Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea

Este protocolo ofrece un enfoque fácil y rápido para detectar tintas de biomateriales candidatas para detectar posibles efectos citotóxicos contra células primarias e inmunes sensibles antes de complejos experimentos de bioimpresión 3D. Después de la incubación de las células inmunes en las construcciones de tinta de biomateriales, las células se pueden recuperar fácilmente de las construcciones mediante un lavado suave para realizar análisis de citotoxicidad o biomarcadores aguas abajo. Este protocolo es directamente relevante para la ingeniería de tejidos en la que los tejidos bioimpresos que se destinan al trasplante deben construirse a partir de células primarias y tintas de biomateriales biocompatibles.

Para comenzar, prepare un cartucho de tinta biológica para instalarlo en la bioimpresora INKREDIBLE+3D. Primero, retire las tapas del extremo azul del cartucho de tinta de biomaterial de tres mililitros y coloque una boquilla de bioimpresión cónica estéril de calibre 22 en el extremo de bloqueo Luer del cartucho de biotinta. Conecte el tubo de suministro de presión de aire para el cabezal de impresión uno o PH1 al extremo opuesto del cartucho e inserte el cartucho con su boquilla de bioimpresión cónica adjunta en la ranura vertical de PH1.

A continuación, coloque firmemente el cartucho en PH1 con una boquilla de bioimpresión cónica que se extiende debajo del cabezal de impresión. Apriete el tornillo en el sentido de las agujas del reloj PH1 hasta que apriete el dedo para bloquear el cartucho de tinta biológica en su lugar. Tenga en cuenta que la bioimpresión 3D se puede realizar con PH2 vacío.

Encienda la bioimpresora e inicie el software de la bioimpresora en un PC conectado a la bioimpresora 3D a través de un cable USB 2.0. En el software, haga clic en el botón de conexión para sincronizarlo con la bioimpresora 3D. Observe tres opciones en el menú de control principal de la bioimpresora 3D.

Primero, prepare la bioimpresión. En segundo lugar, el menú de utilidades. Y tercero, la pantalla de estado.

Seleccione la opción preparar bioimpresión, luego desplácese hacia abajo y seleccione la opción ejes de inicio. Después de una calibración exitosa de los ejes XYZ, la altura de la cama de impresión disminuirá ligeramente y los cabezales de impresión se reubicarán por encima del punto central de la cama de impresión. Para proceder con la calibración del punto de partida para la bioimpresión en placas de 24 pocillos, retire una placa de cultivo estéril de 24 pocillos de su envoltura de plástico sellada y marque un punto en el punto central del pozo D1 en la parte inferior de la placa con un marcador permanente.

Retire la cubierta de la placa y coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en la cama de impresión con el pozo D1 ubicado en la esquina delantera izquierda de la cama de impresión. En el menú de control principal, seleccione el menú utilidades y, a continuación, mueva el eje. Mueva los cabezales de impresión en incrementos de un milímetro a lo largo de los ejes X e Y hasta que la boquilla de bioimpresión cónica de PH1 esté directamente sobre el punto marcado debajo del pozo D1. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla de bioimpresión cónica sobre el punto moviendo los cabezales de impresión en incrementos de 0,1 milímetros.

Registre las coordenadas X e Y de la boquilla de bioimpresión cónica cuando esté directamente sobre el centro del pozo D1 como se indica en la pantalla del panel de control de la bioimpresora 3D y marque las coordenadas. A continuación, levante la cama de impresión en incrementos de un milímetro hasta que el fondo del pozo D1 esté casi tocando la boquilla de bioimpresión cónica instalada en el cabezal de impresión uno. Ajuste el movimiento de la cama de impresión en incrementos de 0,1 milímetros si es necesario.

En el menú de utilidades, seleccione la opción de calibración del eje Z y, a continuación, seleccione y confirme la opción de calibración almacenar Z. Vuelva al menú principal y seleccione la opción preparar bioimpresión. Desplácese hacia abajo y seleccione la opción calibrar Z.

Actualice el código geométrico de la placa de 24 pocillos o el código G con las coordenadas de punto de partida correctas. Abra el archivo G-code de 24 pocillos proporcionado en el software bioprint. Actualice las coordenadas X e Y en la línea uno con los valores obtenidos en pasos anteriores y guarde el archivo con un nuevo nombre.

Asegúrese de que la bomba neumática esté bien conectada al puerto de admisión de aire trasero de la bioimpresora INKREDIBLE+3D y enciéndala. Extraiga la perilla de control delantera ubicada en el lado derecho de la bioimpresora INKREDIBLE+ 3D. Asegúrese de que los manómetros digitales para PH1 y PH2 ubicados en la parte frontal de la bioimpresora lean cada uno cerca de cero kilopascales.

Gire lentamente la perilla de control hacia adelante en el sentido de las agujas del reloj hasta que la presión indicada en el medidor izquierdo para PH1 alcance los 12 kilopascales. Coloque un papel de seda doblado o un trozo de película de sellado impermeable debajo de la boquilla de impresión del cartucho instalado, teniendo cuidado de no tocar la boquilla de impresión. En el menú de control principal de la bioimpresora 3D, seleccione preparar bioimpresión.

Desplácese hasta y seleccione activar PH1. Tenga en cuenta que la tinta biológica comienza a extruirse de la boquilla de impresión. Si es necesario, aumente la presión de extrusión girando la perilla de control en el sentido de las agujas del reloj hasta que la tinta biológica se extruya en un filamento continuo y registre el nuevo ajuste de presión.

Seleccione desactivar PH1 para detener la extrusión de la tinta biológica. Retire el papel tisú o la película que contiene la tinta biológica extruida de la cama de impresión y cierre la puerta de la bioimpresora. Para realizar la bioimpresión 3D de sustratos de hidrogel rectilíneo en un formato de placa de 24 pocillos, seleccione el menú de utilidades en el menú de control principal, luego seleccione deshabilitar la impresión SD que permitirá que el software de bioimpresora transmita archivos de código G a la bioimpresora 3D para imprimir.

Haga clic en el botón de carga en el software de la bioimpresora y seleccione el archivo de código G de placa de 24 pocillos actualizado. En el panel de control de la derecha en el software, seleccione la pestaña de vista previa de impresión y haga clic en el botón de impresión para comenzar la bioimpresión en el pozo D1. Una vez completada la bioimpresión de las construcciones rectilíneas, cubra la placa de 24 pocillos con su tapa y muévala a un gabinete de bioseguridad de clase II. Sumergir cada construcción rectilínea en dos gotas de solución estéril de cloruro de calcio 50 milimolares e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Aspire cuidadosamente la solución de cloruro de calcio de cada construcción del pozo y enjuague una vez en un mililitro de 1X PBS para eliminar el exceso de cloruro de calcio. Para evitar la deshidratación de las construcciones de hidrogel bioimpresas, mantenga las construcciones rectilíneas bioimpresas en 3D en PBS 1X frescos hasta que los mastocitos derivados de la médula ósea estén listos para ser sembrados en las construcciones. Con base en los parámetros de dispersión hacia adelante y hacia el lado de los BMMC analizados por citometría de flujo, se observó que el sustrato de hidrogel con la mayor concentración de CNC no alteró el tamaño nativo o la granularidad de los BMMC en comparación con los BMMC cultivados en ausencia de los sustratos de hidrogel de agarosa D-manitol CNC.

El análisis citométrico de flujo de la permeabilidad de los BMMC al yoduro de propidio demostró que ninguna de las concentraciones de CNC probadas provocó ningún efecto adverso sobre la viabilidad de BMMC. El sustrato de agarosa CNC aumentó la expresión de los biomarcadores de mastocitos a concentraciones de CNC mayores o iguales a 2.5%Sin embargo, los niveles de expresión de estos receptores se mantuvieron relativamente consistentes entre 2.5% y 12.5% CNC, lo que sugiere un efecto que es independiente de la concentración de CNC. El ensayo XTT demostró que la actividad metabólica de los BMMC cultivados en los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D se mantuvo relativamente consistente en aproximadamente el 100% en todos los puntos de tiempo probados.

Del mismo modo, los ensayos de liberación de LDH y exclusión de colorante PI no revelaron cambios significativos en la viabilidad de los BMMC. Una cuidadosa atención a la selección del medidor de la boquilla de impresión, la calibración de los ejes de la bioimpresora 3D y el ajuste de la presión de extrusión garantizarán una impresión reproducible de construcciones 3D de alta calidad. La facilidad con la que se pueden recuperar los mastocitos les permite ser sondeados por una amplia gama de ensayos biológicos para estudiar más a fondo cualquier aspecto de sus funciones celulares.