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 JoVE Medicine

세 쥐의 경동맥 폐색으로 영구 말초 중간 대뇌을 수행하면 두피 허혈 지속적인 장애를 연구하는

*1,2, *1,2, 3, 1, 4, 4,5,6, 7, 2, 1

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford

* These authors contributed equally
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    Summary

    여기에서 우리는 큰 대뇌 피질 경색과 지속적인 적자를 생성하는 경동맥의 동시 폐쇄와 함께 노인 여성 쥐 영구 원심 중간 대뇌 동맥 폐쇄를 생산하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 24 시간 뇌졸중 후 팔주에서 구조 MRI를 사용하여 병변 크기의 확인을 보여줍니다.

    Date Published: 2/23/2016, Issue 108; doi: 10.3791/53106

    Cite this Article

    Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

    Abstract

    스트로크 일반적 경동맥 (또는 다른 동맥) 죽상 경화증, 고혈압, 비만 및 당뇨 이환의 범위와 노인에서 발생한다. 동물에서 뇌졸중에 대한 치료를 평가할 때 따라서, 훌륭한 얼굴 유효 기간 모델을 선택하는 것이 중요합니다. 허혈성 뇌졸중은 전체 스트로크의 80 %를 차지하고, 이들의 대부분은 종종 신체의 반대쪽면에 영구 plegia 또는 마비를 일으키는 감각 피질 영향 경색 유도 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 영역에서 발생한다. 우리는이 비디오에서 지속적인 감각 장애와 상당한 대뇌 피질 경색의 원인 노인 쥐의 허혈성 뇌졸중을 제조하는 방법을 보여줍니다. 특히, 이러한 동맥의 짧은 세그먼트를 흡장 투열 집게를 사용하여 노인 여성 쥐 영구 원위 중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)를 유도한다. 병변 동측의 경동맥은 다음 P이었다ermanently 폐색과 반대측 경동맥은 일시적으로 60 분 동안 폐색되었다. 우리는 24 시간 뇌졸중 후 8주에서 구조 T2 강조 자기 공명 영상 (MRI)을 사용하여 경색 크기를 측정한다. 본 연구에서는 평균 경색 부피는 24 시간에 동측 반구의 2.0 % (표준 편차) ± 4.5 %이었다 (Gerriet의 식을 이용하여 보정 뇌 부종, N = 5). 이 병태 생리 학적 메커니즘과 새로운 치료의 해명에 중요 지속적인 감각 적자의 유도를 허용으로이 모델은 가능하고 임상 적으로 관련이있다.

    Introduction

    스트로크는 현재 전 세계적으로 사망의 세 번째 가장 일반적인 원인과 장애 1의 주요 원인이다. 모든 뇌졸중의 80 %를 포함하는 허혈성 뇌졸중은 종종 영향을받는 측면 2-4로 운동 기능과 관심의 감각 손실 (예를 들어, 고유 감각)을 일으키는 피질 경색을 초래한다. 중간 대뇌 동맥 (MCA)는 윌리스의 원에서 공급을 그리고 내부 경동맥 (5)에서 유래 혈관의 가장 큰 것입니다. MCA는이 지역의 스트로크는 모든 허혈성 뇌졸중 6,7의 65 %를 차지와 가장 일반적으로 허혈성 뇌졸중에 영향을받는 뇌 혈관입니다. MCA는 폐색 7의 정확한 위치에 따라 달라집니다 피질 및 피질 지역과 MCA 뇌졸중으로 인한 신경 학적 이상을 모두 제공합니다. 근위 MCA의 폐색은 모두 코르티을 아우르는 대형 경색을 lenticulostriatal 동맥을 통해 깊은 영역에 영향을 미치는 원인이칼과 피질 영역. 대조적으로, 혈액의 흐름만을 피질 영역을 박탈 더 원위 폐색 작은 피질 경색을 생산하는 경향이있다.

    큰 인구 연구에서 인간의 뇌졸중 병변 동측 반구 8,9의 5-14% 범위; 악성 스트로크는 스트로크의 10 %를 차지하는 두개 내 압력을 감소 hemicraniectomy을 필요 큰 경색을 일으킨다, 작은 병변을 가진 환자 10 생존 할 가능성이있다. 우리는 많은 사람의 스트로크와 반구의 비슷한 비율을 차지 병변을 생산하는 재생 가능한 모델을 보여줍니다.

    스트로크는 이기종 질병이다 허혈성 뇌졸중의 75 %는 (두개 내 작은 혈관의 폐색에서) 중 하나 열공 경색에 의해 유도된다 cardioembolic 뇌졸중; 뇌졸중의 30 %를 차지 또는 큰 동맥 죽상 경화증. 동맥 경화 증상이 자주 공통 포인트 C에서 관찰내부 및 외부 경동맥 (11)에 arotid 동맥 (CCA) 지점.

    그 병태 생리를 시뮬레이션과 뇌졸중의 위험 요소를 통합해야 가능한 뇌졸중의 전 임상 모델은 인간의 조건에 관해서는 비슷해야합니다. 허혈성 뇌졸중의 92 %는 65 세 이상의 사람에서 발생, 이전 12 설명한 바와 같이 다른 위험 요인, 비만, 고혈압, 동맥 경화 등이 있습니다. 더 이들 위험 인자를 나타내는데, 이는 천연 상태의 병태 생리 학적 기능 중 일부를 공유 할 수있는 모델을 사용하는 것을 권장한다. 이 프로토콜에서 우리는 경동맥을 통해 고급 연령과 방해 혈액 흐름을 포함하고있다.

    중간 대뇌 동맥 폐색의 고전적인 모델 (MCAO)은 혈액 전방의 흐름과 중간 대뇌 동맥을 감소 근위 MCA 폐색의 관내 필라멘트 모델입니다. 이 모델을 이용하여 짧은 가림 시간 L을 집중피질 영역 esion, 더 이상 폐쇄 시간은 노인 쥐에서 더 높은 사망률의 결과로 모두 대뇌 피질 및 피질 영역의 영역을 모집 큰 병변이 발생할 수있는 반면. 비교 우리 그룹이 사용 모델 개두술 양극성 소작 집게를 사용 MCA의 작은 부분의 혈액 응고 파괴 하였다 두라 개구 수행 포함한다. 이 투열 요법 모델은 타무라 등의 알에 의해 1981 종이로 구성된다. (23)와 두개 절제술의 사용은 두개 내 폐쇄 두개골의 특징이다 압력, 높은 재현성 결과와 우리의 수술 코호트에서 낮은 사망률을 상승 제한 할 수있다 다른 모델 (13)에 비해. 재현 경색 및 유지 장애를 생성하려면 우리는 (Chen 등. (14) 우리가 사용하는 비 침습적 T2 강조 자기 공명 영상에 따라 MRI를 원위 CCA를 영구적으로 근위 CCA를 폐색 및 일시적으로 폐색) 범위와 뇌경색의 위치 및 감각 피질에서 뇌 부종의 정도를 평가합니다.

    Protocol

    이 프로토콜은 킹스 칼리지 런던에 규정 된 기관의 지침에 의해 승인되었고, 1986 년 가이드 라인의 법은 기관에 따라 다를 수 있습니다 영국 홈 오피스 가이드 라인과 동물 (과학적인 절차)에 따라 수행 하였다 이 절차를 수행하기 전에 제도적 지침에 대한 준수를 확인하시기 바랍니다. 장치를 터치 할 때 무균 기술을 유지하기 위해, 알루미늄 포일의 큰 조각을 오토 클레이브 장비 현미경 마취 기계 등의 처리를 둘러싸 이것을 사용. 멸균 집착 필름 (랩)도 사용될 수있다.

    1. 준비

    1. 이전에 뇌졸중 수술에 최소 48 시간 동안 젤 유체 팩 (수의학 복구 젤) 및 소프트 차우와 쥐를했습니다. 동물이 자주 시술 후 음식에 어려움을 찾을 때, neophobia을 최소화하기 위해 수술 전에 이러한 항목에 동물을 소개합니다. 나무 씹 BLO 집 노인 쥐CKS 자란 치아의 발생을 줄이기 위해 (섹션 6 참조).
    2. 고압 증기 멸균에 의해 (최소 121 ° C, 15 분 15 PSI를) 수술 절차를 시작하기 전에 모든 수술 도구를 소독. 70 % 에탄올에 1 % 클로르헥시딘을 사용하여 모든 작업 표면 살균 수술 커튼 사용 절차 동안 무균 기술을 유지한다.
    3. 선호하는 발에 반구의 반대편에 병변을 유도한다. 병변 왼쪽이나 몬토야 계단 시험 (15) (그림 4 참조) 수술 전베이스 라인에 의해 결정 각각의 쥐가 선호하는 앞발에 따라 오른쪽 반구, 하나에 할당합니다. 이 원고의 절차를 설명 할 때 편의상 왼쪽 발은 양호한 발하고, 수술은 우반구에 수행된다. 그들은 빨리 배우고 이러한 행동 테스트를 위해 리스터 후드 또는 긴 에반스 쥐를 사용합니다.
      주 : 계단 시험 모두 미세하고 총 당업자 m 변화를 측정하도록 설계모터 시스템 손상 다음 ovements. 계단은 중앙 플랫폼의 각 측면에 7 단계로 구성됩니다. 계단 테스트 장비를 사용할 수없는 경우, 실린더 테스트는 테스트하는 손에 대한 적절한 대안적인,하지만 거기 행정이 모델이 시험에서 단지 일시적인 적자이며, 따라서 다음과 같은 장기간의 회복을 측정하기 부적합한 것으로 양해 치료.
      1. 각 단계의 잘 세 설탕 알약 (측면 당 21 펠렛)를 놓습니다. 10 분 동안 계단 장치에 래트를 넣고 검색 펠릿의 수와 각면에 변위 펠릿의 수를 기록한다.
        참고 : 수술 후 작업에 포함하기 위해, 쥐 기준에서 75 % 펠릿의 최소 검색해야합니다.

    2. 수술

    1. 16~18개월 (2백50~4백그램)에서 여성 노인 리스터 - 후드 쥐를 사용하여 1.5 L의 5 % 이소 플루 란으로 마취를 유도 / 마취의 유도에 따라 분 O (2) 감소이소 플루 란의 수준과 수술에 대한 충분한하지만 최소 깊이 (예를 들어, 1.5 %)에 그것을 유지한다. 안면 마스크에 의해 동물에게 마취를 전달하고 이소 플루 란으로 외과 노출을 제한하기 위해 제거 시스템을 사용한다.
      1. 이 절차는 행동 적자 (16)를 생성 할 수 있습니다로, 가짜 동물에 개두술을 포함한까지 모든 절차를 수행 할 수 있지만. MCAO 실험을 설계 할 때 실험 목표를 고려​​하고, 포함되어야한다 개두술에 대한 제어하는​​ 가짜 그룹할지 여부를 결정합니다.
    2. 통증 완화의 사전 관리 또는 (Carprieve은 0.25 ㎎ / ㎏,의. 절단)에 작동를 정기.
      1. 멸균 0.9 % 식염수는 원액을 만들고 300g 쥐 당 0.6 ml에 주입 ml의 19에 1 ML을 추가합니다. 전자는 실온에서 안정하므로 Carprieve의 사용은 카프로 펜 선호된다.
    3. 피부를 노출 오른쪽 반구에 복부 목 영역 및 시간 영역에 털을 면도. 수술 사이트 유를 소독에탄올 면봉을 노래. 머리 제거를위한 지역 IACUC 지침을 따르십시오.
      1. 절개 부위에서 털의 양을 최소화하기 위해 떨어져 조작 영역에서이 단계를 수행한다.
    4. 가열 패드에 앙와위에서 멸균 드레이프로 덮여 코르크에 쥐를 놓습니다. 머리와 목의 면도 지역에 리도카인 크림을 적용합니다. 모니터링하고 homeothermic 시스템 36.5-37.5 ° C 사이의 동물의 온도를 유지하기 위해 직장 프로브를 삽입합니다.
      1. 건조를 방지하기 위해 눈에 lacrilube 연고를 넣습니다. 쥐에게기도 분비물을 감소시키는 아트로핀 황산 용액을 주사 (피하 600 μg의 / ㎖ 용액 0.05 ml의를) 제공합니다.
        참고 : 연구자들은 혈액 가스 압력과 같은 생리 학적 변수를 측정하는 것이 좋습니다.
    5. 수술을 시작하기 전에 뒷발 핀치 철수를 확인하고 전체 마취를 확인하기 위해 반사 신경을 깜박입니다.
    6. 해부 마이크로 미만범위, 메스를 사용하여 노출 된 목에 2cm 중앙 정중선 절개를합니다. 양쪽 기관에 부드럽게 측면 침샘을 이동합니다.
    7. 한쪽 경동맥을 덮는다 피부 주위 루프는 비 흡수성 실크 봉합사. 조심스럽게 실크 봉합사를 사용하여 사이트에서 피부를 멀리 당겨 경동맥을 나타 내기 위해 수술 테이프를 사용하여 코르크에이를 막대기. 조심스럽게 밴드 및 미세 집게를 사용하여 미주 신경을 주변에서 무료로 동맥을 해부 무딘.
      1. 이 연하와 호흡, 공급을 저해하므로,이 단계에서 근육 또는 미주 신경이 손상되지 않도록주의하십시오.
    8. 경동맥이 노출되면, 제 1 리버스 미세 집게로 해부 및 신경과 접촉하지 않도록주의하여 미주 신경에서 경동맥을 분리, 경동맥을 분리하는 비 흡수성 실크 봉합사 (5/0)를 사용합니다. 용기는 봉합사, t와 루프 (그러나 묶여 있지)되면이 단계 되 돌리는 것을 방지하는 외과 테이프를 이용하여 서로 봉합 단부를 흉내. 상부의 피부를 다시 들고 봉합사를 제거합니다.
    9. 다른면에 대해 반복합니다 (섹션 2.7-2.8)
    10. 수술의 나머지 기간 동안 촉촉한 조직을 유지하기 위해 상처로 멸균 식염수를 적신 거즈를 놓습니다. 느슨하게 피부를 봉합하고 더 탈수를 방지하기 위해 영역에 추가 식염수를 적신 거즈를 배치합니다.
    11. 횡 방향 위치에서 쥐를 놓고 오른쪽 궤도 외이도 사이의 중간 지점에서의 피부 절개를 만든다. 다음 corkboard에 고정 다섯 탄성 3mm 후크 견인기까지 사용하여 피부를 철회하고 두개골을 공개하는 측두근 근육을 해부 무딘.
    12. 오픈 사이트 위의 엄지 손가락 휠 조정 중력 중심의 생리 드립 (유량 약 2 ml / 분)를 놓고 뼈 파편을 제거하고 (수술이 단계를 통해 노출 된 사이트에서 약간의 출혈을 취소 흡입기 시스템을 설정 분파이온 2.13-2.16).
      1. 귀 근처 두개골의 가장 높은 지점에서 염분 전달 노즐, 가장 낮은 지점에서 흡입기 노즐을 배치합니다. 더 동물은 마취하에있는 시간의 양을 줄여 선박의 소작을위한 임의의 블리드의 소스를 시각화 영역보다 식염수 공급 출혈 동안 휠을 조정한다.

    그림 1
    그림 영구 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 모델 1. 수술 설정입니다. 오른쪽 반구에 대해 표시되는 쥐 개두술에 대해 설정에 사용되는 장비, 삽입, 두개 절제술 사이트 주위 흡입기와 식염수 물방울의 위치. 또한 도시 혈관의 주요 기능은; 중간 대뇌 동맥 (적색)과 열등한 대뇌 정맥 (파란색) 표시하고, 동맥의 응고가 발생할 경우 음영 처리 된 영역을 나타냅니다.교합의 확인은 열등한 대뇌 정맥 아래 MCA를 절단에 의해 수행된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    1. 노광 영역 드릴링 동안 원형 측압 아니라 하향 압력의인가를 보장 조대 1.6 mm 다이아몬드 코팅 드릴 버어 약 8000 RPM으로 치과 용 드릴을 사용하여 노광 영역에 개두술을 수행 (약 5mm × 5 ㎜) . 뼈가 완전히 투명하게 보이는 충분히 얇은되면, 집게를 사용하여 제거합니다.
    2. 그들은 섬세하고 파열하기 쉬운주의 깊게, 큰 표면의 혈관을 피하기 위해 신중, 경질을 열고, 약 180 ° 아크를 형성하기 위해 미세 집게 중 하나 팁을 절곡하여 만든 수제 경막 후크를 사용합니다.
      참고 : 뇌의 노출 된 영역은 중간 대뇌 동맥 (MCA)를 발표 할 예정; 원하는 세그먼트측정 길이 약 2mm (그림 1, 삽입).
    3. 열등한 대뇌 정맥이 교차하는 곳에서, 동맥 분기의 지점으로 다음 완전히 폐색 (17)까지 투열 요법의 포셉 한 쌍을 사용하여 MCA의 꼬리 지점을 따라 MCA를 응고. 0.25 mm 뾰족한 팁 각도 보석 투열 요법의 집게를 사용합니다.
      1. 동맥 폐색 할 때, 염수가 혈관에 부착 응고 핀셋을 방지 쿨이 영역을 유지하기 위해 필요한 유동 변화. 흡장되면 혈관 블랙 나타나고 혈류 흔적 본 없어야한다; 혈류 부분적 폐색 혈관을 알 수있다.
      2. 완전한 폐쇄를 확인하기 위해이 시점에서 MCA를 잘라. 열등한 대뇌 정맥 MCA 교차하는 곳 아래에 잘라 미세 혈관 가위를 사용.
      3. 다음 단계를 계속하기 전에 식염수를 적신 거즈 패드 노출 영역을 커버.
    4. 부정사 포지로 다시 쥐를 돌려기는 경동맥을 다시 노출 목에 느슨하게 묶여 봉합을 다시합니다. 영구적 일시적 60 125g 압력 13mm 스테인리스 동​​맥 클립을 이용하여 폐색되어 왼쪽 경동맥 반면 경동맥 주위 실크 봉합사의 매듭 묶는 의해 폐색 MCA (오른쪽)와 동일한 측의 경동맥을 결찰 분. 느슨하게이 시간 동안 목에 절개를 봉합하고 탈수를 방지하기 위해 상단에 멸균 생리 식염수 적신 거즈를 배치합니다.
    1. 동물의 오른쪽은 부정사 위치 지정, 외과 의사의 왼쪽에있을 것입니다 있습니다.
    2. 가짜 동물, 목 및 시간 영역의 복부 부분을 열고 경동맥을 찾습니다 근육을 분리하지만, 폐색하지 않습니다. 가짜 동물까지의 절차를 거쳐야하지만이 절차는 행동 적자 (16)을 생산할 수없는, 개두술을 포함하고있다. 다른 t의 맹검을 유지하기 위해(나중에 행동 테스트하는 동안 예) EAM 회원, 절개 및 봉합을 수행합니다.

    그림 2
    도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 다음 2 직렬 경동맥 폐색. 우측 총 경동맥 (CCA)가 영구적 (화상의 좌측) 혈관 주위 실크 봉합사 (5/0)을 묶어서 흡장된다. (우측) 왼쪽 CCA는 미세 혈관 클램프를 사용하여 1 시간 동안 폐색된다. 이 수술은 각면 (흰색)에 미주 신경과 접촉하지 않도록주의를 복용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    1. 왼쪽 경동맥 폐색의 1 시간 동안 시간 영역의 절개를 봉합.
    2. 래트에게 수화를 유지하기 위해 피하 식염수 20 ㎖ (각 측면에 두 개의 사이트에 5 ㎖)을 수득 하였다 (참조 :6.2).
    3. 60 분 경과하면, 클립을 제거합니다. 주변 근육에 국소 식염수를 적용하고 흡수성 봉합사 (4/0)의 피하 연속 스티치를 사용하여 목에 절개를 닫습니다.

    3. 포스트 수술 케어

    1. 최대 4 시간 동안 마취에서 회복하기 위해 31 °의 C 배양기에서 쥐를 놓습니다.
      참고 : 연구자가 현지 관행에 따라 다른 온도와 지속 시간을 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 24 시간에서 통증 완화를 반복 carprieve (0.25 ㎎ / ㎏). 모든 동물은 Carprieve의 동일한 복용량을받을 수 있기 때문에,이 요인은 체계적으로 통제된다. Carprieve 임의의 신경 보호 효과는 무시할 수있을 가능성이있다.
    3. 적어도 3 일에 대한 탈수를 방지하기 위해 매일 식염수 주사를 제공합니다. 쥐가 체중 kg (각 24 시간) 당 65 mL의 유체를 필요로하는 가정에서 각 300g 쥐가 하루 ~ 22 ml의 유체를받을 수 있도록.

    4. 콘경색의 firmation

    1. 경색 볼륨 구조 MRI를 사용하여 측정합니다.
      참고 : 다른 방법은 이전에 구조 MRI 데이터 (18)에 상관 된 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC)로 조직 학적 염색을 사용하는 수 있습니다. 그러나, 이것은 연구의 종점에서 사용되지 종 수있다.
      1. 24 시간 MCAO 유도 한 후, 0.9 L 직교 새장 자기 공명 코일 보안 / 분 의료 에어 1 L / min의 O 2에 이소 플루 란 (유도 5 %, 유지 1-1.5 %)로 쥐를 마취 7 테슬라 수평 보어 스캐너 (43mm 직경)과 장소.
      2. 시간 에코 (TE) 60 밀리 초, 반복 시간 (TR) 4,000 밀리 초, 시야 (FOV) 40 × 40 mm의 취득 매트릭스 (40) X 0.5 mm를 획득 128 X 128 : T2 강조 고속 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 스캔을 구합니다 약 8 분의 두꺼운 조각. 이어서, resampl을 사용하여 20 × 1 mm 두께의 40 조각 조각으로 변환의료 영상 소프트웨어에 보내고 기능.
    2. 20 권 경색의 단면적을 측정하여 의료 영상 디스플레이 패키지 내의 병변 볼륨을 얻었다. 두께 (1mm)에 의해 이러한 영역의 합을 곱하여 총 부피를 구합니다. 그룹을 계산 체적과 표준 편차를 의미한다. 비율 병변 볼륨 계산을 위해, 또한 ipsilesional 및 contralesional 반구의 볼륨을 획득.
    3. 리츠 '식 (18)를 사용하여이 값을 조정, 부종으로 인한 붓기 뇌를 교정합니다. 만 피질을 포함하고이 음의 병변 볼륨을 생성 할 수 있기 때문에, 과도한 보정 피하기 위해 표준 쥐 아틀라스 (19)에 따라 소뇌 또는 후각 전구를 포함하지 않는 조각을 포함한다.
      1. 다시 팔주 뇌졸중 수술 후 T2에게 가중 된 이미지를 획득.

    신경 보호 및 행동 복구를 <평가 향후 연구 5. 표본 크기 계산/ P>

    1. 사용하는 세 가지 다른 크기의 치료 효과 (25 % 감소, 50 % 감소, 75 % 감소)을 식별하는 두 그룹 (. 치료 대 제어)를 이용하여 향후 가상 신경 실험에서 요구되는 최소의 샘플 크기를 추정하기 위해 시료 크기 계산을 수행 선험적 알고리즘은 전력 분석 소프트웨어 (20)에 구현.
      참고 : 자신의 데이터와 유사한 계산을 할 독자를 사용하려면, 자유롭게 사용 가능한 전력 분석 소프트웨어의 스크린 샷 (대표 결과를 참조)이있다. 다음 매개 변수를 사용하여 허용 위양성률 (즉, 유형 I 오류 임계 값을; α) ≤0.05 및 전원 (1-β에 해당하는) ≥0.80 (즉, 80 % 이상 전력). 설명과 토론 (21)은 아래를 참조하십시오.

    6. 노인 동물 복지 후 뇌졸중 수술

    1. 사용할 수있는 추가 소프트 우 만들기차 재수 젤은 쥐가 쉽게 도달에 대한 확장 팁 물 병뿐만 아니라, 수술 전에 길들여 있다고 팩. 또한, 대신 느슨한 침구의 새장에 흡수 복구 패드가 처음 24 시간 동안 (즉, 우드 칩을 방지), 여분의 둥지 침대를 제공합니다. 연하 장애 쥐 질식 수 있으므로 퓌레로 만들어진 음식 (예를 들어, 이유식)를 사용하지 마십시오.
    2. 칠일 복구를 모니터링 매일 동물을 무게. 체중 감소는 탈수와 스트레스의 주요 지표이다. 수술 후 처음 몇 일 체중 감소는 주로 (감소 된 공급보다는 체중의 손실) 탈수을 반영한다.
    3. 노화 쥐 수술 무관 체중 감소를 도시 유체의 등가 중량 손실 체중 대체 상하 치아를 검사한다. 치아가 자란 곳 (2.1 절에서와 같이) 이소 플루 란과 쥐를 마취하고 앙와위에서 장소
      1. 테 뒤에 1 ML의 주사기 배럴 배치ETH는 부드러운 조직을 보호 할 수 있습니다. 높은 회전 속도로하지만 천천히 꽉 손의 움직임 (예를 들어, 3 초 인하)와 휴대용 원형 톱 (예를 들어, 약 3cm 직경)를 사용하여 잘라. 쥐의 치아 컷 사이에 냉각 할 수 있습니다. 톱의 치아가 회전 방향으로 마주 보도록 회전 톱 맨드릴에 장착되어 있는지 확인합니다. 이 같은 사태에 대한 준비가 개별적으로 살균, 포장 회전 톱을 유지하는 가치가있다.
        참고 : 하드 펠렛 다이어트를 유지하는 경우에도 과대 성장 노인 쥐에서 발생할 수 있습니다. 우리는 치아가 정기적으로 노인 쥐에 체크하는 것이 좋습니다.
    4. 노인 쥐가 체중 감소 및 수술 관련이없는 경직을 표시하는 경우, 수의사와 치료 방법에 대해 설명합니다. 동물을 죽이는 인도적 고려한다. 이러한 동물의 MRI가 작동하고 치명적이다 (종종 노인 여성 쥐) 뇌하수체 종양을 표시 할 수 있습니다.

    Representative Results

    영구 MCAO는 영구 ipsilesional 경동맥의 폐색 및 contralesional 경동맥의 60 분의 폐쇄와 함께 투열 요법에 의해 중간 대뇌 동맥의 응고 및 파괴 한 후, 수행 개두술에 의해 유도했다. 장비의 설치의 회로도 및 MCA를 폐색은 그림 1과 같이하고, 그림 2 (위)에있는 경동맥의.

    스트로크 결과는 의료 영상 디스플레이 패키지에 관심 툴킷의 지역을 사용하여 24 시간과 (척수의 주동이의 끝 후각 망울의 주동이의 끝에서) 40 X 0.5 mm 조각에 경색 볼륨을 측정하여 뇌졸중 후 팔주을 평가 하였다. 대표 T2 강조 구조 MRI 검사는 24 시간 주와 8 주 (그림 3A)에서 같은 동물에 대해 표시됩니다. 경색 량은 hyperintense 신호를 나타낸 래트의 뇌 영역에서 확인되었다; T2의 무게로에드 이미지는 밝은 흰색 영역으로 물 또는 플라즈마를 보여줍니다. 이는 부종 및 두뇌 뇌졸중 후 부종의 증가가 있다고 알려져 있으며, 이는 경색 량 (18)의 조직 학적 측정과 상관 된 T2 강조 검사에서 측정 할 수있다. Gerriet의 공식을 사용하지만, 현재의 부종은 초기 뇌졸중 (예를 들어, 24 시간에서) 후 최종 병변 볼륨 (예 : 8 주째)의 과대 평가로 이어질 수 있으므로 우리는 또한 현재 평균 경색 볼륨 조정.도 3b에서 평균 데이터를 보여줍니다 62.8로 24 시간의 원시 (조정되지 않은) 병변의 부피 mm 3 (25.4 mm 3 SD, 상단 그래프 ±); 이 영향을받는 반구 (± 4.2 %의 SD, 중간 그래프)의 9.8 %를 차지한다. 이 값이 4.5 % (± 2.0 %의 SD, 아래 그래프)로 감소 리츠 '공식을 사용하여 부종 뇌 보정합니다.

    스트로크 심각도는 몬토야 계단 시험 (15)를 사용하여 측정 하였다. 간단한,에nimals 4 주 전에 MCAO에 뇌졸중 수술을 위해 설탕 알약을 검색하는 사전 훈련 및 지속적인 적자를 확인하는 뇌졸중 (그림 4) 다음 팔주에 대해 시험 하였다. 래트를 10 분 동안 계단 장치에 배치하고, 검색된 펠릿의 수는 (21 펠릿)의 개 기록 백분율 (그룹 ± 표준 오차를 의미한다)로 표시 하였다. 회귀 분석은 데이터 라인에 맞게 하였다.

    도 5 (후보 치료의 잠재적 효과) 경색 량 데이터를 사용하여 샘플 크기 계산을 나타내고, "두 개의 독립적 인 수단 (두 그룹)의 차이"를 사용하고 (나안을 이용하여 t-시험 전력 분석 소프트웨어 알고리즘을 이용하여 분석 ) 수단도 3b에서 표준 편차. 그림 5 표 1 쇼의 정보는 12 쥐 inf를 감소 치료를 감지하는 그룹별로 필요한 것24 시간에서 50 % arct 볼륨, 그림 6 동안 동물의 다양한 숫자를 사용하여. 표 1은 모든 시점의 표본 크기 계산을 요약 달성 권력의 "XY 플롯을"보여줍니다.

    그림 3
    그림 3. T2 강조 구조 MRI는 뇌졸중 후 붓기 경색과 뇌의 크기를 측정하는 데 사용됩니다. (A) T2 강조 자기 공명 같은 쥐의 뇌 24 시간의 이미지와 뇌졸중의 유도 후 팔주. 흰색 영역은 병변을 나타냅니다뿐만 아니라, 팔주에 의해 해결 일부 vasogenic 부종이 포함되어 있습니다. (B) 경색 부피이자 키트의 의료 이미지 디스플레이 패키지 영역을 이용하여 측정하고, 사용한 3 시점 (N = 6)에 대한 평균 ± SD를 나타내는 그래프 상에 플롯된다. 에드로 인해 부종 뇌에 대한 수정되지 원시 병변 볼륨 (EMA), 영향 반구의 비율 병변 (부종에 대한 보정), 및 리츠 '공식을 사용하여 부종 뇌 보정 반구의 비율 병변이 여기에 표시됩니다. SD는 표본 크기 계산 (그림 5 참조)를 수행하기 위해 오히려 SEM보다 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    그림 4. 계단 시험을 잡고 알약을 검색에 장애를 보여줍니다.이 뇌졸중 모델에서 거의 자발적 회복이 있었다. 노인 쥐 뇌졸중은 지속적으로 도달 펠릿의 "계단 테스트"를 사용하여 주간 테스트에 의해 도시 손재주를 손상. 삽입 : 행동 테스트를 수행하는 쥐의 그림. 그래프는 스탠드 ± (평균을 보여줍니다(21)에서 (검색 펠릿의 ARD 오류) 수는 영향을받는 앞발로 주당 백분율)로 표시됩니다. N = 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 5
    원하는 치료 효과를 검출하기 위해 필요한 쥐의 그룹 번호를 결정하기 위해도 5의 샘플 크기를 계산. 전력 분석 소프트웨어에서 촬영이 스크린 샷은 그룹당 12 쥐의 50 %가 경색 량 감소 요법을 검출하도록 요구되는 것을 보여준다 24 시간에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 6
    그림 6. 전원 동물의 다양한 총 숫자를 사용하여 달성했다. 전력 분석 소프트웨어의 "값의 범위에 대한 XY 플롯을"노인 쥐의 다양한 (총) 번호를 사용하여 실험을 얻을 것이다 힘을 보여 매개 변수 지정 그림에 표시된 5. 표 1은 우리의 모든 결과를 요약 한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    뇌졸중 후 시간 : 병변의 용적의 감소를 검출하는데 필요한 그룹당 쥐의 수 :
    75 % 50 % 25 %
    24 시간 6 (12) (42)
    팔주 4 (5) (17)

    표 향후 가상 실험 그룹 당 샘플 크기 1. 계산. 전력 분석 소프트웨어를 사용하여 계산 (도 5 및도 6 참조). 표는 연구 시점들 각각에서 병변 부피의 25 %, 50 % 및 75 % 감소를 검출하기 위해 두 그룹 실험에 필요한 그룹당 쥐의 수를 나타낸다.

    Discussion

    설치류 MCAO 종종 인간 스트로크를 모델링하는 데 사용되는 기술이다. 이 모델은 프로토콜에 유의해야 할 몇 가지 세부 사항을 가지고있다. 우선, 경색의 크기 및 연구에서 사망의 수에 영향으로 실험을하는 동안 동물의 체온을 유지하기 위해 필수적이다. 바로 CCA의 과도 교합 동안 이소 플루 란을 중지하고 이소 플루 란에 대한 노출을 감소시켜 생존율을 증가시키기 위해 가온, 조용한 환경에서 래트를 유지하는 것이 가능하다. 연구진은 추가 유도의 스트레스를 능가 짧은 마취 기간 여부를 고려해야한다. 쥐의 (예를 들어, MCA는 분기) 혈관은 내 동물 (22)의 동료 사이에 다릅니다. 이 새로운 연구를 시작할 때이 점을 부담하는 것이 중요하다. 다른 CCA 폐쇄 시간이 평가 될 수있다 (예, 30, 45, 60, 90 분). 본 연구에서는 60 분의 폐쇄 시간이 사용됩니다. 다른 연구에서 우리는 45 것을 발견했다분 폐색 비슷한 크기의 대뇌 피질 경색하지만 개선 생존율의 일화 증거 원인이됩니다. 따라서, 외과의는 짧은 시간 폐색이 시작 (예를 들면, 30 분)이 필요하다면 교합 배 증가 그래야만 적절한 병변 양 (및 / 또는 필요한 행동 결손)이 수득되는지 여부를 확인하고있다. 행동 적자는 동일한 폐쇄 시간과 노인 쥐에 비해 성인 쥐에 지속되지 않습니다.

    MRI 병변 볼륨 연구 목적에 적합 여부 (특히 클루 시간 후)를 판정하는데 사용될 수있다. 작은 병변 (40 점 만점) 10 개 미만 0.5 mm 코로나 조각에 걸쳐 것이다. 중간 크기의 병변은 10과 20 관상 조각 사이에 걸쳐있다. 큰 병변은 이십 삼십 관상 조각 사이에 걸쳐있다. 매우 큰 병변은 마흔 조각 30 개 이상에 걸쳐 것이다. 우리의 경험에서 매우 큰 병변 (30 개 이상의 조각) 및 / 또는 탈출증의 아 크로스의 증거와 쥐의 중간 선은 일반적으로 예후가 : 짧은 폐쇄 시간이 고려 될 수 있습니다. MRI는 경색의 위치를​​ 평가하는 데 유용합니다 : 일부는 더 꼬리 쪽 위치하고 있으며 일부는 더 rostrally 있습니다.

    모두 경동맥에서 미주 신경을 분리 할 때 좀 더주의를 기울여. RALES (초조)는 뇌졸중 수술 후 발생할 수 있으며, 원인은 불분명하지만이 일부 동물에서 신경 손상으로 인해 수 : 우리의 경험에서, 예후는이 동물에 대한 매우 가난이며 일반적으로 인도적 그들을 죽일 것을 권장합니다.

    재현 피질 경색과 노인 쥐에서 허용 수술 후 생존율에 영구 투열 요법 MC​​AO 모델 결과. 이 기술은, 그러나, 실체 현미경 침습 수술을 필요 않는다. 동물이 수술 잘 회복 경우 무균 기술을 유지하는 것이 중요하다. 보관, 노광 및 동맥 응고 동안에 MCA 손상되지 않도록주의해야및 피질 표면 손상 경색 부분의 일부를 형성 할 수 피질 달리 노출 된 영역을 최소화한다. 절차를 설정하고 연구는 예를 들어, 후보 치료제를 시험하기 위해 수행되기 전에 폐색 회 경색 일관성을 달성하고 판정 할 수있는만큼의 경험을 얻기 위해 권장된다. 실험자는 ( "블록 무작위 배정") 가능한 수술 세션 내에서 어떤 치료를 무작위한다. 그것은 (과도 MCA 내고 대신 투열 요법의 사용하지 않는 한)이 모델은 MCA의 재관류를 포함하지 않는 것을 주목할 필요가있다. 사망률이 큰 피질 경색과 노인 쥐 높을 수 있지만, 짧은 폐색 회 사용하고 가능하면 (예를 들면 폐색시) 전신 마취에 대한 노출을 최소화하여 사망률을 감소시킬 수 있어야한다. 이소 플루 란 낮은 수준을 허용 할 수 담체로서 70 % N 2 O 30 % O 2의 사용은 사용될 : isoflu이 감소 노출RANE 높은 생존율의 원인이 될 수 있습니다.

    고려해야 할 또 다른 점은이 프로토콜에서 우리는 급성 CCA 폐쇄와 함께 시뮬레이션 반면, 죽상 동맥 경화증은 점진적 과정이다. 그러나 혈류 지속적인 적자 실질적인 감소는 많은 뇌졸중 환자에서 발생 탠덤 폐색 시뮬레이션. 쥐 영구 원심 MCAO 탠덤없이 CCA 폐쇄가 재현 (14) 스트로크를 유도하기 위해 실패 직렬 CCA 폐쇄하지 않고, 또한, 우리가 발견 상당한 자발적 회수는 8 주 동안 뇌졸중 치료의 장기적인 행동 평가를 배제 발생합니다. 대조적으로, 우리는 말단 MCAO 직렬와 CCA 폐쇄 노인 쥐에서 장기 적자를 유도 것으로 나타났다.

    결론적으로, 쥐에서이 절차는 하나의 새로운 치료와 다시의 해명의 테스트를 가능하게하는 데 사용할 수있는 지속적인 장애, 인간의 조건에서 본 것과 크기와 위치에 유사 뇌졸중의 원인허혈성 뇌졸중 후 쌍의 메커니즘.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
    Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
    Alcohol swabs UHS 20021
    Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
    Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
    Forceps Fine Science Tools 11019-12
    Isoflurane Abbott B506
    Silk sutures Harvard Apparatus 723288
    Cautery system Eschmann
    0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
    fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
    Thumb driven saline drip system
    Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
    1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
    Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
    Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
    Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
    4-0 Vicryl sutures Ethicon
    Vascular clip and applicator
    Operating microscope Zeiss
    Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
    Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
    25 g needles Terumo NN-2525R
    syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
    Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
    cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
    gauze sterilize before use
    Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
    Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
    Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

    References

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