Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

Neuroscience

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Liu, F., Liu, N. Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals. J. Vis. Exp. (107), e53337, doi:10.3791/53337 (2016).

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Abstract

O sistema olfactivo inseto desempenha um papel importante na detecção de semioquímicos no ambiente. Em particular, o sensilas antenal que abrigam neurónios simples ou múltiplas, para dentro, são considerados para tornar a maior contribuição para responder aos estímulos químicos. Ao gravar diretamente potencial de ação no sensillum olfativa após a exposição a estímulos, a gravação sensillum único (SSR) técnica fornece uma abordagem poderosa para investigar as respostas neurais dos insetos a estímulos químicos. Para o bug cama, que é um parasita humano notório, vários tipos de sensillum olfatório foram caracterizados. Neste estudo, demonstramos respostas neurais de cama bug sensilla olfativo a dois estímulos químicos e as respostas dependentes da dose para um deles usando o método SSR. Esta abordagem permite que pesquisadores para realizar rastreio precoce de estímulos químicos individuais na olfativo sensilla cama bug, que iria fornecer informações valiosas para o desenvolvimento de novos atrativos ou repelentes de insetos de cama e benefícios dos esforços de controle de cama bug.

Introduction

O percevejo comum Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), como um ectoparasita temporária, é um inseto sugador de sangue obrigado, o que significa a sua sobrevivência, desenvolvimento e reprodução necessitam de fontes de sangue de hospedeiros, incluindo seres humanos e animais 1,2. Embora a transmissão do vírus raramente tem sido relatada devido a C. lectularius, o incômodo gerado por morder uma infestação afeta seriamente anfitriões tanto física como psicologicamente 3. A introdução e uso generalizado de inseticidas químicos, especialmente o DDT, reduziu o risco de infestações e até o final de 1950 as infestações estavam em um nível tão baixo que eles já não eram uma preocupação pública grave. No entanto, uma série de possíveis fatores levaram a ressurgimento em populações de percevejos em todo o mundo, tais como a redução do uso de inseticidas, um declínio de sensibilização da opinião pública, o aumento da atividade viajar, eo desenvolvimento de resistência a inseticidas 4-9. </ p>

Sinais químicos no ambiente são detectados e reconhecidos por insetos através de órgãos olfativos, como antenas e palpos maxilares. O sensilla olfativo sobre o inseto antenas desempenham um papel crucial na detecção desses sinais químicos. As moléculas químicas entrar na cutícula antenal através de poros na superfície da cutícula. Proteínas de ligação odorante no ligamento linfa antennal a estas moléculas químicas e transportá-los para os receptores olfativos 10. Os receptores olfactivos e os seus co-receptores do canal de iões catiónica não-selectivos na membrana neuronal, que será despolarizada uma vez que estas moléculas químicas são reconhecidas pelos receptores olfactivos 11.

Sensillum gravação único (SSR) foi desenvolvido para detectar a alteração extracelular no potencial de acção causada pela aplicação de um destes estímulos químicos ou não químicos. Através da inserção de um eletrodo de registro na linfa sensillum e um eléctrodo de referênciaem alguma outra parte do corpo do insecto (geralmente se os olhos compostos ou do abdómen), a taxa de disparo dos neurónios em resposta a estímulos podem ser gravados 12. As alterações no número de picos representam a sensibilidade do insecto a estímulos específicos. Estímulos químicos de diferentes identidades e concentração irá eliciar respostas neurais diferentes, com diferentes taxas de combustão e estruturas temporais, e pode assim ser utilizado para investigar o processo de codificação de o insecto a substâncias químicas específicas.

Para o percevejo comum, ambas as formas sexuais compartilhar o mesmo padrão de sensilla olfativa nas antenas: nove sulcado sensilla peg C, 29 cabelo-como E (E1 e E2) sensilla, e um par de cada um dos Dα, Dβ, Dγ peg suave sensilla 13,14. Como vários neurónios foram identificadas em cada tipo de sensillum, não é fácil de distinguir os potenciais de acção de diferentes neurónios alojados no mesmo sensillum, assim, para esta experiência a total números de potenciais de ação foram contadas off-line por um período de 500 ms antes e após a estimulação. O número de potenciais de ação após a estimulação foi então subtraído do número de potenciais de ação antes do estímulo e multiplicado por dois, a fim de quantificar as mudanças na taxa de disparo em cada sensillum indivíduo em picos por segundo 15.

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Protocol

1. Preparação de Instrumentos, Soluções de estímulos, e Percevejos

  1. Prepara-se uma solução de KNO 2 50% (w / v) em um frasco de 20 ml.
  2. Afie dois microeléctrodos de tungsténio em solução KNO 2 a 5 V mergulhando repetidamente os eletrodos de tungstênio dentro e fora da solução.
    1. Cerca de afiar o fio de tungsténio por imersão a cerca de 10 mm de fio de tungsténio a dentro e para fora da solução de KNO 2 a uma velocidade de 2 imersões / seg durante cerca de 5 min, o que pode consumir muito, a extremidade dianteira do fio de tungsténio.
    2. Delicadamente afiar o eléctrodo por meio de imersão de cerca de 1 mm da ponta do fio dentro e para fora da solução a uma velocidade de 2 imersões / seg durante pelo menos 1 minuto, de modo a fazer um ponto de o eléctrodo fino e afiado. Verifique o diâmetro ponta do eletrodo sob o microscópio com freqüência até que ele atinja 0,2-0,5 mm, que deve estar bem o suficiente para perfurar a cutícula percevejos sensillum olfativo.
      Nota: Enquanto manualmente afiadaening o eléctrodo, a velocidade de imersão de o fio de tungsténio na solução de KNO 2 não é constante durante todo o tempo. Com mais prática, é muito mais fácil de manter uma velocidade relativamente constante no afiar do eléctrodo. O tempo de nitidez também é incerto, dependendo de como o eléctrodo fino deve ser. Aqui, uma ponta de eléctrodo com o diâmetro de 0,2 m ~ é suficiente para perfurar através do sensillum olfactiva.
  3. Dilui-se cada um dos estímulos químicos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir do composto puro a uma concentração inicial de 1:10 v / v como uma solução estoque. Criar uma série de diluições Decádico dependendo do número de doses necessárias na experiência, novamente com o DMSO, a partir de cada uma das soluções de reserva para cada químico. Aqui, usa 10% (+) - β-pineno e eucaliptol.
  4. Coloque os dias em jejum ou sete de pós-alimentação percevejos adultos (macho ou fêmea) do Ft. Dix colónia (uma oferta do Dr. Haynes na Universidade de Kentucky) para ser usado em tele experimentar numa placa de Petri.
    Nota: Não há um número exato para percevejos colocados na placa de Petri. Ele pode ser um pouco ou muito.

2. Bed Bug Antena Preparação

  1. Anestesiar os percevejos no gelo (2-3 min).
  2. Corrigir tanto as antenas eo corpo inseto em uma lamela de microscópio com fita dupla face e remover as pernas com uma tesoura fina.
  3. Use um pequeno pino para tocar suavemente as antenas de modo a colocá-los na fita de forma constante.
  4. Descansar a lamela contra uma esfera pequena (~ 1 cm de diâmetro) de cera dental para facilitar a manipulação e ajustá-lo a um ângulo apropriado (~ 90 °) para o eléctrodo de registo (Figura 1).
  5. Uma vez garantido, coloque o bug cama sob um microscópio estéreo, ligue a fonte de luz fria e ajustar a intensidade da iluminação até a antena está claramente apresentada, e concentrar-se o microscópio sobre a segunda flagelo da antena de percevejos em alta ampliação (720x) .
    Nota: A intensidade de iluminação utilizado na experiência não é quantificada, que realmente depende de como os olhos do experimentador sentir a intensidade de iluminação.

3. Único Sensillum Recording

  1. Ligue o pré-amplificador (10X) com o controlador de aquisição de sinal, o qual está ligado com o computador para o registo e visualização de sinais. Ligue o computador e iniciar o software, por exemplo, AutoSpike32 e clique no modo "Record" na barra de menu. Em seguida, escolha a "onda" de modo a começar a gravar os sinais de onda.
    Nota: Uma linha reta em execução a partir da esquerda para a direita do monitor repetidamente deverão ser agora visíveis. Aqui, a janela de gravação dura 40 seg. Gravação de onda máximo é de 10 segundos. Taxa de amostragem selecionada é 96.000 e taxa de amostragem digital é 240. Há 0 deslocamento% e sem filtragem, nenhuma retificação para os sinais de gravação. Todas estas definições de parâmetros do software pode ser modificado conforme necessário.
  2. <li> Ligue o alto-falante ligado ao pré-amplif icador, que é usado para apresentar o modo de tonificação para as respostas neuronais a partir de sensillum antenal.
  3. Insira o eletrodo de referência para o abdome do percevejo estabilizado.
    Nota: O eletrodo de referência foi realizada por um metal estande fixada magneticamente à mesa do ar.
  4. Depois de o eléctrodo de referência tenha sido ligado ao abdómen da percevejo, mover o eléctrodo de registo, que está conectado ao pré-amplificador e manipulado por um micromanipulador, no sentido da extremidade posterior da antena do percevejo.
  5. Quando o eléctrodo de gravação está em contacto com a ponta direita da antena, ligar o microscópio e localizar o eléctrodo a baixa ampliação.
  6. Ajustar o eléctrodo de registo enquanto aumenta gradualmente até que a ampliação tanto o eléctrodo e o sensillum antenal estão no mesmo plano e claramente visíveis ao microscópio.
    Nota: Por esta altura, o microscópio é habitually com a maior ampliação.
  7. Insira o eletrodo de registro no eixo da sensillum usando o micromanipulador e ir um pouco mais fundo, se o ruído de fundo é elevado em comparação com o potencial de ação.
  8. Uma vez que os potenciais de acção claros são observados a partir do sensillum gravado, preencher uma micropipeta com 10% de (+) - β-pineno. Utilizar a micropipeta para depositar 10 ul aliquota de 10% (+) - β-pineno em uma tira de papel de filtro (~ 3 x 15 mm) colocado dentro de uma pipeta de Pasteur de vidro.
    1. Ligar a pipeta carregado para o tubo de saída do fluxo de impulsos de estímulo e o controlador de colocar a ponta da pipeta no pequeno orifício no tubo orientado para a antena.
  9. Quando todas essas ligações tenham estabilizado, pressionar o pedal do controlador de estímulo para fornecer um sopro de 0,5 seg estímulo (0,5 L / min) para o fluxo de ar humidificado contínua. A gravação do potencial de ação será iniciada simultaneamente quando o footswitch é deprimido. O processo de gravação será passado para 10 segundos a partir de 1 segundo antes da estimulação.
  10. Conte os potenciais de ação off-line para dois períodos 500 ms, uma antes e outra após a estimulação. Subtrair qualquer alteração na taxa de pico durante a 500 mseg após a estimulação da actividade espontânea registados durante os últimos 500 mseg e converter as contagens na escala convencional de espigas / s por sua multiplicação por 2.

4. Estímulo substituição na SSR

  1. Uma vez que o interruptor de pé foi desencadeada, entregar a 10% (+) - β-pineno na pipeta para o percevejo antenas e gravar a resposta a este odorante específico durante 10 seg, após o que a pipeta é removido.
  2. Rotular outra nova pipeta com o eucaliptol 0,001% a ser testado. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro sobre a qual 10 ul do estímulo foi aplicado, na nova pipeta.
  3. Espere por 2-5 min até que o estímulo é completamente vaporized na pipeta de vidro. Fixar a pipeta para o tubo de saída do fluxo de impulsos.
  4. Insira a ponta da pipeta no pequeno orifício do tubo orientado para a antena. Pressionar o pedal e iniciar a gravação de 10 segundos.
  5. Desligue a pipeta e preparar outra pipeta com 0,01% de eucaliptol.
  6. Teste todo o resto das doses de eucaliptol (de 0,001% a 10%) sobre o sensilla antennal para observar as respostas dependentes da dose. Teste a partir do mais diluída para as doses menos diluir.

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Representative Results

Sensillum gravação única é uma técnica de investigação poderoso utilizado em estudos de insetos ecologia química e fisiologia neural. Investigando as respostas neurais dos insetos aos compostos voláteis diferentes, especialmente aqueles pensado para ser ecologicamente relacionado com a sobrevivência eo desenvolvimento dos insetos, não só nos dá insights valiosos no processo de olfato do inseto, mas também abre novos caminhos promissores que poderiam, potencialmente, levar para o desenvolvimento de novos reagentes úteis para o controlo de pragas.

O percevejo comum, como uma praga urbana notório, certamente tem atraído a atenção de muitos pesquisadores. Entre as várias áreas de estudo relacionadas com erros de cama, seu mecanismo de olfato é de extrema importância para a ecologia química de percevejos. Estudos anteriores descritos explicitamente a quantidade e a distribuição de diferentes tipos de sensillum olfativa na camabug antenas. Como mostrado na Figura 2A, percevejos antenas possuem quatro segmentos (SC, PE, F1 e F2). A maioria das sensilas olfactivo são apresentados na extremidade posterior da segunda flagelo (F2), mas a sua distribuição é distintamente diferente para cada tipo: sensilas D, nomeadamente Dα, Dβ e Dγ, só são localizados ao longo do lado interior da antenas (Figura 2C), enquanto o C e E (E1 e E2) sensilas são encontrados em ambos os lados das antenas (Figura 2B). Por conseguinte, a fim de assegurar que gravar a resposta neural de sensilas D, posicionamento cuidadoso da antena é essencial.

Uma vez que ambas as formas sexuadas de partes de percevejos o mesmo padrão de tipos de sensilas e o lado interior da sua antenas contém todos os tipos de sensilas, voltadas para esta área faz com que seja muito mais fácil para gravar as respostas químicas de todos os diferentes tipos de sensilas separadamente na antenaE (Figura 3A). Na gravação sensillum único, olfativas diferentes sensilla exibem sinais neurais com distintamente diferentes potenciais tipos e amplitudes (Figura 3B) de ação. Por exemplo, E sensilla são conhecidos por ter um ou dois neurônios no interior, enquanto casas sensilla tipo D mais neurônios do que E ou C sensilla, produzindo potenciais de ação mais complicados do que os outros, como resultado. As amplitudes das respostas neurais a partir de C sensilas são muito menores do que aqueles dos outros tipos Sensillum.

Uma vez que as conexões de eletrodos foram criadas, as respostas neurais a partir de cada tipo de sensillum para cada estímulo podem ser registrados com base em sua identidade e intensidade. Para alguns estímulos para que os percevejos são extremamente sensíveis, a resposta neural pode ser muito fortes e últimos segundos após o término da estimulação. Por exemplo, em resposta a 10% (+) - β-pineno, percevejos mostrouuma forte reacção com uma enorme taxa de queima (≥200 espigas / seg) e dinâmicas temporais super-sustentada, em comparação com o controlo com solvente sozinho como o estímulo (Figura 4A e B). Diferentes estímulos podem desencadear totalmente diferentes respostas neurais a partir do mesmo sensillum e diferentes concentrações de um mesmo estímulo são susceptíveis de gerar bastante diferentes frequências de queima. Como mostrado na Figura 5, aumentando a concentração de eucaliptol levantou as frequências de disparo a partir de 30 pontos / seg a 0,001% para 240 pontos / seg a 10% de uma maneira dependente da dose.

figura 1
Figura 1. Um diagrama esquemático que mostra o processo de fixação para percevejos. O erro de cama é estabilizado na lamela com as antenas fixas na fita. A amostra montado é então colocado sobre uma fase magnética. A orientação e a altura da amostra cum ser ajustado para um ângulo adequado entre as antenas de percevejos eo eletrodo de gravação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Distribuição de sensilla olfativa nas antenas de percevejos. (A) A Scanning Microscope Eletrodo (SEM) imagem de uma antena de percevejos. A antena tem quatro segmentos, o Sculpus (SC), Pedecel (PE), a primeira flagelo (F1) e o segundo flagelo (F2). A maioria das sensilas olfactivo estão localizados em F2, embora algumas sensilas olfactivas também foram encontrados em F1, que se pensa estar relacionada com a sua função de detecção da agregação de feromona para o percevejo 16. (B) Uma imagem SEM do lado exterior de F2, que abriga o olfac C e Esensilla tory. A imagem SEM do lado interno da F2, que foi encontrado para abrigar todos os diferentes tipos de sensilla olfatório (C): D (Dα, Dβ, Dγ), C e E. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 3
Figura 3. sinais neurais típicos de diferentes tipos de sensilla olfativo na cama bug antenas. (A) de alta resolução de MEV imagens de cada tipo de sensillum olfativa nas antenas de percevejos. (B) sinais neurais típicas dos diferentes sensilas olfactiva antes da exposição a um estímulo. Dα, Dβ, Dγ e C sensilla, que abrigar vários neurônios olfatórios (ORS), exibem potenciais de ação mais complicados do que E1 e E2 sensilla, que contain apenas um ou dois ORS. As amplitudes dos potenciais de ação de C sensilla são muito menores do que os de outros tipos Sensillum. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. resposta neural representativas de estímulos que percevejos são sensíveis a. Traço (A) de sinais, mostrando a resposta neural típico de um sensillum olfactiva (Dγ) para o solvente, o qual é utilizado como o controlo na única gravação sensillum. Os traços de sinal são definidos para iniciar um segundo antes do 0.5 seg sopro de estímulo. Os traços de sinal para continuar a gravar 10 segundos após o início do sopro de estímulo. (B) Signal traçar mostrando a resposta neural extremamente forte de uma olfativosensillum (Dγ) a um estímulo botânico, 10% (+) - β-pineno. Após o sopro de (+) - β-pineno é entregue ao sensillum Dγ, ORS alojados dentro deste sensillum são disparados com alta freqüência e uma dinâmica temporal, de longa duração. A barra branca acima do sinal de rastreamento indica o intervalo de 1 segundo antes da exposição ao estímulo, a barra vermelha acima do traço corresponde à entrega do sopro de estímulo para o sensillum olfativo, ea barra preta acima do traço indica o sinal gravado após o término do sopro de estímulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. respostas dependentes da dose representativos de ORS aos estímulos. Utilizando um outro estímulo botânico, eucaliptol como um example, sensilas Dγ exibido uma resposta dependente da dose de diferentes concentrações de eucaliptol. Como as concentrações aumentou de 0,001% a 10%, as frequências de disparo passou de 30 pontos / seg a 240 pontos / seg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica standard sensillum gravação tem sido extensivamente utilizado para testar as respostas neurais de insectos, tais como moscas de fruta, mosquitos e percevejos a diferentes estímulos químicos no ambiente. Estes estímulos químicos são frequentemente dissolvidos e diluídos num solvente comum, a fim de preparar a diferentes doses de tratamentos. No entanto, diferentes solventes pode produzir diferentes taxas de libertação bastante para os estímulos. Estudos anteriores sobre alguns insetos amplamente estudados, tais como Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti ter geralmente utilizado o óleo de parafina como o solvente para dissolver os estímulos, como estes insectos são relativamente insensíveis ao óleo de parafina 17-20. O óleo de parafina foi igualmente utilizado em estudos anteriores de gravação sensillum individuais de percevejos, pela mesma razão 14. No entanto, o solvente mais comumente utilizada pode não ser a melhor para cada espécie de insecto. No caSE de percevejos, tanto o óleo de parafina e DMSO, a que também exibem percevejos insensibilidade, foram utilizadas para dissolver os estímulos em diferentes estudos 14,15, mas as mesmas doses de estímulos diluídos em DMSO parecem desencadear respostas muito mais fortes em neurais o sensilla de percevejos. Por exemplo, dissolveu-DMSO R - (+) - limoneno e S - (-) - limoneno respostas neurais gerados de ≥70 espigas / seg de Dγ sensilas em percevejo antenas, enquanto a limoneno-dissolvida de óleo de parafina induziu respostas neurais da única ≤ 25 pontos / seg de Dγ sensilla. Esta redução nas respostas neuronais é bastante comum nos estímulos que foram diluídos com óleo de parafina, provavelmente devido à taxa de libertação mais lenta de óleo de parafina em comparação com DMSO. Esta taxa de libertação mais lenta reduz a quantidade de estímulo distribuída sobre a superfície do sensillum e pode resultar em uma conclusão sobre a sensibilidade enganosa de insectos para certas semioquímicos.

Dois ste críticaps para a realização da única gravação sensillum são uma preparação 1) da amostra e 2) a gravação do sinal. Para a preparação da amostra, uma vez que os percevejos têm pernas muito fortes e antenas movendo ativamente, é muito importante remover todas as pernas e ficar a antena firmemente na fita dupla face. No processo de gravação do sinal, por vezes, é posicionalmente impossível para o eléctrodo para apontar para o eixo sensillum. Se este for o caso, o eléctrodo pode perfurar a extremidade posterior do sensillum, sempre que dá um sinal muito limpa e clara com muito pouco ruído de fundo.

Como existem vários neurônios alojados na D e C tipo sensilla, muitas vezes é difícil distinguir entre neurônios individuais com base nas amplitudes e formas dos potenciais de ação produzidos durante SSR. No entanto, ainda é possível ver as diferenças nas respostas do percevejo a diferentes estímulos com base na frequência de disparo combinado de todos os neurónios na mesma sensillum. Teoricamente, percevejos são sensíveis a certos estímulos com forte estimulação enquanto insensível a outros estímulos com estimulação fraca com a mesma dose. Outros estudos integrando testes de comportamento e informações de sua resposta neural a esses estímulos, portanto, fornecer informações significativas sobre os semioquímicos ecologicamente relacionados para percevejos.

Neste estudo, nós também utilizamos a técnica de SSR para testar as respostas neurais de sensilla olfativo para diferentes doses de estímulos. Observamos um padrão dose-dependente em respostas neurais do percevejo para diferentes produtos químicos. No entanto, considerando o ambiente complexo percevejos viver, a dose real de voláteis encontrados por percevejos em seus arredores normais será muito baixo. Como resultado, os semioquímicos que provocam forte resposta neural em doses baixas até 5 v / v 1:10 e 4 v / v são mais susceptíveis de ser biologicamente significativa para percevejos do que outros produtos químicos t 1:10chapéu única função em doses elevadas. Portanto, esses semioquímicos que actuam em doses baixas, provavelmente, desempenham um papel importante na quimiorecepção de percevejos, ajudando-os a localizar um hospedeiro ou evitar factores adversos, e irá, assim, proporcionar uma orientação útil para rastreio de prometendo atractores de percevejos ou repelentes para uso em Os ensaios de laboratório e de campo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire A-M SYSTEMS #716500 Used for preparing the electrode
KNO2 Sigma #310484 Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply BK Precision 1653A Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Leica Z6 APO Microscope Leica 10447424 Used for observing the sensilla on antennae
Simulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
4-Channel USB Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Light Source SCHOTT A20500 Providing light sources for observation
Micromanupulator Leica 115378 Used for minor movement of electrode
Speaker Juster 95a Connected with Acquisition Controller IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic stand Narishige GJ-1 Used to hold the reference electrode, stablized bed bug and stimulus delivery tube
TMC Vibration Isolation Table TMC 63-500 Used for isolating the vibration from the equipments
Coverslip Tedpella 2225-1 Used for holding the bed bug
Double-sided Tape 3M XT6110 Used for stablizing the bed bug on the coverclip
Dental Wax Dentakit DK-R012 Used for supporting the coverclip where bed bug is stablized 

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References

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