VDJ-Seq: ניתוח רצף עמוק של ג'ין שרשרת מחדש Immunoglobulin כבד לחשוף את דפוסים משובטים אבולוציה של לימפומה B הסלולרי

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

clonality גידול הבנה הוא קריטי להבנת המנגנונים המעורבים בהתקדמות tumorigenesis ומחלה. בנוסף, הבנת שינויי ההרכב המשובטים המתרחשים בתוך גידול בתגובה למייקרו-סביבה או טיפולים מסוימים עלולה להוביל לעיצוב של גישות יותר מתוחכמות ויעילות למיגור תאים סרטניים. עם זאת, תת-אוכלוסיות משובטים גידול מעקב היו מאתגרות בשל חוסר הסמנים להבחין. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול VDJ-seq נוצר כדי להתחקות אחרים דפוסי התפתחות המשובטים של לימפומה B תא הגדולה הישנות מפוזרת (DLBCL) על ידי ניצול רקומבינציה VDJ וhypermutation הגופני (SHM), שתי תכונות ייחודיות של לימפומות תאי B.

בפרוטוקול זה, ספריות רצף של הדור הבא (NGS) עם פוטנציאל לאינדקס נבנו משרשרת מוגברת אימונוגלובולינים מחדש כבדה (IGH) אזור VDJ מזוגות של אבחון ראשוני וSAMP DLBCL הישנותles. על יותר מממוצע חצי מיליון רצפי VDJ למדגם התקבלו לאחר רצף, המכיל שני VDJ התארגנות ומידע SHM. בנוסף, צינורות ביואינפורמטיקה מותאמים אישית פותחו לנצל מידע רצף לאפיון של רפרטואר IGH-VDJ בתוך דגימות אלה באופן מלא. יתר על כן, הצינור מאפשר שחזור והשוואה של הארכיטקטורה המשובט של גידולים בודדים, המאפשרת הבחינה של ההטרוגניות המשובט בתוך גידולי האבחון וניכוי דפוסי התפתחות משובטים בין האבחון וזוגות גידול הישנות. כאשר מיישמים את הניתוח הזה לכמה זוגות אבחון הישנות, אנחנו חשפנו ראיות מרכזיות שדפוסים אבולוציוניים גידול ייחודי מרובים עלולים להוביל לנסיגת DLBCL. בנוסף, גישה זו יכולה להיות מורחבת להיבטים קליניים אחרים, כגון זיהוי של מחלה שיורית מינימאלית, מעקב אחר התקדמות הישנות ותגובה לטיפול, וחקירה של רפרטואר חיסוניes בהקשרים שאינם לימפומה.

Introduction

הסרטן הוא מחלה משובט. מאז לפני שלושים שנה, כאשר פיטר ג Nowell הציע מודל התפתחות הסרטן המשובט 1, מחקרים רבים ניסו לנתח אוכלוסיות משובטים בתוך דגימות גידול ולשחזר דפוסי התרחבות והתפתחות משובטים העומדים בבסיס תהליך יצירת הגידולים 2. לאחרונה, רצף הגנום אפשר חוקרים ליסתכל עמוק בהטרוגניות והאבולוציה 3,4 המשובטים. עם זאת, בשל חוסר סמנים צייתן בסוגי תאים רבים, קשה להסיק ארכיטקטורה משובט המדויקת ומסלול האבולוציוני. למרבה המזל, יש סמן clonality טבעי בתאי B הבוגרים ממנו רבות ממאירות הלימפה, כולל DLBCL, מקורן. בתגובה לגירוי אנטיגן, כל תא B יכול ליצור רצף IGH VDJ יחיד יצרני על ידי הצטרפות H V (משתנה), D (גיוון), וH J (הצטרפות) קטע יחד ממאגר גדול של מגזרים אלו. במהלך יחסי ציבור זהocess, מנות קטנות של הרצף המקורי עשויים להימחק ונוקלאוטידים שאינן בתבניות נוספות ניתן להוסיף ליצור סידור מחדש VDJ ייחודי. סידור מחדש VDJ ספציפי זה יכול להיות בירושה בכל הצאצאים של תאי B זה, ולכן תיוג B-תא בוגר פרט וצאצאיה 5. יתר על כן, SHM מתרחש על רצפי VDJ recombined בתגובה הבאה מרכז נבטי (GC) להציג מוטציות נוספות להרחבת בריכת הנוגדן ושיפור של זיקת נוגדן 6. לכן, על ידי השוואה והנגדה דפוסים של דגימות לימפומה שעברו תהליכים אלה VDJ וSHM, ההטרוגניות תוך גידול יכולה להיות שמסומן ונתיב התפתחות משובט של המחלה ניתן ללמוד.

בעבר, סידור מחדש VDJ וSHM יכולים להיות מזוהה על ידי PCR הגברת אזורי recombined, שיבוט מוצרי ה- PCR, ולאחר מכן רצף סנגר לקבל מידע רצף. אני גישה זוזה נמוך תפוקה ותשואה נמוכה, אחזור רק חלק קטן מרפרטואר VDJ recombined כל, ומעכב את האפיון של הייצוג הכולל של האוכלוסייה המשובט בתוך מדגם נתון. גישה שונה נוצרה על ידי יצירת אינדקס NGS ספריות רצף ממוצרי VDJ PCR וביצוע רצף נ"ב 2x150 PE להשיג יותר מחצי מיליון רצפי VDJ recombined לדגימה. בנוסף, צינור מותאם אישית פותח כדי לבצע בקרת איכות (QC), ליישר, רצף VDJ המסנן קורא לזהות rearrangements וSHMs של כל קריאה, ולבצע ניתוח פילוגנטי על הארכיטקטורה המשובט של כל דגימה. בנוסף, גישה חדשה הוקמה כדי להמשיך ולאפיין את דפוסי התפתחות המשובטים לדגימות שנאספו בשלבי מחלה שונים.

יש לנו ליישם את הטכניקה הזו לדגימות חולה DLBCL. DLBCL הוא צורה אגרסיבית של לימפומה שאינה הודג'קין עם הישנות תכופה בה עד אחדIRD של החולים 7. התקפי DLBCL בדרך כלל להתרחש מוקדם, בתוך 2 עד 3 שנים של האבחון הראשוני, למרות שחלקם מתרחש לאחר 5 שנים 8. הפרוגנוזה של חולי הישנות היא עניה, עם רק 10% השיג 3 שנות הישרדות ללא התקדמות מחלה בשל אפשרויות טיפול מוגבלות. זהו הבסיס לצורך הדחוף בגישות חדשות לטיפול בהישנות DLBCL 9,10. עם זאת, מנגנונים מולקולריים הקשורים בהישנות DLBCL עדיין במידה רבה לא ידועים. במיוחד, התפקיד של ההטרוגניות משובט באבחון ואבולוציה משובט במהלך פיתוח הישנות DLBCL הוא כיום uncharacterized, ולכן קשה להגדיר סמן ביולוגי מדויק ושימושי לחזות הישנות. כדי לענות על שאלות אלה, יישמנו גישת VDJ-הרצף שלנו בזוגות רבים של זוגות מדגם DLBCL אבחון הישנות ראשונית מתאימים. שני תרחישים האבולוציונית משובטים מובהקים של הישנות יצאו מההשוואה של הארכיטקטורות המשובטים בין האבחון וSAMP הישנותles שמציע מנגנונים מולקולריים מרובים עשוי להיות מעורב בהישנות DLBCL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. VDJ הגברה

1.1) הפקת DNA מדגימות גידולים

  1. תמצית ה- DNA מחלקים דקים (10-20 מיקרומטר) של רקמות מוטבעות אוקטובר קפוא רגילות או ממאיר.
    1. לעכל 10-30 חלקים דקים של רקמה משובצת נחתכה על ידי microtome cryostat ב 4 מיליליטר גרעין תמוגה מאגר (.0075 M טריס HCl, pH 8.2; 0.3 M NaCl; 0.002 M Na 2 EDTA) עם proteinase K (0.5 מ"ג / מיליליטר, ריכוז סופי ) ו0.625 SDS% בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 1 מיליליטר של NaCl הרווי (5 מ ') לתערובת העיכול ולנער במרץ במשך 15 שניות.
    3. צנטריפוגה ב -1,100 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. מעבירים את supernatant לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חדש ולהוסיף שני כרכים של אתנול 100%.
    5. מערבבים על ידי צינור היפוך 6-8 פעמים. צנטריפוגה ב XG 5000 עבור 60 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את ה- DNA זירז.
    6. שטוף את כדור DNA פעמיים עם 70% אתנול. Centrifuge בXG 5000 במשך 15 דקות בכל פעם כדי לאסוף את הכדור.
    7. ממיסים DNA במאגר TE 100-400 μl בטמפרטורת חדר בלילה שייקר. תשואת DNA היא 5 עד 200 מיקרוגרם (ריכוז סופי בין 50-500 ng / μl) בהתאם לגודל של הרקמה
  2. תמצית ה- DNA מחלקים דקים (10-20 מיקרומטר) של, רקמות קבועות פורמלין כפאראפין משובץ (FFPE) רגילות או ממאיר.
    1. דגירה סעיפי פרפין ב 1 מיליליטר קסילן פעמיים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות בכל פעם בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לדה-paraffinize. לאסוף את חלקי רקמות על ידי ספינינג ב13,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. דגירה סעיפים ב 1 מיליליטר 100% אתנול פעמיים בטמפרטורת חדר, 10 דקות בכל פעם כדי להסיר שאריות xylenes. לאסוף את חלקי רקמות על ידי ספינינג ב13,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. פרפין הוא נמס לגמרי בשלב זה, ורק סעיף הרקמה שנותר.
    3. אוויר יבש הסעיפים בte החדרmperature במשך 10-15 דקות.
    4. הפוך 0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון proteinase K עם חיץ 1x PCR (בדילול מ10x חיץ PCR עם מים nuclease חינם). מוסיף את פתרון proteinase K לדגימות בנפח סופי של 50-100 μl ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
    5. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית proteinase ק
      הערה: בשלב זה, ה- DNA המדגם נמס במאגר PCR וניתן להשתמש בם בשלבי 1.2 ו -1.3 ישירות. תשואת DNA היא 0.5-20 מיקרוגרם (ריכוז סופי בין 10-200 ng / μl) בהתאם לגודל של הרקמות.

1.2) הערכת איכות DNA

  1. מערבבים 0.25 μl פולימראז תקי DNA עם 45 μl של תערובת אמן מערכת הסולם המסחרית בצינור PCR.
  2. הוסף 5 DNA μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 לתוך צינור PCR ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 5 פעמים.
  3. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהחזיק ב 15 מעלות צלזיוס.
  4. הכן 2% agarose ג'ל בTBE (טריס / Borate / EDTA).
  5. מערבבים תגובת PCR 20 μl עם צבע טעינת 6x 4 μl, ולטעון על ג'ל agarose 2%.
  6. כתם ג'ל agarose עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון ולזהות מוצרי ה- PCR עם מערכת דמיון ג'ל. הערה: הדגימות שתנבנה 5 מוצרי ה- PCR בגדלים של 100, 200, 300, 400, ו -600 נ"ב יהיה המשיך ליצור amplicons VDJ.
    זהירות: ברומיד הוא mutagen חזק. אנא לטפל בזהירות רבה על ידי לובש הילוכים מגן, כפפות כלומר, ולהיפטר לתוך מכולות ספציפיות להנחיות של המוסד.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) מגזר להגביר recombined IGH VDJ ממסגרת האזור 1 (IgVHFR1)

  1. מערבבים תערובת אב 45 μl מהתווית הצינוראד כ" מיקס 2 "של סומטיים IGH Hypermutation Assay עבור ג'ל איתור ערכה מסחרית, 0.25 μl פולימראז תקי DNA, ו- DNA מדגם 5 μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 בצינור PCR.
  2. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהחזיק ב 15 מעלות צלזיוס.
  3. לפתור את מוצר ה- PCR השלם ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי.
  4. כתם ג'ל agarose עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון ולזהות מוצרי ה- PCR עם מערכת הדמיה ג'ל. Amplicon חד שבטי צפוי עם מגוון הגודל של 310-380 נ"ב.
  5. בלו חלק ג'ל המכיל את amplicon חד שבטי בין 310-380 נ"ב.
  6. לטהר DNA מג'ל נכרת באמצעות ערכה סטנדרטית חילוץ ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: לדגימות שניתן להשיג שברי FR1, אין צורך בשפע IGVHFR2 וIgVHFR3.

1.3.2) מגזר להגביר recombined IGH VDJ ממסגרת האזור 2 (IgVHFR2)

  1. מערבבים תערובת אב 45 μl מהצינור שכותרתו "Tube B" של IGH ג'ין Clonality Assay מסחרי לערכת ג'ל איתור, 0.25 μl פולימראז תקי DNA, ו- DNA מדגם 5 μl הוכן מ1.1.1.7 או 1.1.2.5 בצינור PCR .
  2. השתמש בתנאים הבאים כדי להגביר את ה- DNA: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות; אחרי 35 מחזורים של 45 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 45 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו- 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולעזוב בגיל 15 מעלות צלזיוס.
  3. לפתור את מוצר ה- PCR השלם ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי.
  4. דמיינו מוצר ה- PCR (ים) של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד מכתים. Amplicon חד שבטי אפשר לראות בטווח הגודל של 250-295 נ"ב.
  5. בלו חלק ג'ל המכיל את amplicon חד שבטי בין 250-295 נ"ב.
  6. לטהר DNA מג'ל נכרת באמצעות תמצית ג'ל סטנדרטיתיון ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן.

1.4) מטב VDJ PCR

  1. השתמש בתנאי PCR שונה הבאים כדי להגביר IgVHFR1 וIgVHFR2 באמצעות DNA האופטימלי: 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות, ארכה סופית ב C ° 72 במשך 10 דקות.

2. VDJ Amplicon ספריית הכנה ורצף

2.1) ספריית הכנה

2.1.1) סוף-תיקון

  1. העבר את מוצר ה- PCR VDJ מ1.3 לתוך צינור PCR ולהוסיף Resuspension הצפת מדגימת DNA הכנת ערכה כדי להעלות את הנפח עד 60 μl.
  2. הוסף 40 μl של תיקון סוף המיקס מערכת הכנת דגימת DNA ומערבבים היטב.
  3. דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בthermocycler מחומם מראש (30 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.
  4. מערבבים 136 μl חרוזים מגנטיים ו -24 μl PCR זמים ראד ראשון בצינור 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן להעביר את תגובת הסוף-תיקון כל מ2.1.1.3 לתוך צינור 1.5 מ"ל ומערבבים היטב עם פתרון חרוזים.
  5. צינורות מקום על דוכן מגנטי עבור 2 דקות, כדי לאפשר את ההפרדה של חרוזים מהפתרון. לשאוב supernatant, ולשטוף את החרוזים עם EtOH מוכן טרי 80% פעמיים בזמן שהצינור הוא על הדוכן המגנטי.
  6. לשאוב את פתרון אתנול לחלוטין ולאפשר את החרוזים לייבוש באוויר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
  7. קח צינור מחרוזי הדוכן וגלול המגנטיים ב17.5 μl Resuspension מאגר.
  8. צינורות מקום בחזרה אל הדוכן המגנטי עבור 2 דקות לחרוזים נפרדים ממאגר Resuspension. הסר את Resuspension הצפת (מוצר קצה תיקון resuspended במאגר Resuspension עכשיו) לתוך צינור PCR נקי.

2.1.2)-עוקב

  1. להוסיף תערובת-עוקבת 12.5 μl לתוך צינור PCR המכיל מוצר קצה תיקון ומערבבים היטב. דגירה צינור PCR על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בthermocycler מחומם מראש (37 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.

2.1.3) מתאם קשירת

  1. להוסיף 2.5 Resuspension הצפת μl 2.5 μl קשירת מיקס, ו -2.5 μl DNA מתאם מדד לתגובה עוקב-.
  2. דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 minl בthermocycler מחומם מראש (30 ° C) עם מכסה מחומם מראש על 100 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 5 μl Stop קשירת מאגר לכל תגובה ומערבבים היטב.
  4. מערבבים 42.5 חרוזים מגנטיים μl גם מעורבים לנקות את התגובה הבאה צעדים 2.1.1.5 ל2.1.1.8. הוסף 50 μl Resuspension מאגר לelute המוצר-ligated המתאם.
  5. נקה את המוצר-ligated מתאם בפעם שנייה על ידי שימוש בחרוזי 50 AMPure XP μl גם מעורבים, וelute המוצר ב -25 Resuspension הצפת μl לתוך צינור PCR נקי.

2.1.4 רסיסים להגביר DNA)

  1. הוסף 5 μl קוקטייל PCR פריימר ו -25 μl PCR מיקס מאסטר לצינור PCR המכיל מוצר-ligated מתאם ומערבבים היטב.
  2. בצע הגברה בthermocycler מתוכנתת מראש עם התנאים הבאים: 98 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 10 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; אז 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהחזיק ב 10 מעלות צלזיוס.
  3. לנקות את התגובה באמצעות 50 חרוזים מגנטיים μl גם מעורבים, וelute המוצר הסופי ב -30 Resuspension הצפת μl.

2.1.5) ספריית אימות

  1. לכמת את המוצר הסופי עם fluorometer באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ריכוז ספרייה סופי הוא בין 2.5-20 ng / μl.
  2. להעריך את איכותו של המוצר הסופי באמצעות מכשיר אנליטי עם שבב הרגישות הגבוה DNA על פי הפרוטוקול של היצרן. מצפה להקה יחידה עם הגודל הצפוי לאו IGVHFR1, IGVHFR2 או IGVHFR3. לְךָגודל xpected של מוצר הספרייה שווה את גודל amplicon VDJ המקורי בתוספת הגודל של המתאמים (~ 125 נ"ב).

2.2) VDJ-PCR ספריית איגום ורצף

  1. לחשב את molarity של כל חלק ספרייה באמצעות הנוסחא הבאה: ננומטר = [(/ 1000 ng) / נ"ב * 660] x 10 9 שבי ng הוא הריכוז של ספריית VDJ-PCR נמדדה בשלב 2.1.5.1 ונ"ב הוא השיא גודל של ספריית VDJ-PCR נמדד בשלב 2.1.5.2.
  2. לדלל את הספרייה עד 2 ננומטר (סה"כ 10 μl) עם מים ללא DNase.
  3. לשלב 10 μl של 2 ספריות ננומטר מדוללים יחד לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  4. הוסף נפח שווה של שליטת ספייק-בPhiX לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  5. טען את הבריכה בריכוז 07:00 על flowcell.
  6. רצף הספריות באמצעות רצף מחזור לזווג סוף 150 על פי הפרוטוקול של היצרן.

ניתוח 3. נתונים

הערה: Summניתן למצוא ארי של התסריטים ביואינפורמטיקה בשימוש בסעיף זה כקובץ קוד משלים.

3.1) יישור וQC

  1. רצף לזווג סוף מפה קורא נגד V IGH אנושי, D ומסד נתוני אזור J להוריד מאתר האינטרנט IMGT 11 באמצעות אלגוריתם פיצוץ נוקלאוטיד מותאם המבוסס על 'blastn' זמין מצמח השדה עם עונש פער פתוח של 2, עונש הארכת פער של 1, מילת אורך של 7, וסף דואר ערך של 10 -4. מחק את קריאת הזוג לא המפה לשני V IGH ואזור J.
  2. רוזן שנותרו לקריאה הזוגות שיש לי מיפויי IGH V ו- J להשיג את התדרים של שילובי VJ התאמה בכל לקרוא זוגות המתקבלים מריצת הרצף על המדגם. רוזן קריאה זוג אם זה ממופה לשני V IGH וגן J, ולאחר מכן להוסיף אלל לספירה המקבילה לשילוב VJ המסוים.
  3. דרג את הספירה לכל איזור VDJ recombined מתקבל מ3.1.2 מגבוהest לנמוך ביותר. אזור VDJ יש הגבוה ביותר קורא ספירה מוגדרת כשילוב סידור גדול.
  4. בטל רצפים מיושרים שמכסים פחות מ -35% מהסידור מחדש העיקרי שזוהה בתחום 3.1.3.

3.2) זיהוי פרופיל SHM

  1. לספור את כל דפוסי SHM פני קורא מצעד 3.1.3. להגדיר כל דפוס SHM כsubclone.
  2. לספור את מספר subclones שהמתאימים לדפוסי SHM ייחודיים שונים, ומספר קורא שממופים לsubclones הבודד.

3.3) ייצוג גרפי של תוצאות

  1. לבצע ניתוח פילוגנטי על subclones באמצעות דפוסי השימוש בשכונת הצטרפות שיטה מ" קוף "חבילת R פי הפרוטוקול של יצרן SHM המקביל שלהם. חישוב מטריצת מרחק מהמערכים שונים הפרט לשחזר את תולדות הגזע subclone נטועים רצף germline של Vשילוב J בשאלה עבור כל קבוצת מדגם לזווג.
  2. השתמש ברצף נוקליאוטידים של כל subclone כוקטור אופי ולחשב את המרחק בין כל מחרוזת המשוערת subclones בסידור מחדש VJ העיקרי לאבחון והן דגימות הישנות מקבילה באמצעות מדד מרחק Levenshtein בי מתמטי המרחק בין שני מערכים ניתן על ידי x ד, y (I, j) כאשר x ד, y (i, j) = 1 אם אני ≠ j ו0 אחרת, ולאחר מכן לסכם בפונקציה זו על פני האורך של המחרוזת המתאימה לנוקלאוטיד רצפי i ו j.
  3. גרפי להציג את מטריצת מרחקי subclone וספירת subclone המקבילה שלהם בשתי הדרכים הבאות וכתוצאה מכך:
    1. להשתמש בחבילת R "מסה" על פי הפרוטוקול של היצרן כדי להחיל קנה מידה רב ממדית למטריצת מרחק subclone וליצור עיקרון שני ממדי קואורדינטות מפה, אשר לאחר מכן הוא להתוות יחד עם הלוגריתםשל ספירת subclonal כרדיוס של המעגל.
    2. לבנות גרף undirected מבוסס על מרחק Levenshtein, שבו הקודקודים מתאימות לכל subclone השונה הנובע מהתארגנות VJ הגדולה.
      הערה: אם המרחק בין שני שיבוטים שונים שווה לאחד ולאחר מכן קיימת קצה בין שני הקודקודים האלה. אם המרחק הוא גדול יותר מאחד, אז אין קצה חיבורם.
    3. העלילה הגרף של 3.3.3.2 באמצעות פונקצית tkplot בחבילת R "iGraph" עם פריסת קמהדע קאוואי פי הפרוטוקול של היצרן. הרדיוס של הקודקודים הוא פרופורציונאלי לשורש חתוך לקוביות של המספר הכולל של שיבוטים הממופים אליו וההצללה משתמשת במגוון אדום והכחול כדי לציין את חלקם של שיבוטים שגם שייכים לאבחון (הכחול) או להרע דגימות (אדום) .

3.4) הטרוגניות מדידה (אנטרופיה)

  1. בדוק את המספרים וספירת subclone שלדפוסים אישיים של hypermutation הגופני המתרחשים בסידור מחדש VJ הגדול עבור כל זוגי של קבוצה של דגימות.
  2. לחשב את האנטרופיה האמפירית והאנטרופיה אמפירית שייר מותאם למספר שיבוטים שונים בכל מדגם באמצעות הערכת אנטרופיה מבוססת היסטוגרמה סטנדרטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליך הכולל של רצף VDJ (VDJ-seq), כולל מיצוי DNA, recombined הגברה VDJ אזור וטיהור, בניית ספריית רצף, קורא עיבוד, וניתוח פילוגנטי, מיוצג באיור 1. באופן שגרתי 5-200 מיקרוגרם DNA יכול להאסף מ חלקים קפואים רקמות מוצקות או 0.5-20 מיקרוגרם DNA מסעיפי רקמות מוטבע פרפין-קבוע פורמלין. בהתאם לאיכות, דפוס סידור מחדש, ותואר SHM של דגימות בודדות, יכול להיות מושגת מגוון מוצרי VDJ PCR ממדגמים שונים (איור 2), כולל IGVHFR1 (310-380 נ"ב), FR2 (250-295 נ"ב), ו FR3 (70-120 נ"ב). דגימות שממנו ניתן להשיג רק בר FR3 מVDJ PCR הוצאו מהמחקר שנותר בשל המוצר הקצר שאינו מספק כמות מספקת של מידע רצף למטרה ניתוח נתונים במורד הזרם. רק דגימות שמוצר FR1 או FR2 PCR עיקרי ניתן דמיינו על הג'ל agarose דואר מעובד ליצור ספריות רצף. התשואה של מוצר ה- PCR הגדול לאחר טיהור ג'ל טווחי 10-50 ng בסך הכל.

מוצר ה- PCR המטוהר כל שימש לבניית הספרייה שלאחר מכן לספריית רצף. לאחר קשירת מתאם, כל דגימה משיגה מדד הייחודי משלו. במהלך ההגברה ספרייה, 10 מחזורים של PCR בוצעו שיכול להניב יותר מ -30 ng כמוצרי ספרייה סופיים. איכות הספרייה לגשת bioanalyzer. כפי שניתן לראות באיור 3, יש מוצר אחד במדגם הספרייה עם שינוי גודל של 125 נ"ב ~ יוצר מוצר amplicon המקורי VDJ PCR מצביע נוסף של מתאם. לכל ריצת רצף, 5-10 ספריות היו נקוות יחד בשעת 7 מיקרומטר. בנוסף, בשל דמיון רצף הגבוה בין מוצרי VDJ PCR, בריכת הספרייה הייתה מעורבת עם 50% PhiX ספייק-ב, כדי להבטיח את המורכבות של הריצה וזיהוי הנכון של בסיסנוסף לאחר כל מחזור רצף. שברי DNA ספרייה היו רצף של 150 נקודות בסיס בשני הקצוות, המאפשר האחזור של כמות מספקת של מידע רצף פורש צמתים VD וDJ לברי FR1, ודפוסי מוטציה SHM לניתוח פילוגנטי.

בעבר, ביצענו רצף VDJ על 32 דגימות שנאספו בDLBCL אבחון והישנות מ -14 חולים (מספר חולים שדוגמאות רבות שנאספו בשני אבחון או שלב הישנות) באמצעות המצב שתואר לעיל 12. על ידי ביצוע ניתוח פילוגנטי של פרופילי SHM של הארגון מחדש V H DJ H הגדול בין הדגימות לזווג, "מוקדם מסתעף" ומצב "המאוחר-מסתעף" אבולוציה משובט הקשורים הישנות DLBCL זוהו 12. במסמך זה, באותה הגישה הייתה מוחלת על אבחון DLBCL נאסף חדש וזוג הישנות. אזורי FR1 התקבלו בשני הדגימות לאחר Pההגברה CR. מוצר ה- PCR גדול עם הגודל סביב 344 נ"ב (שנמדד על ידי bioanalyzer) הושג משני האבחון ודגימות ההישנות. לאחר רצף, כולל של 0.70 מיליון לזווג סוף קורא התקבלו במדגם האבחון ו-0.73 מ'לזווג-הסוף קורא למדגם ההישנות, שהיו בטווח של מספר הכניסות המתקבלים לדגימה במחקר הקודם (0.38- 1.42 מיליון, ממוצע 0.75 ± 0,260,000) 12. לאחר המיפוי לזווג-הסוף קורא נגד בסיס הנתונים IMGT, קורא שאין לי להיטים בכל שלוש V, אזורי D ו- J הושלכו. הסדר V H DJ H היה ​​מוקצה לכל קריאה לזווג סוף. סך של 0.64 מיליון ו0,670,000 צמתים DJ H V H זוהו בדגימות האבחון והישנות בהתאמה, המייצג את שיעור יישור גדול מ -90%. על ידי ספירה כמה פעמים כל שילוב של V H DJ H נמצא בדגימות בודדות, 808 H V הברור </ Sub> צמתים DJ H נמצאו במדגם האבחון וצומת 581 V H DJ H שונים במדגם הישן. צומת V H DJ H הדומיננטית בשני המדגם היא IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2, המאשר כי הם clonally קשורים. צומת V H DJ H דומיננטית זה היוותה 97% מכל צומת V H DJ H ממופה קוראת בשני מדגם האבחון ומדגם ההישנות.

כדי לעקוב אחר ההתפתחות המשובט של מקרה הישנות DLBCL זה, ניתוח פילוגנטי של פרופילי SHM של הארגון מחדש V H DJ H הגדול בין זוג דגימות אבחון והישנות זה בוצע. הבחנו כי דפוס ההתפתחות המשובט של הזוג הזה היה הולך בדרך "המאוחרת-מסתעף" (איור 4), שsubclones מגידולי האבחון וההישנות התקבצו יחד על אותו הענף של עץ פילוגנטי, ודומיננטייםsubclone האבחון וsubclones ההישנות הדומיננטית משותף דפוס SHM דומה עם כמה מוטציות נוספות התרחשו בsubclone ההישנות. תוצאות אלו מצביעות על כך שהפוטנציאל היה subclone בגידול האבחנה שהיה או כימותרפיה עמידה או נמלט מהטיפול, ולאחר מכן פיתח סופו של דבר לגידול ההישנות.

כדי להמשיך ולאפיין ולדמיין ארכיטקטורה משובט של כל דגימות ודפוסי התפתחות משובט במהלך תהליך הישנות, שני ניתוחים חדשים פותחו. בניתוחים אלו, כל הסט של subclones של הסידור מחדש VJ הגדול בכל מדגם המשמש לחישוב מרחק מחרוזת pairwise בין כל subclones כהגדרתו בדפוסים של SHM. לאחר מכן על ידי שימוש בקנה מידה רב ממדי (איור 5 א, 5 ב) או על ידי בניית גרף undirected (איור 5 ג, 5D) כפי שמתוארים בניתוח נתונים, חלקות המייצגות את ההפצה וההטרוגניות של subclones נוצרו. כמאויר באיור 4, עלילת MDS מציגה הרבה פחות גיוון רצף בין subclones העיקרי במקרים מאוחר מסתעפים (איור 5 א) מאשר במקרים מסתעפים המוקדמים (איור 5). יתר על כן, תת-השיבוטים של מדגם האבחון ותת-השיבוטים של מדגם ההישנות במקרה מסתעף המוקדם להפריד לחלוטין זו מזו, דבר המעיד על חוסר הדמיון של דפוסי SHM בין גידולים אלו, למרות שהם נושאים את אותו סידור מחדש VDJ . כמו כן, הגרפים undirected ב( איור 5 ג) ו- (איור 5D) מראים כי ההפצה של ספירת subclone במקרה מסתעף המאוחר (איור 5 ג) שונה ממסתעפת המוקדם (איור 5D). יש אחרון שיבוטים גדולים יותר בולטים, אבל מבחינה גנטית מגוונים מאבחון להישנות. בנוסף, חוסר הקצוות וsubclones הקטן יותר קשרים בין השיבוטים אבחון ולהרע המשמעותיים במוקדם מקרה מסתעף (איור 5D), ממחיש את אופי מגוון רצף של מקרה ההישנות מסתעף המוקדם.

איור 1
איור 1:.. צעד אחר צעד זרימת התרשים של גישת VDJ-seq ההליך הכולל של רצף VDJ מוצג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: נציג תמונות של מוצרי amplicon VDJ PCR. תמונות ג'ל מראים את הנציג IGVH-FR1 (פנל משמאל) וIGVH-FR2 (פנל מימין) מוצרי ה- PCR מה- DNA שחולץ מן הדגימות חולה לימפומה. לא ניתן היה לקבל מוצר PCR בדוגמא 5 ככל הנראה בשל שני הנמוךמדגם איכות DNA או SHM באתרי פריימר שפגעו בתגובת PCR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. QC של amplicon VDJ PCR וספריית רצף לאחר מכן על ידי bioanalyzer הנציג Bioanalyzer עקבות של אותו amplicon VDJ לפני בניית ספרייה (פנל עליון) ואחרי בניית ספרייה (פנל תחתון). שים לב לשינוי הגודל מ334 נ"ב לBP 459 מצביע על התוספת של המתאם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ניתוח משובט אבולוציה של זוג דגימות אבחון והישנות DLBCL. ניתוח פילוגנטי של זוג מדגם DLBCL אבחון הישנות מראה את המצב "המאוחר-מסתעף" משובט האבולוציה. Tickers הצבע מייצג את מעמד המוטציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.


איור 5
איור 5: שיטות גרפיות חדשות כדי לחזות דפוסי התפתחות משובטים (A, B) חלקות קנה מידה רב ממדי שילוב פרופילי SHM וספירת subclone של זוג מדגם מראה את מצב ההישנות המאוחר מסתעף () וזוג מדגם B מראה מצב הישנות מוקדם מסתעף. (ב). הרדיוס של החוגים לציין את הספירה של subclאלה המתאימים לפרופיל SHM מסוים וצבעים המתאימים לאבחון המדגם (הכחול) או להרע מדגם (אדום). X ו- Y-הצירים מייצגים את 2 רכיבים העליונים של מד"א. (C, D) גרפים undirected של זוג מדגם מראה את המצב בסוף-מסתעף הישנות (C) וזוג מדגם B מראה מצב מוקדם מסתעף הישנות (ד '). קצוות מתאים לשני פרופילי SHM שיש מרחק מחרוזת של הפרדת מכתב אחד וסיימו הצללה (סרגל קנה מידה צבע) המציין את חלקם של מיפוי רצפים לפרופיל מסוים SHM המתאים לאבחון המדגם (אדום) או להרע מדגם (צהוב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בגלל המספר כמעט בלתי מוגבל של חזרות של רצף מידע המקודד על ידי סידור מחדש VDJ וSHM במוקד IGH של תאי B אנושיים, בדיקה של כל רפרטואר IGH ידי תפוקה גבוהה עמוק רצף הוכיחה להיות דרך יעילה ומקיפה להתוות משובט ואוכלוסיות B-תא תת-משובטים. יתר על כן, אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי לחקור את נתיב ההתפתחות המשובט של פיתוח ב 'תאי גידול, הפוגה, והישנות ידי השוואת הארכיטקטורות המשובטים ותת-משובטים של דגימות שנאספו לאורך מטופל שלבים שונים של המחלה. למרות שההגברה של רצפי DNA VDJ משוחלפים מהמדגם הראשוני מתבצעת בקלות בסביבת מעבדה באמצעות פריימרים זמינים מסחרי, היעילות של הגברה תלויה במידה רבה באיכות של ה- DNA מדגם. בפרט, ה- DNA שחולץ מן דגימות FFPE מציג את יעילות הגברה נמוכה, ולעתים קרובות רק בר FR3 הקטן יכול להיות מוגבר בהצלחה מאלהדגימות, שהופך אותם מתאימים לניתוח שלאחר מכן. מכיוון שהמחקר שלנו המתואר במסמך זה נועד להבין את clonality של לימפומה תא B, שהיא מחלה משובט עם שיבוטים אחד או כמה גדולים שולטים בגידול כולו, אנחנו רק נאספו ורצף מוצר VDJ-PCR הגדול. ללימודים עניינו בקיטלוג כל האוכלוסייה המשובט תא B של, למשל, דם היקפי, חלק גדול יותר של ג'ל המכיל מספר רב של מוצרי VDJ-PCR (להקות מרובות או למרוח על הג'ל) עשוי להיות נכרת ורצף. עם זאת, חשוב להדגיש שלא ניתן ללכוד את רפרטואר IGH מחדש כל כי SHM מסוים עלול להתרחש שבבו יעד פריימרים ולפגוע בהגברה של VDJs אלה. יתר על כן, כבר הציגו הגברה סידור IGH לאחרונה, assay מסחרי צימוד ישיר ורצף MiSeq. assay זה מייעל מדגם תהליך הכנה. עם זאת, מכיוון שלא כל דגימות גידולים יוכל generate בר FR1, אנחנו עדיין ממליצים לכלול את צעד ג'ל אלקטרופורזה כדי לבדוק את המוצר של תגובת PCR לפני איגום דגימות עבור סידור.

נ"ב רצף של 150 שני הקצוות של בר VDJ (הכולל של מידע רצף 300 נ"ב) יש את היתרונות הבאים: 1) 300 נ"ב רצף יכול לכסות את רוב FR1 ובר FR2 כל, מתן מידע רצף מספיק לזיהוי סידור VDJ ו היפר-מוטציות סומטיות; 2) הפלטפורמה מספקת רצף מהיר סיבוב סביב זמן שמשלים כל 300 המחזורים של VDJ-רצף תחת 48 שעות; 3) כל ריצה מאפשרת ריבוב עד 12 דגימות ועדיין משיגה כמיליון לזווג-הסוף קורא לכל פלט מדגם. בגלל הדמיון בין הרצף הגבוה שיבוטים נושאים את אותו סידור VDJ, במיוחד בדגימות התאים לימפומה B, חיוני לספייק-20-50% בPhiX במהלך ריצת הרצף כדי לאפשר להגדיר במדויק בסיס קורא מטריצה. לאחרונה, MiSeqתוכנה עודכנה ללענות על שאלה זו. מומלץ להשתמש קטן כמו 5% PhiX ספייק-ברצף ספריית מורכבות נמוך. עם זאת, מתקן הרצף שלנו חווה ריכוז עולה בקנה אחד של DNA שליטת PhiX ספייק-במסופק על ידי היצרן שיסכן את התוצאה של רצף מורכבות נמוך. לכן, בפועל הנוכחיים, אנחנו עדיין משתמשים בספייק-10-20% PhiX לרצף VDJ. רצף של רפרטואר B-תאי דם היקפי השלם, אשר בדרך כלל מכיל מספר רב של הסדרי VDJ שונים, ניתן להפחית את כמות PhiX ספייק-ב. למרות שמספר השיבוטים וsubclones המזוהים של כל דגימה מתואמת חיובי עם מספר כניסות רצף, מחצית לקוראים מיליון של זיווג-סוף לדגימה די להשוות בין דגימות מבנים משובטים ולהסיק דפוסי התפתחות משובטים בין הדגימות שנאספו בשונה שלבי מחלה של אותו המטופל 12. זהייתכן שPE 150 נ"ב רצף אולי לא להשיג כיסוי מספק של שברי FR1 הארוכים אלה (כלומר 350-380 נ"ב). בחלק מהמקרים, מידע רצף של מגזר D לא יכול להיות שנאסף או שאולי לא יהיה מספיק מידע רצף בקטע V להבדיל subclones ידי SHMs. עם זאת, עם התקדמות טכנולוגיות הרצף, זה הפך להיות אפשרי רצף ארוך יותר ולכסות את amplicon FR1 כולו.

באמצעות הרצף של רפרטואר IGH של B-תאים ניתן היה לעקוב אחר ההתפשטות של שיבוטים תא B בודדים ולהסיק אבולוציה משובט במהלך מאבחון להישנות. עם השימוש בניתוח על האוכלוסיות של subclones שנוצר על ידי דפוסי SHM, הצלחנו לבדל את שני מצבים של התקדמות הסרטן להישנות על ידי בחינת phylogenies. הייצוגים הגרפיים האחרונים באמצעות חלקות קנה מידה רב ממדיות וגרפים undirected מבוסס על מרחק Levenshtein נוסף allow לנו להבין 1) הרכב subclonal של כל גידול, 2) איך אדם subclones הם קשורים זה לזה, ו- 3) איך כל subclone מתפתח במהלך התקדמות מחלה. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי הראה כי מבני פילוגנטי אלה היו שונים באופן ברור ושאוכלוסיות subclonal שונות כמו לגבי ההטרוגניות שלהם. לבסוף, מסלול ההתפתחות המשובט מתקבל על ידי VDJ-רצפים יכול להיות מתואם היטב עם אבולוציה גנטית ומאופיינת בשני exome או ממוקד resequencing 12. לכן, שילוב של שתי גישות אלה יש הפוטנציאל לזהות מוטציות נהג במהלך הישנות lymphomagenesis ולימפומה

בנוסף להגדרת רפרטואר IGH תא B ולעקוב אחר התפתחות משובט של התקדמות לימפומה, הגישה VDJ-seq ניתן פוטנציאל לשמש כשיטת רגישה ביותר למעקב אחר שאריות מחלה מינימאלית, ניטור תגובת גידול לטיפולים, ובאופן פוטנציאלי זיהוי הנוכחותשל שיבוטים עמידים לתרופות. גישה דומה יכולה להיות מיושמת גם לתאי T למפות רפרטואר קולט תא T, וניתן להשתמש כדי לחקור את התגובה חיסונית מעקב לסרטן. יתר על כן, VDJ-seq יכול גם להתבצע במודלים עכברי באמצעות פריימרים זמינים מאל חנה ואח. 13 זה הנראה לעין שהמידע שנאסף באמצעות גישה זו בשנים הקרובות יכול לגרום, כמו גם בהבנה טובה יותר של הדינמיקה של התפתחות גידולים להרחיב את הידע של המערכת החיסונית שלנו ותפקידיו בהגנה על גופנו מפני פלישת גידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194, (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481, (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481, (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11, (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354, (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346, (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28, (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28, (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40, (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15, (8), 432 (2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133, (2), 250-264 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics