. Undgå stikke polycarbonat membran som det kan sprænge membranen.
    2. På grund af dårlig celle udsynet gennem polycarbonatmembran, pode Caco-2-celler i en regelmæssig vævskulturskål med ensartet densitet og anvende denne skål til at bedømme celle konfluens.
    3. Følg sregionale beskæftigelsespagter 1.1.2-1.1.6 ovenfor.

2. Gene Overekspression

  1. Anvendelse af den regelmæssige transfektion tilgang
    1. Pode Caco-2 celler på en vævskulturskål som beskrevet i 1.1.1.1.-1.1.4 ovenfor.
      Bemærk: Når cellerne er ca. 40-50% sammenflydende, de er klar til at blive transficeret.
    2. Tilføje 67 pi af transfektion reagens til 472 pi af de reducerede serum medier i et mikrocentrifugerør. Undgå kontakt af den ufortyndede transfektion reagens med rørvæggen.
    3. Tilføje 23 ug pLL3.7 forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) 9 ind i transfektion reagens / reduceret serum media blanding.
    4. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur.
    5. Erstatte de Caco-2-celler «vækstmedier med 8 ml 10% FBS i DMEM.
    6. Tilsæt DNA / transfektion reagens / reduceret serum medier blanding dråbevis til fadet.
    7. Forsigtigt ryste retter flere gange i en fremadrettet og backward retning efterfulgt af en venstregående og højregående retning.
    8. Sæt fadet i 37 ° C inkubator.
    9. Udskift mediet i skålen med 10 ml vækstmedier dagen efter start af inkubation.
    10. Overvåg genekspression.
      1. Overvåg genekspression uden 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning. Under anvendelse af et fluorescensmikroskop, bestemme procenten af ​​celler, der er grøn. Den procentdel repræsenterer transfektionseffektiviteten.
      2. Overvåg genekspression med DAPI farvning.
        1. Vask cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) tre gange.
        2. Fikseres cellerne ved tilsætning af 10 ml 4% formaldehyd i PBS (10 min inkubation ved stuetemperatur).
        3. Vask cellerne med PBS tre gange.
        4. Inkubér cellerne i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur med 8 ml PBS indeholdende 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonin.
        5. Vask cellerne med PBS tre gange.
        6. Usynge et fluorescensmikroskop, bestemme antallet af celler, der er grøn / blå i forhold til dem, der er blå (figur 2 øverste panel). Den beregnede procentdel repræsenterer transfektionseffektiviteten.
  2. Brug af lentivirus overekspression systemet 10
    1. Seed humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler i en 15 cm vævskulturskål (10% FBS i DMEM som deres vækstmedier).
      Bemærk: Når cellerne er ca. 60-70% sammenflydende, de er klar til at blive transficeret.
    2. Tilføj 162 pi af transfektion reagens til 1.133 pi af de reducerede serum medier i et mikrocentrifugerør 11. Undgå kontakt af den ufortyndede transfektion reagens med rørvæggen.
    3. Tilføj 24 ug pLL3.7 eGFP (eller en anden konstruktion), 15,6 ug Rev respons element (RRE), 6,0 ug REV, og 8,4 ug vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSVG) i transfektionsreagens / reduced serum media blanding.
    4. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur.
    5. Udskifte vækstmediet med 16 ml 10% FBS i DMEM.
    6. Tilsæt DNA / transfektion reagens / reduceret serum medier blanding dråbevis til fadet.
    7. Ryst forsigtigt retter flere gange i en fremadgående og bagudgående retning efterfulgt af en venstregående og højregående retning. Det er normalt at se nogle af de HEK293T cellerne fritliggende på dette punkt.
    8. Sæt fadet i inkubatoren.
    9. Efter 24 timers inkubation, erstatte medierne i skålen med 25 ml vækstmedie.
    10. Den følgende dag opsamles det vækstmedium indeholdende lentivirus (første samling).
    11. Gentag trin 2.2.10 for at indsamle flere lentivirus (den anden kollektion).
    12. Pool den første og den anden samling, og fjerne cellerester ved centrifugering (2.500 xg i 5 min).
    13. Filter kollektionen med en engangs flaske-top filter (0,45 um pore), ogkoncentrere viruset ved centrifugering samlingen på 31.400 xg i 2 timer ved stuetemperatur (JA-20 rotor). Markere bunden af ​​centrifugerøret hvor pelleten er placeret. Dekanteres, og efterlade røret inverteret ved stuetemperatur i ca. 15 min.
    14. Resuspender virusholdige pellet med 100 pi 1X PBS. Undgå bobler.
    15. Opbevar koncentrerede virus ved -80 ° C. Undgå fryse-tø cykler.
    16. Bestemmelse af den optimale mængde virus til at transducere de Caco-2-celler ved titrering. At spare omkostninger, anvendes en plade med 24 brønde (0,3 ml vækstmedium / brønd) i stedet for en 10 cm vævskulturskål for titrering.
      1. Tilføj stigende mængder af det koncentrerede virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, og 50 gl / brønd) suppleret med polybren (slutkoncentration = 5 ug / ml) til 40-70% sammenflydende Caco-2-celler. Ryst 24-brønds plade skånsomt som beskrevet i 1.1.2.
      2. Overvåge deres genekspression (trin 2.1.10.) (Figur 2 bund4 paneler).
    17. Da ekspression af transgen generelt opretholdes, vedligeholde de transducerede celler for fremtidige eksperimenter og løbende overvåge deres genekspression (trin 2.1.10.).

3. Stimulering af lipoprotein Sekretion

  1. Brug af regelmæssig vævskulturskål
    1. Forbered en 100X lipidblanding ved at blande 50 mg oliesyre, 40 mg lecithin og 48 mg natriumtaurocholat. Bring volumen til 900 pi med PBS (nok til 8 retter). Vortexes lipidblandingen kraftigt.
    2. Tilføj 900 pi af 100X lipidblanding i 89,1 ml vækstmedier. Bland, og foretage lipid-holdige medier. De endelige koncentrationer (1x) oliesyre, lecithin og natriumtaurocholat er 2,0 mM, 1,36 mM og 1,0 mM.
    3. Der tilsættes 10 ml af lipid-holdige medier til cellerne.
    4. Inkubere cellerne med lipid-holdige medier i 4 timer i en 37° C inkubator.
    5. Vask cellerne med PBS tre gange.
    6. Der tilsættes 10 ml af vækstmediet til cellerne for at opsamle lipoprotein sekretion.
    7. Inkuber i 2 timer i en 37 ° C inkubator.
    8. Opsaml lipoprotein-holdige medier.
  2. Brug af permeable membransystem
    1. Følg trin 3.1.1-3.1.2 at forberede lipidblandingen.
    2. Tilsæt 10 ml af lipid-holdige medier til apikale kammer og 10 ml af vækstmediet til den basolaterale kammer.
    3. Der inkuberes i 4 timer i en 37 ° C inkubator. Opsaml lipoprotein-holdige medier i den basolaterale kammer.

4. Lipoprotein Isolation (figur 3)

  1. Fjerne cellerester fra lipoprotein-holdige medier ved centrifugering (2.000 x g i 5 min).
  2. Dekanteres medierne i et 50 ml rør.
  3. Tilføj 5,95 g natriumchlorid til medierne.
  4. Hvis sample vil blive analyseret af TEM, tilsættes 1 protease inhibitor cocktail tablet til at opretholde integriteten af ​​de lipoproteiner.
  5. Bring volumen til 23 ml med vand (1,2 g / ml NaCl tæthed opløsning).
  6. Opløse de opløste stoffer fuldstændigt.
  7. Dekanteres hele opløsningen ind i et polycarbonat ultracentrifugerør.
  8. Forsigtigt overlejre 1,2 g / ml densitet opløsning med 0,5 ml vand (1,0 g / ml densitet).
  9. Balance røret efter vægt og ikke efter volumen.
  10. Blidt indlæse rør på den T865 rotoren.
  11. Spin prøverne i ultracentrifuge ved 429.460 xg i 24 timer ved 4 ° C.
  12. Straks isolere top 0,5 ml opløsning ved forsigtig pipettering. Hold røret så stille som muligt.

5. TEM Analyse

  1. Forbered 5 ml 2% phosphowolframsyre (w / v) og indstille pH til 6,0.
  2. Foretage 2% phosphorwolframsyre med en sprøjte filter (porestørrelse: 0,2 pm).
  3. Drop 20 ul af lipoprotein prøven på en steril skål.
  4. Drop 20 pi af den filtrerede 2% phosphorwolframsyre siden af ​​prøven på samme skålen.
  5. Forsigtigt drop en EM nettet med den kedelige side hviler på prøven.
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
  7. Bank let på siden af ​​EM gitter på et filter papir for at fjerne prøven fra nettet.
  8. Forsigtigt droppe EM nettet med den kedelige side hvilende på 2% phosphorwolframsyre.
  9. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
  10. Bank let på siden af ​​EM gitter på et filtrerpapir for at fjerne phosphowolframsyre fra nettet.
  11. Ved hjælp af en TEM, fange billeder af lipoproteiner (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser normale 13-dage efter sammenflydende Caco-2-celler. Udseendet af kuppelformede strukturer og intracellulære lipiddråber er karakteristisk for differentierede Caco-2-celler. Når Caco-2 celler er ikke spredes ligeligt under såning, vil de klumpe og overgrow i visse områder af fadet; og der vil være et par områder i fadet uden celler. Hvirvlende og placere fadet på en skrå flade bør undgås. Det er også vigtigt at bemærke, at post-konfluerende Caco-2 celler er mere modtagelige for løsgørelse, når ny vækst medium tilsættes til cellerne for groft. Derfor bør de nye medier skal lægges forsigtigt for at forhindre cell løsrivelse.

Baseret på disse undersøgelser, transfektionseffektiviteten af Caco-2-celler var mellem 30-60% (Figur 2 øverste paneler). I modsætning hertil transduktionseffektiviteten af Caco-2 under anvendelse af lentivirus ekspressionssystem var ca. 100% (figur 2 Figur 2 viste også, at den optimale mængde af koncentreret lentivirus var 10 ul. De transducerede Caco-2-celler blev opretholdt i op til 12 passager. Som vist, selv efter 12 passager de transducerede celler stadig udtrykte eGFP. Transduktionseffektiviteten klart afhænger af lentivirus koncentration. Bekræftelsen af ​​transfektion / transduktion effektivitet er kritisk, og bør udføres som en rutinemæssig foreløbig analyse forud for den egentlige forsøg. Selv om der kan anvendes Western blot-analyse for at vurdere den procentvise forøgelse af genekspressionen, bør det ikke være den primære metode til bestemmelse af transfektion / transduktion effektivitet.

Brug af NaCl densitetsgradientultracentrifugering metode (figur 3), lipoproteinerne udskilles af Caco-2-celler blev isoleret og analyseret på en TEM. Nogle af chylomikroner, lipoproteiner større end 80 nm i diameter, blev afbildet i figur4.. De mindre lipoproteiner, VLDL'er, var også til stede. Det er vigtigt at bekræfte den vellykkede isolering af både chylomikroner og VLDL'er på et TEM. Som tidligere diskuteret 8, bør biokemisk analyse ikke være den primære metode til verifikation. Fraværet af lipoproteiner, specielt chylomikroner, angiver, at lipid transport af Caco-2-celler ikke er effektiv. Derfor vil de ikke tjene som en god model til at studere lipid transport. Antallet af chylomicron partikler i forhold til det samlede antal lipoproteinpartikler kan tælles 8. En høj procentdel indikerer effektiv lipid transport.

Figur 1
Figur 1. Repræsentativ mikrograf af 13 dages post-konfluente Caco-2-celler. Intracellulær lipiddråber er synlige i nogle celler (rød pil). De unikke kuppelformede strukturer (sort pil) fobekræftet af nogle Caco-2 celler er generelt til stede, efter at cellerne har nået konfluens. Forstørrelse = 100X. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning af effektiviteten af lipidbaserede transfektion og lentivirus ekspressionssystem Topplade:. Caco-2-celler blev transficeret med pLL3.7 eGFP anvendelse af den ikke-liposomal transfektion reagens (Scale bar = 20 um). Bottom 4 paneler: Caco-2-celler blev transduceret med pLL3.7 eGFP hjælp af lentivirus ekspressionssystem med varierende mængder (1, 2, 5, eller 10 pi) af det koncentrerede lentivirus (LV). De viste celler var fra den 12. passage af de oprindelige transducerede celler. De venstre paneler viser DAPI-farvning, den midterste paNels viser GFP-fluorescens, og de rigtige paneler viser de fusionerede billeder. Den lentivirus ekspressionssystem var åbenbart mere effektiv end den lipid-baserede transfektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Isolation af intestinale lipoproteiner ved hjælp NaCl densitetsgradientultracentrifugering. Densiteten af lipoprotein-holdige medier justeres til 1,2 g / ml ved tilsætning af den passende mængde NaCl. Volumenet af prøven skal også indstilles således, at den vil fylde hele ultracentrifugerør at forhindre sammenbrud. For at opnå en densitetsgradient, er 0,5 ml vand overlejret forsigtigt på 1,2 g / ml densitet opløsning. Prøven centrifugeres derefter ved 429.460 xg i 24 timer under anvendelse af en T865rotor (svarende til 2,15 Svedberg-enheder). Tarm lipoproteiner bør straks inddrives ved forsigtig pipettering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentative elektronmikrografi af lipoproteiner produceres af Caco-2-celler. De lipoproteiner isoleret ved NaCl densitetsgradientultracentrifugering blev negativt farvet med 2% phosphowolframsyre (pH 6,0). Chylomikroner, lipidpartikler større end 80 nm i diameter, og VLDL'er, der er mindre end 80 nm, begge er til stede. Scale bar = 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir, at de to systemer, der kan anvendes vedligeholde Caco-2-celler er beskrevet, nemlig den regelmæssige vævskulturskål og den permeable membran. Fordelene ved at bruge den permeable membran system, omfatter adskillelsen af ​​det apikale og basolaterale de rum, og evnen til at inkubere lipidblandingen og indsamle lipoprotein sekretion samtidigt. Men den permeable membran skær er dyre, og deres polycarbonatmembran tillader ikke god celle synlighed. En af fordelene ved denne in vitro model er, at genetiske manipulation studier vil være mere økonomisk og mindre tidskrævende. For bedre effektiviteten bør lentivirus ekspressionssystem anvendes. De transducerede Caco-2-celler generelt opretholder ekspressionen af ​​deres transgen.

Evne Caco-2 celler til at producere chylomicroner er af største vigtighed. Uden denne evne ville Caco-2-celler ikke kunne efficiently transporterer lipofile materialer, herunder men ikke begrænset til liphophilic lægemidler, vitamin A, D, E og K, og eventuelle lipid-opløselige næringsstoffer. De korrekte metoder til at udfordre Caco-2 celler til at producere både VLDL partikler og chylomikroner beskrives. Den vellykkede isolering af disse lipoproteinpartikler skal bekræftes på en TEM. Baseret på den nuværende litteratur, denne Caco-2 model tilbyder den mest effektive transport lipid blandt andet Caco-2 modeller 12-14. Dog in vivo lymfe kanylering model stadig transporterer lipider mere effektivt end nogen in vitro model. De bagvedliggende årsager er for nylig blevet diskuteret 8, nemlig fordi Caco-2 celler producerer 2 forskellige isoformer af apolipoprotein B, Caco-2-celler kan ikke syntetisere triglycerider fra monoglycerider, og serummet komponent kritisk for chylomicron biogenese kan være lavere i vækstmediet . Det er også vigtigt at indse begrænsning af denne ivitro-model; dette in vitro-model udelukker nogle potentielle vigtige faktorer, såsom tarmmotilitet, anatomi tarmen, og samspillet med andre organsystemer.

De vigtigste faktorer, der tillader Caco-2-celler til at producere chylomikroner effektivt er den type / mængde af anvendte lipider og cellulær differentiering 8. Uden den rette kombination af disse faktorer, vil Caco-2-celler ikke producerer et betydeligt antal chylomikroner 8. Notatet bør NaCl densitetsgradientultracentrifugering udføres korrekt. Den vellykkede isolering af lipoproteiner afhænger timing (øjeblikkelig uden væsentlig forsinkelse), god prøve håndtering (robust uden megen uro), og omhyggelig pipettering (få kun det øverste lag). Korrekt teknik kan praktiseres ved anvendelse af forud farvede lipider at hjælpe med at visualisere lipoprotein laget 8. Udover TEM, biokemiske analyser, dvs. apolipoprotein B og triglycerid analyser, også kan være Used at bekræfte den vellykkede isolering af lipoproteiner. Disse biokemiske analyser, som vi tidligere har rapporteret 8, kan også tjene som metoder i kvantificere absorption. Imidlertid bør TEM stadig udføres på grund af tendensen hos de lipoproteiner at aggregere 2, hvilket medfører en potentiel overvurdering af chylomikron produktion.

Denne in vitro model er særlig nyttig til at studere kosten fedt absorption og intestinale absorption af lipofile lægemidler, vitaminer og andre lipidopløselige næringsstoffer. Det kan også tjene som model for at forbedre dårlig biotilgængelighed af orale lipofile lægemidler. Da lipidopløselige materialer pakkes i chylomikroner af enterocytter til transport til kredsløbet, vil chylomicron-producerende Caco-2-celler være mere effektiv til at absorbere lipofile lægemidler. Desuden tillader denne model forskere til at fastlægge den rolle, et specifikt gen i lægemiddelabsorption af tarmen (farmakogenetikken). Det giver også mulighed iundersøgere til at sammenligne effekten af ​​forskellige fedt i kosten på oral lipofilt lægemiddel biotilgængelighed. Alle disse ansøgninger er blevet tidligere 6 diskuteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115, (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131, (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127, (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8, (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32, (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2, (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4, (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21, (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439, (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274, (28), 19565-19572 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats