Identifisering av sjeldne bakterielle patogener av 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det finnes en rekke sjeldne og derfor utilstrekkelig beskrevet bakterielle patogener som er rapportert å forårsake alvorlige infeksjoner, spesielt i immunkompromitterte pasienter. I de fleste tilfeller bare få data, hovedsakelig publisert som kasuistikker, er tilgjengelig som undersøke hvilken rolle slike patogener som en smittsom agent. Derfor, for å klargjøre den patogene karakter av slike mikroorganismer, er det nødvendig å gjennomføre epidemiologiske studier som omfatter et stort antall av disse bakteriene. Metodene som benyttes i en slik overvåkningsstudie må oppfylle følgende kriterier: identifikasjon av stammene må være nøyaktig i henhold til den gyldige nomenklatur, bør de være lette å håndtere (robusthet), økonomisk i rutinemessig diagnostikk, og de har til å generere tilsvar resultater mellom ulike laboratorier. Vanligvis er det tre strategier for å identifisere bakteriestammer i en rutine innstilling: 1) fenotypiske identifisering karakteriserer den Biochemical og metabolske egenskaper av bakterier, 2) molekylære teknikker som for eksempel 16S rRNA-genet sekvensering og 3) massespektrometri som en ny proteom- basert metode. Siden massespektrometri og molekylære tilnærminger er et viktig verktøy for å identifisere et stort utvalg av bakteriearter, er disse to metodene beskrevet. Fremskritt, begrensninger og potensielle problemer ved bruk av disse teknikkene er diskutert.

Introduction

Sikker identifikasjon av sjeldne patogener i rutinemessig diagnostikk er hemmet av det faktum at de klassiske kulturelle og biokjemiske metoder er tungvinte og ofte tvilsom. Videre har et diagnostisk mikrobiologiske laboratorier for å behandle et stort antall patogener, som strekker seg fra noen få hundre til flere tusen, daglig, noe som krever bruk av automatiserte systemer. I tillegg til forvaltningen av et høyt daglig gjennomstrømning, er presis identifisering av bakteriearter nødvendig. Dette er garantert, siden de har ulik antimikrobiell resistensmønster og derfor riktig identifisering gir klinikeren med viktig informasjon for å velge egnede antibiotika (f.eks Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Automatiserte mikrobielle identifikasjonssystemer (AMIS) gjelder standardiserte sett med enzymatiske reaksjoner for å karakterisere de metabolske egenskaper bakterieisolater for eksempel, 47 i GN-kort av den Amis brukt i denne studien 52, denne strategi tillater sikker identifisering kun for et begrenset sett av bakterier. Videre er database, en avansert ekspert system, tydelig fokusert på deteksjon av relevante og svært relevante bakterier av medisinsk betydning 13,15,16,36. Ytterligere to systemer, mye brukt i laboratorier, gjelder også denne biokjemiske tilnærmingen for bakteriell identifikasjon. Nyere studier viser en tilsvarende identifikasjon nøyaktighet mellom AMIS brukt i denne studien og en av konkurrentene (93,7% og 93,0% henholdsvis), mens det 3. AMIS har en identifikasjon nøyaktighet på bare 82,4% på artsnivå 35. Slike avvik kan forklares med kvaliteten på de underliggende identifikasjon datareferanser, versjonene av kits og programvare, forskjeller i metaboLISM og ferdigheter av teknisk personell 35,36.

To automatiserte MALDI-TOF MS-systemer (MALDI-TOF mikrobiell identifikasjon system, MMIs) er i hovedsak brukt. Disse systemene gir mulighet for deteksjon av et stort antall bakteriearter basert på deres protein fingeravtrykk massespektra. For eksempel inneholder databasen av MMIs anvendt 6000 referanse-spektra. Identifikasjonssystemer basert på massespektrometri tilby en rask og pålitelig deteksjon av et stort utvalg av mikroorganismer, inkludert sjeldne patogener 11,48,51. Til dags dato bare noen direkte sammenligninger er tilgjengelig mellom MMIs brukt i denne studien og konkurrenten 19,33. Ifølge dæk et al. Begge systemer gir en tilsvarende høy grad av identifikasjon nøyaktighet, men MMIs brukt i denne studien synes å være mer pålitelig i artsbestemmelse 19.

Tilsvarende molekylære teknikker adressering godt bevart, men også forskjellige gener ( rpoB) tillate en klar identifisering av arter 3,22,61. Blant disse, er den 16S rDNA den mest brukte husholdningsgenet på grunn av dens tilstedeværelse i alle bakterier 34. Dens funksjon er uendret, og til slutt, med omtrent 1500 bp, det er lenge nok til å være egnet for bio-informatikk 14,34. Mange forskere anser 16S rRNA-genet analyse som "gullstandard" for bakteriell identifikasjon 21. Dette skyldes det faktum at noen få laboratorier bruke DNA-DNA-hybridiseringsteknikker til dags dato for identifisering av sjeldne eller nye bakterier 14,34. I tillegg er flere og flere databaser er tilgjengelige som kan anvendes for 16S rRNA-genet analyse 50. Imidlertid må det tas hensyn til at 16S rDNA baserte deteksjonssystemer har en begrenset sensitivitet i forhold til standard PCR protokoller. Videre er molekyl tilnærmingen sofistikerte, tidskrevende og krever høyt kvalifisert personell samtdedikerte laboratoriefasiliteter og er derfor ikke lett implementeres i rutinediagnostikk 55. Videre har det blitt vist at en kombinasjon av minst to forskjellige fremgangsmåter for bakteriell identifikasjon fører til meget nøyaktig belastning identifikasjon. Kombinasjonen av MALDI-TOF MS og 16S rDNA-sekvensering tillater identifisering av et stort antall forskjellige bakteriearter med høy nøyaktighet. Nylig kombinasjonen av MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet analyse ble presentert for bakteriell identifikasjon studere epidemiologiske spørsmål og sjeldne patogener 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utvinning av bakteriell DNA

  1. Fremstilling av PBS-oppløsning
    1. Veie 1,65 g Na HPO 2 4 x 2 H 2 O, 0,22 g NaH 2PO 4 x 2 H 2 O og 8,80 g NaCl i en kolbe og fylles med destillert vann til et sluttvolum på 1000 ml. Juster pH-verdien til 7,4. For endelig bruk filtrere oppløsningen gjennom et bakterietett (0,22 um) filter.
  2. DNA Utvinning av gram-negative bakterier
    1. Streak pasientmaterialet på riktig dyrkningsmedier (f.eks Columbia blod agar), identifisere og isolere potensielle patogener.
    2. Fremstille ren kultur og utføre Gram-farging for å bestemme morphotype og for å bekrefte renheten og av kulturen 49.
    3. Plukk en enkelt bakteriekoloni og overføre den til en 1 pl engangsbruk inokulering sløyfe inn i en steril 2,0 ml reaksjonsrøret som inneholder 1 ml PBS-oppløsning.
    4. Inkuber denne suspensjonen i en Thermomixer ved 95 ° C i 10 min. Etter inkubasjon la bakterieekstrakt (inneholdende det oppløste DNA) avkjøles til romtemperatur og enten brukes direkte for amplifikasjon eller oppbevar ved -20 ° C for videre bruk (figur 1a).
  3. DNA Utvinning av Gram-positive bakterier
    1. Streak pasientmaterialet på riktig dyrkningsmedier (f.eks Columbia blod agar), identifisere og isolere potensielle patogener. Utføre Gram-farging for å bekrefte morphotype av kulturen.
    2. Fremstille ren kultur og utføre Gram-farging for å bestemme morphotype og for å bekrefte renheten av kulturen.
    3. Plukk en enkelt bakteriell koloni med en steril 1 ul inokulasjon sløyfe og suspendere det i 500 ul PBS-løsning i en 2,0 ml reaksjonsrøret.
    4. Legg 500 mL glassperler og overføre røret til en oscillerende homogenisator som drives ved maksimal frekvens og amplitude (50 Hz) i 5 minutter. Bruk glassperler med diameter 1,0 mmå forstyrre de bakterielle celleveggene.
    5. Inkuber dette rør i 10 minutter ved 95 ° C og avkjøles til romtemperatur. Bruk ekstrakt enten direkte for PCR reaksjon eller oppbevar ved -20 ° C for videre bruk.

2. 16S rDNA PCR

  1. Utarbeidelse av amplifiseringsprimere
    1. Bruk primere TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) som fremover primer og RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') som revers primer 25. Fremstille en primer stamløsning med DNAse og RNAse fritt vann, med en konsentrasjon på 100 pmol / ul (100 pM) og fortynne det videre til en fungerende løsning på 10 pmol / ul. Oppbevar primer lager og arbeidsløsning ved -20 ° C eller bruk direkte.
  2. Fremstilling av PCR-reaksjonen Mix
    1. Pipetter 1 ul av hver primer, 1 ul dNTP-blanding (100 mM), 2,5 ul av DNA-ekstrakt, 5 ul 10 x PCR-buffer (inneholdende 25 mM MgCl 2), 0,25 ul Taq-polymerase (5 enheter / ul) og 39,25 ul DNAse- og RNase fri PCR vann inn i en steril 200 mL reaksjonsrør.
  3. PCR-protokoll
    1. Start PCR-program bygget som følger: Først, en første inkuberingstrinnet ved 95 ° C i 5 minutter som er nødvendig for å aktivere den Taq-polymerase. For det andre, 35 amplifiseringscykluser, inneholdende et 1 min. denatureringstrinn ved 95 ° C, en 1 min. primer glødetrinn ved 50 ° C, og en 1,5 minutter primer-forlengelsestrinn ved 72 ° C. For det tredje, en endelig forlengelse i 10 minutter ved 72 ° C. Til slutt blir den PCR-reaksjonen ble avkjølt til 4 ° C.
      MERK: Staphylococcus aureus og H 2 O tjene som positiv og negativ kontroll (Figur 1b).
    2. Plasser røret som inneholder PCR-reaksjonsblandingen i thermocycler og starte programmet.
  4. Rensing av PCR Product
    MERK: For å rense PCR produktet, flere protokoller entenenzymbasert eller med et silisiumdioksyd adsorpsjon matrise kan anvendes. Den single-trinns PCR opprydding brukt her benytter to hydrolytic enzymatiske reaksjoner. Mens Exonuklease I (Exo I) fjerner enkelttrådet DNA, reker alkalisk fosfatase (SAP) hydrolyserer uinkorporerte dNTPs. Den andre fremgangsmåten er basert på en silika-membran adsorpsjon teknikk med en høy salt rask binding - vaske - lav salt eluering syklus.
    1. Tilsett 1,5 mL av en enzymatisk blanding som inneholder både Exo I og SAP til 25 ul PCR-produkt, bland godt og overfør til en termo anvende en enkel protokoll for første 15 minutter ved 37 ° C etterfulgt av 15 minutter ved 80 ° C. Oppbevar rensede PCR produktet enten ved -20 ° C eller bruke den direkte som mål for merking PCR.

3. DNA agarosegelelektroforese

  1. Fremstilling av elektroforese buffer (TBE-buffer)
    1. Titrere 54,0 g (445 mM) Tris-base, 27,5 g (445 mM) borsyre og 20 ml av en 0,5 M EDTA (10mM) oppløsning ved pH 8,0 med NaOH i en kolbe og fylle den med destillert vann til et totalt volum på 1000 ml. Deretter fortynne denne 5x buffer 01:10 med destillert vann (0,5x TBE) for elektroforese.
  2. Fremstilling av ladningsbuffer
    1. Bland 250 mg bromfenolblått, 250 mg xylen cyanol FF og 15 g av polysucrose (Materialer tabell) i en kolbe. Deretter fylles den med 0,5x TBE-buffer til et totalvolum på 100 ml. Delmengde lasting fargestoff til 1 ml porsjoner og oppbevares ved -20 ° C for videre bruk.
  3. Støping av agarosegelen
    1. Vei 6 g standard elektroforese agarose i 300 ml 0,5x TBE-buffer (se avsnitt 3.1.1) i en kolbe, for å fremstille en 2% (w / v) agarosegel. Deretter satte agarose blandingen i en mikrobølgeovn, varme den nesten kokepunkt inntil agarose er helt oppløst og løsningen synes klart.
    2. La de smeltede agarose avkjøles tilstrekkelig og tilsett 10 ul av en 1% (w / v) lager etidiumbromid oppløsesjon. Hell blandingen i en cast og plassere en gel kam (noe som åpner for 30 brønner) i kastet. Fjern kammen når gelen er helt størknet og sette gelen inn i elektroforese kammeret inneholder 0.5x TBE buffer.
      MERK: Etidiumbromid er giftig og mutagene. Derfor bør det håndteres med forsiktighet. Det anbefales å bruke nitrilhansker. Det finnes alternative interkalerende nukleinsyre-flekker som kan anvendes som et ikke-toksisk alternativ.
  4. Agarosegel-elektroforese av PCR-produktene
    MERK: For å verifisere riktig størrelse av PCR amplikonene og beregne DNA-konsentrasjonen den rensede PCR-produktet blir separert i en agarosegel.
    1. Pipetter 2 ul av lastebuffer inn i en PCR-reaksjon rør og legge til 8 pl av PCR-produktet. Pipette denne blandingen inn i brønnene i gelen. Legg 8 ul av en molekylvekt størrelsesmarkør (DNA stige) i en separat brønn for å anslå størrelsen av PCR-produktet.
    2. Søkeen konstant spenning på 10 V / cm og stoppe elektroforese så snart bromfenol blå markøren har nådd omtrent? av den totale lengden av gelen. Visualiser den separerte PCR-fragmenter ved hjelp av en UV-transilluminator (bølgelengde 302 nm) og dokumentere dem ved hjelp av en gel-dokumentasjonssystem. Anslå mengden av DNA ved hjelp av visuell sammenligning med DNA-stige. Bruk omtrent 10 ng som mål for merking PCR.

4. Sanger Sekvense

  1. Cycle Sequencing PCR
    MERK: Utfør PCR merking i et 10 mL reaksjon ved hjelp av et kommersielt kit (Materialer tabell).
    1. Tilsett 2 mL 5x reaksjon Mastermix, 2 mL av DNA forberedelse, 1,5 mL av TPU1 eller RTU4 arbeidsløsning (10 pmol / mL) og 4,5 mL av DNAse og RNase fritt vann.
    2. Sett denne sekvensereaksjonsblandingen i en termo og kjøre en annen PCR. I alt prosess 25 sykluser bestående av et denatureringstrinn (96 ° C,10 sek), et glødetrinn (45-60 ° C, 5 sek) og et forlengelsestrinn (60 ° C, 2 min). Til slutt avkjøles reaksjonsblandingen til 4 ° C.
  2. Rensing av sekvenseringsreaksjon
    1. Rense merking reaksjonsblandingen ved hjelp av kommersielle spin kolonner for PCR rensing (Materialer tabell).
    2. Belastning 10 ul av sekvenseringsreaksjon på pre-hydratisert gelfiltrering matrise og utfører en sentrifugeringstrinn ved 750 x g i 3 min.
      MERK: Ved anvendelse av denne fremgangsmåte er beskrevet på kartet fargestoffterminatorer beholdes i gelmatriksen.
    3. Tørk det vandige eluat i en vakuum-konsentrator. Sentrifuger ved 2500 xg i 20 til 30 minutter ved 40 ° C til fullstendig tørrhet.
    4. Tilsett 10 mL av høyt deionisert formamid deretter denaturering ved 90 ° C i 2 minutter og avkjøl blandingen på is. Pipetter 10 ul av de denaturerte prøvene på en 96-brønners plate ul. Oppbevar tørket og renset PCR-produkt ved -20 ° C dersom analysensom skal utføres på et senere tidspunkt.
  3. 16S rRNA Gene Sekvensering og analyse av DNA-sekvens
    MERK: Utfør sekvens analyse på en automatisert sequencer (Materialer tabell). Sekvenseren som brukes her er en automatisert fluorescens-baserte kapillær elektroforese system som analyserer 4 prøver samtidig (50 cm 4-kapillaroppstillingen) med en flytende polymer 67 (figur 1c).
    1. Plasser mikrotiterplate i sekvenseren. Skriv en prøve ark (plate rekord) som legges ut i to, lagre den og starte sekvense løp / analyse følge trinnene gitt i en.
      MERK: Varigheten av en sekvens løp er 2 timer og gir data fra 800 til 1000 bp.
    2. Åpne sekvensering analyse programvare (Materialer tabell). Sekvensdata er gitt som en tekstfil (.seq) og en fil som inneholder elektroferogrammet inkludert kvalitet verdier (QV) (.ab1).
      MERK: Base ringer er automatisk perdannet ved sekvensanalyse-programvare og den underliggende elektroferogrammet blir kontrollert visuelt (f.eks topphøyde, peak separasjon) før sekvensen blir brukt for videre anvendelser.
    3. Sammenlign lagret DNA-sekvensen filen til NCBI nr databasen ved hjelp av BLAST-algoritmen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

MERK: massespektrometer bruker en 337 nm N2 laser og drives av en bestemt kontroll programvare (Materialer tabell). Spektra er registrert i lineær modus og en masse på mellom 2000 til 20 000 Da er dekket. Tolking og anvendelse av scorene til prøvene utføres i sanntid ved en analyse programvare (Materialer Table) (figur 1d).

  1. Fremstilling av bakterier for MALDI-TOF-MS-analyse
    1. Grow bakterier av interesse (f.eks Myroides odoratimimus) på ColUmbia blod-agar inneholdende 5% hesteblod ved 37 ° C i 18 til 24 timer, avhengig av bakteriestammen (figur 2a). Utføre Gram-farging for å verifisere morphotype av organismen som undersøkes, samt renhet av kulturen.
    2. Bruke en av tre tannpirker for overføring av en enkelt bakteriekoloni til en brønn i en 96-brønns stål målet (figur 2b og 2c). Spot 1 mL av 70% maursyre på toppen av lufttørket organismen på stålet målet og la tørke i ca 2-3 min.
    3. Deretter overlappe flekk med 1 pl matriseoppløsningen, inneholdende 50 mg / ml CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic-syre) i et organisk løsningsmiddel (50% acetonitril, 2,5% trifluoreddiksyre, 47,5% H2O).
      MERK: Syren overlegg metode (på tallerkenen fremstillingsmetode) kan anvendes for å forbedre kvaliteten på massespektra. Det har vist seg at for Gram-positive bakterier som en "syreangrep" øker poengsummen values av den målte spektra 45.
      MERK: Alternativt kan en automatisert prøvepreparering system (Materialer tabell) kan anvendes i hvilken kontakt fri flekker av 1 pl 70% maursyreløsning og, etter at en første tørkesyklus, blir 1 pl matriseoppløsning brukt på bakteriesmitte. Prøvene blir så tørket under standardbetingelser ved 60% relativ fuktighet, og er klar til bruk for analyse.
    4. La smøre med matrise kledde lufttørke igjen i ca 5 min i en hette. Dette bakteriell smøre med matrisen brukt er nå stabil i mange timer.
      MERK: Bakterieflekker uten matrisen kan ikke være stabil på grunn av protein degradering.
  2. Utføre MALDI-TOF MS analyse
    1. Innføring av prøvene
      1. Åpne kontrollprogramvare av våre MMIs (Materialer Table).
      2. Luft prøven lasteporten på massespektrometer ved å trykke inn / ut av instrumentet.
      3. Åpne lastehavn etter et klikk og sett MALDI-TOF MS sikteplate med tørket bakterieprøve pluss matrise.
      4. Lukk porten og evakuere igjen. Observer vakuum og når den når 4,5 x 10 -6 mbar starte målingen.
    2. Sample Analysis
      1. Åpne analyse programvare for våre MMIs (Materialer tabell), og klikk på "File" -menyen. Velg "Ny klassifisering" og et nytt vindu "MALDI biotyper sanntid klassifisering wizard" åpnes. Skriv inn navnet på prosjektet, for eksempel "Myroides måling project_1, i feltet" Prosjektnavn "og trykk på knappen" Ny ". Under den nye dialogboksen som heter" Nytt prosjekt "check prosjektnavn og fortsett ved å trykke på knappen" OK ".
      2. I "MALDI biotyper sanntid klassifisering wizard" observere "Analyttforringelse plassering" vinduet åpent. Velg målposisjoner (f.eks A1, A2, A3 ...), høyre click enhver valgt posisjon (indikert med en blå firkant) og velg "Legg prøver". I automatisk åpnet tabellvisning type i prøvenavnet, prøve ID og eventuelt en kommentar. Klikk på knappen "Next" for å fortsette.
      3. I "MALDI biotyper sanntid klassifisering wizard" observere "Valg av MALDI biotyper metoder" vinduet åpent. Velg "Bruker taksonomi" fra "MSPs fra taksonomi trær" og klikk "Next" for å fortsette.
      4. I "MALDI biotyper sanntid klassifisering wizard" observere "Project Sammendrag" vinduet åpent. Sjekk de innsatte oppføringene gitt ovenfor for selve klassifiseringsprosjektet. Start klassifisering kjøres ved å trykke på knappen "Finish" (figur 2d - f). Målingen starter automatisk når riktig vakuum er nådd.
      5. Følg klassifiseringen kjøre til målingen er fullført. Se resultattabellen i than "MALDI Biotyper Realtime Klassifisering Prosjekt Myroides måling project_1" åpne menyen "View" og klikk "Resultater".
      6. Se de "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Klassifisering resultater" som HTML-fil i standard nettleser. Skriv ut og lagre resultatene.
    3. Mål en test standard daglig før prøveanalyse for å kalibrere instrumentet og utføre instrument validering ukentlig (instrument selvtest).
      MERK: Under måling MALDI-TOF spektra analyseres i sanntid ved analyse programvare (Materialer tabell). En liste over ti arter med sine respektive score er gitt, og mates inn i laboratoriet informasjonssystem (LIS) for rapportering.
    4. Kritisk vurdere resultater av MALDI-TOF MS (se representative resultater) og, eventuelt inkludere andre tester, for eksempel biokjemiske- og antibiotika resistensprofiler eller 16S rRNA-genet sekvensering og, om nødvendig, Gram-farging fortildele en bakteriearter til mikrobiologisk rapport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS er en roman, rask og billig metode for mikrobiologiske rutinediagnostikk. Bakteriell artsidentifikasjon av MALDI-TOF MS produserer spektra i hovedsak består av ribosomale proteiner, men også andre "svært konserverte proteiner med vaktmester funksjoner påvirkes i liten grad av miljøforhold" 17 sikret database med dette MMIs inneholder et stort sett med referanse spektra og selv bakterier som er sjelden funnet i kliniske isolater kan sikkert identifiseres 7,56,57. Score verdiene viser påliteligheten av de identifiserte arter. Score over 2.300 representerer en svært sannsynlig artsbestemmelse, en poengsum mellom 2.000 og 2.300 indikerer en sikker artsbestemmelse, en poengsum mellom 1.700 og 2.000 står for en sannsynlig identifisering av arter og en score under 1.700 er ikke pålitelig. I tilfelle av mer enn en art som blir identifisert med en skåre over 2.000, videre tests må brukes, og dette er grunnen til at vi har kombinert forskjellige metoder slik som 16S rDNA-sekvensering, API og teknikker adresseringsbakterie morpho- og / eller fenotype slik som Gram-flekk, motilitet etc. I det tilfelle hvor resultatet er nedenfor 1.700 de ovenfor nevnte testene må brukes for å oppnå pålitelig artsidentifikasjon. En kombinasjon av MALDI-TOF MS og 16S rDNA-sekvensering er blitt vist nylig 56-58. Det bør påpekes at klare retningslinjer for arter fastsettelse basert på 16S rDNA sekvenshomologier fortsatt mangler 22,61. For praktisk tolkning, homologies av ≥97%, som foreslått av Stackebrandt og Göbel 61, blir brukt 56. Fremskritt i DNA-sekvensering tillater bestemmelse av hele bakterielle genomer hos neste generasjon teknikker ved relativt lave kostnader, og derfor i prinsipp identifisering av bakterier basert på deres genom sekvens. Denne teknikken har allerede blitt brukt igenom basert utbrudd ledelsen eller i epidemiologi 9,29. Men den sterkeste begrensningen i dag er mangelen på enkel å bruke programvarepakker for sluttbrukeren 65.

Syv eksempler på sjeldne forekommende bakterier, isolert fra pasientprøver i løpet av rutinemessig diagnostikk og analysert ved både MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekvensering er oppført i tabell 1. MALDI-TOF-spektra av stamme # 1 til # 6 er vist i figur 3 og et spektrum av stamme # 7, Sphingobacterium spiritivorum, er vist i figur 1e. Alle isolater viser høye poengsummer i MALDI-TOF MS analyse og 99 til 100% 16S rDNA sekvenshomologier. Således begge teknikkene fører til sikre slekt og art identifikasjon. Imidlertid, som påpekt i en nylig publikasjon på å sammenlikne identifikasjonsmetoder Myroides sp., Kombinasjonen av MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekvense ført til mer pålitelig rESULTATER 56. Disse data illustrerer at en enkelt metode som brukes kan ikke alltid være tilstrekkelig til å oppnå et pålitelig identifikasjon resultat. Kombinasjonen av to uavhengige metoder fører til en høyere nøyaktighet og utvider den kommersielle MALDI-TOF MS database med in-house oppføringer resulterte i en utvetydig identifisering av arter 56.

Stamme nr 1 ble identifisert som Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS scorer 2.490, sekvens homologi 99%). Chryseobacteria er Gram-negative, ikke-fermen stenger og relatert til Myroides spp. Chryseobacterium spp. regnes som nye patogener, i forbindelse med sepsis, lungebetennelse og urinveisinfeksjoner. Slekten Chryseobacterium består av et stort antall arter og de ​​beste studerte artene er Chryseobacterium indologenes. I likhet med infeksjoner forårsaket av Myroides sp., Er for det meste immunsupprimerte pasienter berørt6,10,60. Stamme nr 2 ble identifisert som Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS scorer 2,436, sekvens homologi 99%) og belastning # 3 som Myroides odoratus (MALDI-TOF MS scorer 2,237, sekvens homologi 99%) Myroides sp. er Gram-negative, nonfermenting stenger som er forbundet med alvorlige sykdommer så som sepsis, cellulitt eller lungebetennelse. Mostly immunsupprimerte pasienter med underliggende hematologiske eller onkologiske sykdommer påvirkes 8,18,42. Stamme nr 4 ble identifisert som Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS scorer 2,092, sekvens homologi 99%).

Bakteriene er Gram-negative ikke-fermen stenger, som kan forårsake sepsis hos immunsupprimerte pasienter 5,24,44,53. I tillegg har et tilfelle av dødelig meningoencefalitt blitt rapportert 70. Flekker # 5 (MALDI-TOF MS ballen 2,282, sekvenshomologi 100%) og # 6 (MALDI-TOF MS ballen 2,289, sekvens homology 100%) ble identifisert som Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Disse bakterier er korte, ikke-motile, gram-negative staver som først ble isolert fra larver av den parasittiske flue Wohlfahrtia forstørring og beskrevet i 2008 66. Disse zoonotiske bakterier ansees som nye patogener og utløsende agenter for bakteriemi, sepsis eller bløtdelsinfeksjoner 4,40,64. Interessant, de fleste pasienter rapporterte var enten hjemløse og / eller led av alkoholisme og kan derfor forekomsten av disse sjeldne patogener forklares med høyere rate av ektoparasitter i hjemløse befolkningen 4,54. Strain # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS scorer 2,269, sekvens homologi 100%), er en sjelden patogen. Det kan føre til infeksjoner i immunkompromitterte pasienter og første menneskelige isolater ble beskrevet i 1982 31,71. En fersk rapport identifiserer Sphingobacterium spiritivorum som forårsaker agent for et dødelig tilfelle av bacteremia og sepsis hos en pasient med akutt myelogen leukemi 38.

Figur 1
Fig. 1: Arbeidsflyt for nukleinsyre og / eller massespektrometri basert deteksjon av klinisk relevante bakterier i medisinsk mikrobiologi starter fra en ren kultur (a), mål-DNA blir amplifisert i en termosykler (b). PCR-amplikoner er sekvensert i en fire kapillær sekvens ved hjelp av Sanger-teknologi (c). Sekvense resultater bestemmes som prosent homologies av spørresekvenser til databasemeldinger fra dataassistert sammenligning. En annen, proteomikk baserte metode, bruker massespektrometri (d) og i sentrum et massespektroskopiske resultat av stamme nr 1 i tabell 1, Sphingobacterium spiritivorum, inkludert dens MALDI-TOF MS stillingen, er gitt (e </ Strong>). En kombinasjon av massespektrometri og 16S rRNA-genet sekvensering kan være nødvendig for å oppnå en mer pålitelig og nøyaktig identifisering av arter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Analyse fremgangsmåte ved hjelp av MALDI-TOF-MS for identifisering av klinisk relevante bakterier En operatør tar helcelle bakterielt materiale (a) med en tannpirker fra en ren kultur (b) og plasserer bakterieflekker på stål mål (c). Stålet Målet er satt inn i lastehavnen av massespektrometer. Når den riktige vakuum på 5 x 10 -6 mbar er nådd, vil målet bli flyttet til ioniseringskammeret. Ved hjelp av en N 2 -laser, blir ioner laget av myk desorpsjon som så blir akselerert i et elektrostatisk felt (d) og separert i flyet røret (e). Flukttiden (TOF) som er nødvendig for ionene for å nå detektoren av flyge rør (f) er direkte relatert til deres masse og danner grunnlag av etterfølgende beregninger av massetopper. Spesifikk identifikasjon programvare (Materialer Table) tildeler deretter rille verdier til massespektret fingeravtrykk av ioniserte bakterielle proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: MALDI-TOF spektrene og tildelt score av sjeldne patogener i denne figuren, representative MALDI-TOF spektra av de første seks sjeldne patogener lis.ted i tabell 1 er vist. Artsnavnet og tilhørende MALDI-TOF MS poengsum noteres i hvert spektrum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

# 3
Press MALDI identifikasjon MALDI poengsum 16S rDNA resultat BLAST homologi
#1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% identitet
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% identitet
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% identitet
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% identitet
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabell 1: Representant MALDI-TOFS resultatene av sjeldne forekommende bakterier i forhold til 16S rRNA-genet sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Både MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekvensering gir mulighet for å identifisere et stort antall forskjellige bakterier. MALDI-TOF MS er en rask og billig fremgangsmåte, som er lett å håndtere og store databaser med bakteriell massespektra er tilgjengelige. Av denne grunn er MALDI-TOF MS en rask, kostnadseffektiv og pålitelig metode for å gjennomføre screening studier fokusert på sjeldne bakterielle patogener 17,20,39,51. I en prospektiv studie som sammenlignet MALDI-TOF MS med andre fenotypiske identifikasjon metoder, Seng et demonstrerte kostnadseffektivitet og hastighet av MALDI-TOF MS 59 og Tan al. Et al. Rapportert en reduksjon reagenser og lønnskostnader for bakteriell identifikasjon i sitt laboratorium med 56,9% årlig 62. Slike kostnadsreduksjoner er støttet av et notat fra Gaillot et al. 28

På den annen side, er 16S rDNA sekvense mer tidkrevende, arbeidskrevende og warrants spesialisert personnel å utføre analysen 34. Ikke desto mindre, begge metoder er egnet for rutinemessig diagnostikk og det kan påvises at kombinasjonen av disse to fremgangsmåter fører til en høyere pålitelighet og sikrere identifikasjon nøyaktighet, noe som er særlig gunstig i tilfelle av usikre resultater 56. Derfor foreslår vi en kombinasjon av begge metoder som den beste tilnærmingen for å bekrefte identifisering av sjeldne forekommende bakterier i rutinemessig diagnostikk. For pålitelig artsbestemmelse, er det helt avgjørende å bruke rene bakteriekulturer fordi blandede kulturer hindre arter besluttsomhet. Som et Plausibilitetskontroll, artsbestemmelse oppnådd med enten MALDI TOF MS eller 16S rDNA sekvensering må være i samsvar med resultatene fra Gram-farging, biokjemisk karakterisering og den kliniske presentasjonen 49.

Massespektrometri som analyseverktøy for bakteriell identifikasjon ble først foreslått i 197551. Men tok det før på slutten av 1980-tallet for å etablere en praktisk tilnærming for protein analyse. Den "myke desorpsjon ionisering" teknologien ble introdusert av Koichi Tanaka i 1985 63, som fikk Nobelprisen i kjemi i 2002, slik at analyse av intakte proteiner. Samtidig er det matrise-assistert ionisering flukttid massespektrometri ble introdusert av Hillenkamp og Karas som de var de første til å bruke en organisk syre for å analysere biomolekyler 37, og dette er den fremgangsmåte som er fortsatt i bruk i dag. Selv om MALDI teknologien har blitt brukt sporadisk 23,30,41, tok det frem til 2004 da Bruker Daltonics introduserte sin Micro MALDI Biotyper system (Pittcon Conference & Expo 2004, pressemelding), som MALDI-TOF MS basert mikrobiell identifikasjon ble en rutine diagnostisk teknikk 46. Nyere tilnærminger i MALDI-TOF MS teknikker ga mulighet til å identifisere gjær, oppdage multiresistente bakterierog utføre antimikrobiell resistenstesting 17,51. Videre kan visse prosedyrer tilbyr muligheten til direkte å analysere bakterier fra primærprøver, som for eksempel urin eller blodkulturer 17,51.

Selv om bruk av dette system er først og fremst lett, er det noen fallgruver som kan påvirke resultatene. Alderen på mikroorganismer for eksempel påvirker det bakterielle protein ekspresjon og derfor reproduserbarheten av resultatene. For det første kan vekstbetingelser være et problem. Som et eksempel, enterobakterier, som Escherichia coli vokse raskere enn ikke-fermenterende bakterier (for eksempel Pseudomonas aeruginos a), og følgelig må analyseres tidligere 17. For det andre, den matrise som brukes til MALDI-TOF MS består av små organiske syremolekyler som har en sterk absorbsjon for laser optisk bølgelengden av laseren som brukes. Før analyse matrisen blir tilsatt til prøven og begge komponentene gjennomgår en krystalliseringn prosess som danner en fast oppløsning.

Dette forklarer hvorfor endringer i matrisen kan påvirke nøyaktigheten av bakteriell identifikasjon 17. Derfor nylaget matrise løsninger, ikke eldre enn 7 dager, bør brukes. For det tredje, det medium hvorfra bakterier blir plukket kan innvirke på identifikasjon resultatene 17,68. For eksempel, krystallfiolett, som er en komponent av MacConkey agar, griper inn i 17 massespektra. I tillegg vil for mange bakterier gjelder på Stålmål føre til lavere score og dermed påvirke identifisering nøyaktighet. Derfor er det lurt å definere klare kriterier for hvordan en analyse utføres. Imidlertid er misvisende resultater som utføres ved MALDI-TOF MS for det meste forårsaket av utilstrekkelig referansespektra som inneholdes i databasen. (Foreløpig databasen inneholder> 6000 oppføringer.) Dette er spesielt fortsatt tilfelle for identifisering av anaerobe bakterier 17. Men endditional spektra kan legges av brukeren. MALDI-TOF MS bibliotek for eksempel inneholder 98 ekstra referanse spektra av isolater som ikke blir tilstrekkelig ivaretatt ved den opprinnelige databasen, for eksempel Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Og Chryseobacterium sp. Følgelig vil ytterligere referanse spektra føre til en høyere identifikasjon nøyaktighet 59,69. Til slutt, i noen tilfeller spektra av forskjellige arter er svært like. Dette kan føre til forveksling i tilfeller som diskriminering av Escherichia coli og Shigella spp. eller Streptococcus pneumoniae og Streptococcus Mitis 17,51.

Sekvensering av 16S rDNA og flere gener som rpoB har forenklet molekylær identifisering av sjeldne eller ukjente bakterier. Disse gener er vanlig i de fleste bakterier og deres individuelle funksjon eridentisk. Men siden de besitter tilstrekkelig genetisk variasjon for å gi resultater som muliggjør en differensiering av slekten og artene nivå, kan de brukes for bakteriell identifikasjon 34. Ifølge Stackebrandt og Göbel, homologies <97% representerer ulike arter 61. Men homologies> 97% ikke nødvendigvis føre til en sikker artsbestemmelse 34,47. Disse usikkerhetene har flere grunner.

Kvaliteten av databasene som brukes til å beregne homologi er noen ganger tvilsom 34. I tilfeller der høye homologies på 16S rDNA nivå eksisterer, kan usikkerhet føre til artsbestemmelse. En kombinasjon av forskjellige genetiske regioner kan derfor føre til mer sikre resultater. Dessuten er det ingen generelle retningslinjer for tolkning av 16S rDNA sekvense data 22,34,61. En økning av påliteligheten av de eksisterende databaser vil føre til en høyere accuracy for bakteriell identifikasjon ved hjelp av denne molekylære tilnærmingen 34. Angående sekvenseringsreaksjon må vi nevne at nøyaktigheten av sekvenseringsresultatene for det meste avhengig av kvaliteten på det underliggende PCR. Videre, ettersom resultatene blir oppnådd ved å sammenligne dem til oppføringene i offentlige databaser, kvalitet på sekvens oppføringer og vedlikehold av data er av avgjørende betydning.

Generelt, selv om begge tilnærminger, MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekvensering, har fordeler de har også svakheter. En kombinasjon av begge fremgangsmåter fører imidlertid til en høy nøyaktighet for bakteriell identifikasjon. For eksempel, i en tidligere studie kan vi vise at MALDI-TOF MS er i stand til å skille mellom Myroides odoratimimus og Myroides odoratus 56. I noen få tilfeller MALDI poengsum foreslo upålitelig artsbestemmelse, mens resultatene oppnås ved 16S rDNA sekvense kunne bekrefte artenidentitet. Massespektrale fingeravtrykk av disse isolatene ble så laget og føres inn i vårt MALDI referanse-spektra database. Fremtidig forskning med fokus på andre sjeldne bakterier kan demonstrere anvendelsen av den foreslåtte strategien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17, (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49, (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79, (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70, (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39, (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19, (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30, (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27, (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8, (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49, (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17, (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95, (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95, (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36, (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42, (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81, (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33, (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6, (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42, (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20, (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25, (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42, (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42, (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43, (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49, (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28, (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10, (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32, (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31, (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14, (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45, (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70, (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18, (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60, (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33, (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45, (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10, (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80, (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45, (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288, (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51, (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46, (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67, (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21, (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6, (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19, (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15, (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79, (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49, (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50, (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42, (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52, (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67, (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78, (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16, (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48, (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2, (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33, (3), 580-598 (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics