Caracterización de los leucocitos-plaquetas Rich fibrina, una novela de Biomateriales

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Madurantakam, P., Yoganarasimha, S., Hasan, F. K. Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial. J. Vis. Exp. (103), e53221, doi:10.3791/53221 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Todos los procedimientos de sangre de dibujo debe ser realizado por profesionales autorizados y certificados. El uso de sujetos humanos de investigación implica la aprobación de la Junta de Revisión Institucional u otra autoridad competente. Precauciones especiales en relación con el consentimiento informado y la protección de la identificación de los participantes tienen que seguir. Todos los experimentos que figuran en este protocolo implican la manipulación de la sangre humana y / o productos de la sangre y el equipo de protección personal adecuado necesario para ser usados ​​en todo momento. La basura debe ser considerado como riesgo biológico y desecharse de acuerdo con las regulaciones.

1. venopunción

  1. Identificar al paciente / participante y confirmar con los registros existentes. Explicar el estudio en detalle y obtener un consentimiento informado.
  2. Tener una bandeja establecido para cada paciente con tubos marcados sobre una superficie plana y estable.
  3. Explique el procedimiento y hacer el asiento paciente cómodamente con el brazo apoyado. Informar al paciente que él o she sentirá un pequeño pellizco y debe permanecer inmóvil durante todo el procedimiento.
  4. Coloque la aguja al adaptador.
  5. Lavarse las manos y use guantes.
  6. Preparar la fosa antecubital para la venopunción limpiando con un 70% de alcohol isopropílico en círculos concéntricos desde el centro hacia afuera. Permitir el sitio se seque al aire durante 30 segundos.
  7. Identificar la vena apropiada por palpación.
  8. Aplicar el torniquete por encima de 3-4 en el sitio de punción asegurarse de que no es demasiado apretado (sin dejar de sentir el pulso radial).
  9. Realizar la venopunción insertando el bisel de la aguja 15-30 grados a la piel con un movimiento suave. Empuje el tubo de recogida de sangre a través de la aguja y recoger 9 ml de sangre entera.
  10. Retire el torniquete. Retire el tubo de la aguja.
  11. Retire la aguja y aplique la plaza gasas en el sitio de punción antes de la extracción de la aguja. Deseche la aguja en un contenedor de riesgo biológico correspondiente.
  12. Pedir al paciente para mantener pressure en el sitio de la punción.
  13. Etiquetar los tubos
  14. Consulte el sitio de punción para asegurarse de sangrado se ha detenido.
  15. Aplicar vendaje adhesivo o cinta sobre el cuadrado de gasa, pregunte si el paciente se siente bien (sin dolor, hinchazón o mareo)
  16. Gracias al paciente / participante antes de la descarga.

2. L-PRF Preparación

  1. Inmediatamente después de la extracción de sangre venosa en el tubo de vidrio seco rojo rematado, colóquelo en la centrífuga.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 12 minutos a temperatura ambiente después de colocar un contrapeso adecuado.
  3. Quitar el tubo en el extremo del ciclo. Observe el tres capas: plaquetas plasma pobre (PPP), la fibrina rico en plaquetas (L-PRF) y la base de RBC (Figura 1).
  4. Aspirar el PPP utilizando una pipeta. Usando pinzas tire suavemente de la L-PRF y la colocan en una malla de metal perforado estéril.
  5. El uso de bisturí quirúrgico, raspar el grueso de la capa de RBC dejando cuidadosamente la piel de antey la capa intacta.
  6. Comprimir suavemente el coágulo de L-PRF (utilizando la placa de metal estéril, peso aproximado 225 g) durante 30 seg. Plasma pobre en plaquetas será exprimida.
  7. Retire la placa y levante suavemente la membrana L-PRF. La membrana L-PRF está listo para su uso en experimentos 12.

3. Ensayo de tracción uniaxial

  1. Coloque las membranas L-PRF (n = 6) en un papel de filtro para facilitar su manejo y ponche en "huesos de perro" con el metal a medida muere (2,75 mm de ancho en su punto más estrecho, con una longitud de calibre de 7,5 mm).
  2. Mida el espesor de cada muestra a tres puntos y tomar la media.
  3. Comprometerse con cuidado la membrana de L-PRF en el centro de las garras de mordaza del sistema de prueba uniaxial.
  4. Romper con cuidado el soporte de papel archivador para exponer la membrana L-PRF.
  5. Programar el instrumento para que el cabezal móvil está funcionando a una velocidad constante (10,0 mm / min) e iniciar el experimento cuando el L-PRF está todavía húmeda.
  6. Registre el módulo elástico, la energía de romper, y la tensión en la rotura del software que acompaña al sistema de ensayo uniaxial. Estos valores se calculan de forma automática y no se requiere de entrada definido por el usuario. Por favor, vea la Figura 3.

4. Fuerza de retención de sutura

  1. Colocar las membranas L-PRF (n = 3) sobre un papel de filtro para facilidad de manejo y cortar en muestras rectangulares de medición (10 mm x 25 mm) utilizando un bisturí quirúrgico.
  2. Medir el espesor de cada muestra (promedio de 3).
  3. Hacer un agujero de alfiler en el centro de la muestra usando el alambre de ligadura de ortodoncia de acero inoxidable (220 micras de diámetro).
  4. Pase el alambre de ligadura a través del agujero para formar un bucle y fijarlo a la máquina de tracción. Coloque el borde de la membrana L-PRF a la empuñadura mandíbula inferior 13.
  5. Programar el instrumento para que el cabezal móvil está funcionando a una velocidad constante (10 mm / min) y el inicioel experimento.
  6. Registre el módulo elástico, la energía de romper, y la tensión en la rotura del software que acompaña al sistema de ensayo uniaxial. Estos valores se calculan de forma automática y no se requiere de entrada definido por el usuario. Por favor, vea la Figura 3.

5. El examen morfológico

  1. Preparar las muestras L-PRF para el examen SEM utilizando un 10 mm punzón de biopsia cutánea y colocarlos en una placa de 24 pocillos.
  2. Lavar las muestras con PBS y fijar con glutaraldehído al 2,5% (en PBS) durante 20 min.
  3. Deshidratar las muestras por inmersión en aumentar secuencialmente concentraciones de etanol (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 5 min cada uno.
  4. Tratar con 0,5 ml de 100% de HMDS (hexametildisilazano) durante 5 min. Airear O / N para eliminar el exceso de HMDS 14.
  5. Muestras de montaje sobre talones utilizando una cinta de doble cara, pulverización catódica capa de platino por 70 seg y examinan en un microscopio electrónico de barrido que funciona a una aceleracióntensión ración de 20 kV (o lugar adecuados).

6. genipina reticulación de L-PRF, tripsina Susceptibilidad y Ninhidrina Ensayo

  1. Para preparar genipina reticulado L-PRF, enjuague membranas con PBS y sumergirse en 4 ml de solución de genipina 1% (en etanol 70%) durante 48 hr. Enjuague con PBS antes de los experimentos para eliminar el exceso genipina 15, 16.
  2. Evaluar la estabilidad de reticulación genipina de L-PRF por su resistencia a la degradación por tripsina. Membrana Place L-PRF (n = 3) y genipina reticulado L-PRF en 500 l de 0,01% de tripsina y se incubaron a 37 ° C durante 3 días con un cambio diario de tripsina.
    1. Pesar muestras en el día 1 antes de la enzima de la exposición y en el día 3. La diferencia en el inicio y al final de peso representa la degradación enzimática 17.
  3. Cuantificar la cantidad de entrecruzamiento en genipina tratado L-PRF (G-PRF) por ninhidrina ensayo. En primer lugar preparar la curv estándare utilizando glicina (mM 1 mM-0.031) curva para establecer la relación entre la concentración de grupos amino ácido (FAA) y la absorbancia.
    1. Muestras Heat PRF con 1 ml de 2% (w / v) de ninhidrina durante 15 min a 100 ° C.
    2. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y añadir 1,5 ml de etanol al 50%.
    3. Analizar la absorbancia a 570 nm usando un espectrofotómetro adecuado.
    4. Determinar el porcentaje de reticulación utilizando la siguiente fórmula 15

Ecuación 1

7. MTS ensayo de proliferación celular

  1. Crecer MC3T3 (ratón preosteoblastos de calota) en la modificación alfa Medio Esencial Mínimo (aMEM) en matraces T-75 hasta que se obtiene una monocapa confluente 80%.
  2. Preparar membrana fresca, estéril L-PRF (abrir el tubo L-PRF dentro de la campana de cultivo de células) y la transferencia de la membrana a una nueva placa de cultivo celular.
  3. Medios Aspirar del matraz y enjuagar la monocapa con PBS, añadir 5 ml de tripsina al 0,05% y colocar el matraz en la incubadora a 37 ° durante 5 minutos, pipetear los contenidos del matraz en un tubo de centrífuga y centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  4. Decantar el sobrenadante, golpear suavemente el tubo para romper el sedimento celular y resuspender con 4 ml de MEM α fresca, dispensar una mezcla de suspensión celular (50 l) y azul de tripano (50 l) en el hemocitómetro y contar el número de células
  5. Semilla de 4x10 5 células en 10 mm anillos de clonación cristal colocadas en la parte superior de las membranas L-PRF para retener las células dentro de las membranas (anillos se pueden quitar después de 24 horas).
  6. Al día 4, enjuague con PBS tres veces constructos de 10 min.
  7. Añadir 1 ml de medio libre de suero y 200 l de reactivo MTS a cada pocillo y se incuba durante 2 horas a 37 ° C.
  8. Medir la absorbancia de 200 alícuotas a 490 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Needle 19G BD 305186
Needle Disposal Container Fisherbrand 14-827-122
Red-Topped Glass Collection Tube BD 8020129
Gauze Pads Tyco 5750
Bandage Johnson & Johnson 5005989
Surshield Terumo SV*S19BL Safety winged infusion set
Blood Collection Assembly BD 303380
Tourniquets BD 367203
Brand Luer Adapter Vacutainer L42179
Intra-Spin System  Intra-Lock International ISS110 Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit 
Pipettes (Serological & Micro) Corning
Scalpel Exelint 29552
MTS Bionix 200 MTS Systems Corporation Material testing systems
MTS Test Works 4 MTS Systems Corporation
Whatman Filter Paper Whatman 1004 070
SS Orthodontic ligature wire Patterson Dental 628-4228
200 Proof Ethanol Koptec V1001
Hexamethyldisilazane (HMDS) Aldrich 440191
Aluminium Mounting Stubs Ted Pella 16324
Double Sided Carbon Tape PELCO Tabs 16084-1
Scanning Electron Microscope JEOL LV 5610
Trypsin HyClone SH30042.01
Cell Culture Incubator Thermo Fisher Scientific Inc 51026282
Antibiotic-Antimicotic Gibco 15240-062
Genipin Wako 078-03021
Cell Culture Media Gibco 12000-022 Minimum Essential Medium-Alpha
MTS Reagent Promega G1118
PMS Reagent Sigma P9625
Spectrophotometer BioTek Epoch Spectrophotometer
10mm Glass Cloning Rings Corning 3166-10
T-75 Flask Corning 430641
DPBS Corning 55-031-PB
Ninhydrin 98% Aldrich 454044
24 Well Plate Corning 3987
Biopsy Punch Acu Punch P1025
Digital Micrometer Pittsburgh 68305
Glutaraldehyde Sigma G6257
12 Well Plate Corning 3336
96 Well Plate Corning 3596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 85, (6), 638-646 (1998).
  2. Rodriguez, I. A., Growney Kalaf, E. A., Bowlin, G. L., Sell, S. A. Platelet-rich plasma in bone regeneration: Engineering the delivery for improved clinical efficacy. BioMed Res In. 2014, (2014).
  3. Del Corso, M., et al. Current Knowledge and Perspectives for the Use of Platelet-Rich Plasma (PRP) and Platelet-Rich Fibrin (PRF). in Oral and Maxillofacial Surgery Part 1: Periodontal and Dentoalveolar Surgery. Curr Pharm Biotechno. 13, (7), 1207-1230 (2012).
  4. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox San. 97, (2), 110-118 (2009).
  5. Fernández-Barbero, J. E., et al. Flow cytometric and morphological characterization of platelet-rich plasma gel. Clin Oral Implants Re. 17, (6), 687-693 (2006).
  6. Li, Z., Guan, J. Hydrogels for cardiac tissue engineering. Polymer. 3, (2), 740-761 (2011).
  7. Zhu, J., Cai, B., Ma, Q., Chen, F., Wu, W. Cell bricks-enriched platelet-rich plasma gel for injectable cartilage engineering – an in vivo experiment in nude mice. J Tissue Eng Regen Med. 7, (10), 819-830 (2013).
  8. Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part I: technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101, (3), e37-e44 (2006).
  9. Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part II: platelet-related biologic features. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101, (3), e45-e50 (2006).
  10. Choukroun, J., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part V: histologic evaluations of PRF effects on bone allograft maturation in sinus lift. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101, (3), 299-303 (2006).
  11. Dohan Ehrenfest, D. M., Bielecki, T., et al. Do the Fibrin Architecture and Leukocyte Content Influence the Growth Factor Release of Platelet Concentrates? An Evidence-based Answer Comparing a Pure Platelet-Rich Plasma (P-PRP) Gel and a Leukocyte- and Platelet-Rich Fibrin (L-PRF). Curr Pharma Biotechno. 13, (7), 1145-1152 (2012).
  12. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechno. 27, (3), 158-167 (2009).
  13. Mine, Y., et al. Suture Retention Strength of Expanded Polytetrafluoroethylene (ePTFE) Graft. Acta Med Okayam. 64, (2), 121-128 (2010).
  14. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM , AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. J Micros. 186, (1), 84-87 (1997).
  15. Yuan, Y., et al. The effect of cross-linking of chitosan microspheres with genipin on protein release. Carbohydr Poly. 68, (3), 561-567 (2007).
  16. Sell, S. A., et al. Cross-linking methods of electrospun fibrinogen scaffolds for tissue engineering applications. Biomed Mater. 3, (4), (2008).
  17. Gorczyca, G., et al. Preparation and characterization of genipin cross-linked porous chitosan-collagen-gelatin scaffolds using chitosan-CO2 solution. Carbohydr Poly. 102, 901-911 (2014).
  18. Rozman, P., Semenic, D. Chapter 15. The Role of Platelet Gel in Regenerative Medicine. Advances In Regenerative Medicine. Wislet-Gendebien, S. abine In Tech. 319-349 (2011).
  19. Dohan Ehrenfest,, Lemo, D. M., Jimbo, N. Selecting a relevant animal model for testing the in vivo effects of Choukroun’s platelet-rich fibrin (PRF): Rabbit tricks and traps. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 110, (4), 413-416 (2010).
  20. Guilak, F., Baaijens, F. P. Functional tissue engineering: Ten more years of progress. J Biomec. 47, (9), 1931-1932 (2014).
  21. Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A., Baaijens, F. P. Biomechanics and mechanobiology in functional tissue engineering. J Biomec. 47, (9), 1933-1940 (2014).
  22. Collet, J. P., Shuman, H., Ledger, R. E., Lee, S. The elasticity of an individual fibrin fiber in a clot. Proc Natl Acad Sci. 102, (26), 9133-9137 (2005).
  23. Liu, W., et al. Fibrin fibers have extraordinary extensibility and elasticity. Science. 313, (5787), 634 (2006).
  24. American National Standard. Chapter 8: Test methods for vascular prostheses. Association for the Advancement of Medica lnstrumentation Guidance document: Cardiovascular Implants - Tubular vascular prostheses. ANSI/AAMI/ISO. 33-34 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics