बहु रंग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों का उपयोग कॉर्नियल प्रकोष्ठों के वंश पता लगाने के लिए एक विधि

1Department of Genetics and Developmental Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology, 2Department of Ophthalmology, Hillel Yaffe Medical Center, 3Bioimging Center, Biomedical Core Facility, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally
Published 12/18/2015
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Developmental Biology
 

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Amitai-Lange, A., Berkowitz, E., Altshuler, A., Dbayat, N., Nasser, W., Suss-Toby, E., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. J. Vis. Exp. (106), e53370, doi:10.3791/53370 (2015).

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Abstract

Introduction

भ्रूण विकास के दौरान, ऊतक और अंग morphogenesis सेल प्रसार, सेल प्रवास और वंश विनिर्देश 1-4 के संदर्भ में वर्णित किया जा सकता है कि एक सटीक कार्यक्रम के माध्यम से जगह ले लो। ये जैविक प्रक्रियाओं को भी सेल पुनर्जनन स्टेम की आवश्यकता है जो वयस्क ऊतक homeostasis, बनाए रखने में शामिल कर रहे हैं। वंश ट्रेसिंग, पहचान और सेल की आबादी का एक विशिष्ट प्रकार की संतान की ट्रैकिंग, भ्रूण का अध्ययन और सेल homeostasis स्टेम के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। दरअसल, यह तेजी से अनुसंधान के कई क्षेत्रों में उपयोग किया जा रहा है। विशेष रूप से, वंश ट्रेसिंग homeostasis और कैंसर के विकास में मूल और स्टेम सेल के भाग्य की पहचान करने में एक अनिवार्य उपकरण बन गया। यह सेल अलगाव के लिए और इन विट्रो संस्कृति या transplantati में इसके विपरीत में, कम से कम प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ सेल बरकरार ऊतक या जीव के संदर्भ में कैसे बर्ताव के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकता है, क्योंकि यह वह जगह हैउस पर अवांछित पूर्वाग्रह में हो सकता है।

परंपरागत रूप से, कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में शामिल है, जो इस तरह के लिपिड घुलनशील carbocyanine रूप रंग, वंश पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रयोगों के इन प्रकार के सफलतापूर्वक विकास जीव विज्ञान 5,6 में प्रमुख खोजों और आकार का मौलिक अवधारणाओं के लिए नेतृत्व किया है, वे लक्षित कोशिकाओं की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए कठिनाई, सेल व्यवहार पर डाई के अवांछित प्रभाव और कमजोर पड़ने सहित कुछ सीमाएं हैं, समय के साथ लेबल के। न्यूक्लियोटाइड एनालॉग लेबलिंग दृष्टिकोण संभवतः स्टेम कोशिकाओं 7.8 मौन के अनुरूप है कि "लेबल को बनाए रखना कोशिकाओं" धीमी गति से साइकिल के अस्तित्व का दस्तावेजीकरण के लिए सक्षम है। इस तकनीक का एक सीमित समय अवधि में प्रसार कैनेटीक्स के आधार पर धीमी साइकिल चलाना कोशिकाओं की उपस्थिति का प्रदर्शन कर सकता है, जबकि हालांकि, यह स्टेम कोशिकाओं की कार्यक्षमता के बारे में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सके। एक इष्टतम वंश अनुरेखण मेथodology उल्लेखनीय सेल, अपनी संतान, या अपने पड़ोसियों के गुणों पर लेबलिंग के प्रभाव को कम करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह एक मंच है और समय पर निर्भर तरीके के साथ-साथ एक एकल कोशिका (प्रतिरूप) ढंग से ब्याज की सेल की आबादी को टैग करने की क्षमता है, अर्थात्, लेबलिंग प्रेरण पर नियंत्रण करने के लिए फायदेमंद होगा। लेबल समय के साथ बनाए रखा, और पड़ोसी कोशिकाओं को हस्तांतरित नहीं किया जाएगा तो यह है कि संस्थापक सेल के सभी संतान को पारित कर दिया है कि एक स्थिर और अपरिवर्तनीय लेबलिंग विधि महत्वपूर्ण है।

हाल ही में, सेल लेबलिंग की आनुवंशिक दृष्टिकोण विकसित किए गए। इन प्रणालियों में, सेल विशिष्ट प्रमोटरों ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या Β-galactosidase रिपोर्टर जीन 9-13 के रूप में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति एक loxP-घिरे अंधी गली को दूर करने और अनुमति देने के लिए रचनात्मक Recombinase अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण न केवल कोशिकाओं और उनके संतान की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी सेल है परमिटolation और आणविक लक्षण वर्णन। एकल कोशिका के स्तर पर सेल ट्रैकिंग एक एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की प्रेरण से संभव हो गया। इस प्रणाली का एक महत्वपूर्ण सीमा कोशिकाओं की बहुत कम प्रतिशत अलग और व्यक्तिगत क्लोन का पता लगाने के लिए संभव है लेबल है कि केवल जब तथ्य है। बहुरंगा संवाददाताओं से इस्तेमाल किया जा सकता इस सीमा को पार करने के लिए। बहुरंगा लेबलिंग का उपयोग करते समय, एक ही जगह में पड़ोसी की कोशिकाओं के अंतर भाग्य की ट्रैकिंग कुशलता से 14-17 से हासिल किया जा सकता है। हाल ही में, Brainbow (बीआर) alleles की एक किस्म Cre / lox प्रणाली का उपयोग कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की एक स्टोकेस्टिक अभिव्यक्ति सक्षम करने, वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए विकसित किए गए। Cre / lox प्रणाली को पहचानता है और इस तरह के loxP साइटों के रूप में विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है जो रचनात्मक Recombinase एंजाइम होते हैं। निम्नलिखित Cre Recombinase के बंधन, साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन होता है, loxP को हटाने की घिरे दृश्यों resultin का कारण बनता हैविभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के यादृच्छिक अभिव्यक्ति में जी (तंत्र नीचे वर्णित है)। बीआर लाइनों की एक किस्म (समीक्षा 16,18,19 देखें) उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। बीआर प्रकारों के बीच बड़े मतभेद 2 (बीआर 2.0), 3 (Br1.0) से 4 (Br1.1, Br2.1) फ्लोरोसेंट जीन को लेकर कैसेट में शामिल फ्लोरोसेंट जीनों की संख्या में (मैं) मतभेद शामिल (ii) आपस में केंद्रित Lox साइटों की उपस्थिति का इस्तेमाल किया Lox साइटों (iii) के प्रकार, और (iv) अभिव्यक्ति या फ्लोरोसेंट जीन अभिव्यक्ति की चुप्पी से पहले Cre सक्रियण के लिए, जीन उलटा (Br2.0-2.1) की अनुमति है। हाल ही में स्थापित Br3 न्यूरॉन्स की बहुरंगा इमेजिंग के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करता है। इस प्रतिलेख की मुख्य विशेषताओं में से एक यह बेहतरीन न्यूरोनल का एक भी धुंधला 20 प्रक्रियाओं जो सक्षम photostable farnesylated फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक नया सेट होता है।

महत्वपूर्ण बात है, बीआर कैसेट के विभिन्न संस्करणों Thy1 जनसंपर्क न्यूरोनल विशिष्ट हो सकती हैomoter या सर्वत्र सीएजी (सीएमवी) प्रमोटर व्यक्त किया। बीआर ट्रांसजेनिक चूहों में से कुछ एक एकल बीआर ट्रांस्जीन हो सकती है, जबकि अंत में, दूसरों जिससे प्रत्येक कोशिका में व्यक्त किया जा करने के लिए रंग संयोजन के लिए संभावनाओं की एक विशाल संख्या के उत्पादन की अनुमति, कई ट्रांस्जीन प्रतियां शामिल हो सकते हैं (उदाहरण के लिए 16 देखें)।

हमारे अध्ययन में, हम बीआर 2.1 कैसेट 21 में शामिल है जो R26R-कंफ़ेद्दी माउस का प्रयोग किया। Br2.1 विशिष्ट रचनात्मक मध्यस्थता डीएनए व्युत्क्रमों और क्योंकि loxP साइटों (चित्रा 1) के पारस्परिक उन्मुखीकरण का न केवल excisions अनुमति देने के लिए बनाया गया है। इस प्रकार, रंग बदलने के लिए नेतृत्व जो इन उलटा / छांटना घटनाओं के रूप में लंबे समय रचनात्मक 16 मौजूद है के रूप में जारी रख सकते हैं। कारण है कि, एक inducible अस्थायी रचनात्मक अभिव्यक्ति प्रणाली विश्वसनीय सेल ट्रैकिंग Br2.1 उपयोग करने के लिए आवश्यक है। चित्र में दिखाया गया है। 1, Br2.1 loxP-घिरे नव आर -casse के बाद एक सर्वव्यापी सीएजी प्रमोटर शामिलएक ट्रांसक्रिप्शनल अंधी गली के रूप में कार्य करता है जो टीटीई, कि दो tandems में तैनात पीले हरे रंग के लिए 4 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, एन्कोडिंग (GFP), (YFP), लाल (आरएफपी) और सियान (सीएफपी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन, द्वारा पीछा किया जाता है। कोई प्रतिदीप्ति Cre सक्रियण करने से पहले व्यक्त की है। Cre Recombinase की प्रेरण एक दिया सेल में 4 फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक यादृच्छिक अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के नव-आर कैसेट के हटाने का कारण बनता है। दूसरे खंड loxP-घिरे आरएफपी और एक उलट सीएफपी होता है, जबकि पहले खंड, loxP-घिरे GFP और एक उलट YFP शामिल हैं। ये डीएनए खंडों लगातार रूप में लंबे समय रचनात्मक Recombinase मौजूद है, (उलट अभिविन्यास में है कि loxP का उपयोग) उल्टे, या excised जा सकता है। इसलिए, एक क्षणिक और नियंत्रित Cre ट्रांस्जीन इस्तेमाल किया जाना चाहिए। YFP की अभिव्यक्ति और आरएफपी साइटोप्लास्मिक है, GFP के परमाणु और सीएफपी कोशिका झिल्ली के लिए बाध्य है: Br2.1 कैसेट संकेत स्थान पर ओवरलैपिंग उत्सर्जन के बीच भेद के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। GFPऔर आरएफपी उत्सर्जन आसानी से पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से अलग होती है। YFP / GFP / सीएफपी उत्सर्जन को अलग करने के लिए, एक वर्णक्रमीय confocal इमेजिंग प्रणाली की जरूरत है। कुल मिलाकर, Br2.1 कैसेट प्रत्येक लक्षित सेल में एक चार के बाहर अलग फ्लोरोसेंट जीन की, यादृच्छिक inducible, और ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। रंग संयोजन की एक बड़ी संख्या की जरूरत है जब वास्तव में, एक इस प्रकार प्रत्येक कक्ष के लिए 2 रंग टैग की अभिव्यक्ति में और 10 को संभव रंग संयोजन की संख्या में बढ़ोतरी के लिए, जिसके परिणामस्वरूप Br2.1 के 2 एलिलों होते हैं कि समयुग्मक चूहों उत्पन्न कर सकते हैं कैसेट की कई प्रतियां उनके जीनोम 16 में एकीकृत किया गया के बाद से 22। बीआर माउस उपभेदों के कुछ संभव रंग संयोजन की एक बहुत बड़ी संख्या की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम करें। फिर भी, ज्यादातर मामलों में, एक भी Br2.1 एलील द्वारा प्रदान की चार रंग संयोजन के लिए पर्याप्त हैं। यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल के बाद, एक Spectr की एक अपेक्षाकृत सरल सेटअप का उपयोग इस पद्धति स्थापित कर सकते हैंजांच के लिए छोटे से अगर किसी की जरूरत के साथ अल माइक्रोस्कोपी।

यहाँ हम कार्निया उपकला के वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए, एक भी Br2.1 एलील होते हैं कि R26R-कंफ़ेद्दी चूहों के उपयोग के लिए एक अनुकूलनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस ट्रांसजेनिक माउस तनाव पेट के 21,23 और कार्निया उपकला स्टेम कोशिकाओं 22,24 का मूल है और भाग्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और फोकल कमानी ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस में गुर्दे podocyte निस्र्पक के लिए आंत्र कैंसर 25 में स्टेम सेल गतिविधि की उपस्थिति (FSGS) 17।

Protocol

आचार कथन: इस अध्ययन जानवरों की देखभाल और उपयोग में नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के लिए पुष्टि कर रहे थे। सभी प्रयोगों स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

माउस तनाव व्यक्त एक उपयुक्त Cre पर Recombinase चुनें 1.

  1. जांच की जा खरीद 26 और लक्षित ऊतक के आधार पर लिए उपलब्ध Cre ट्रांसजेनिक लाइनों की महान विविधता से बाहर, रचनात्मक Recombinase जीन ब्याज के ऊतकों के लिए विशिष्ट है कि एक प्रमोटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें एक Cre ट्रांसजेनिक माउस तनाव चुनें। मामले अस्थायी नियंत्रण की जरूरत है, एक inducible Cre लाइन चुनें।
    नोट: हम विशेष रूप से limbal और कार्निया उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं 24 लेबल करने के लिए tamoxifen inducible K14-CRE ईआरटी ट्रांस्जीन चुना है। Di Girolamo और सहकर्मियों को अपने K1 के लिए कोई कार्निया अभिव्यक्ति के साथ limbal विशिष्टता सूचना के रूप में, तनाव के बीच मतभेद हो सकता है कि नोट4-CRE ईआरटी 22। Inducible ट्रांसजेनिक Cre चूहों का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह है कि यह बहुमुखी समय तख्ते पर ट्रेसिंग वंश की प्रेरण की अनुमति देता है।

2. एक उपयुक्त बीआर माउस तनाव चुनें

  1. अनुसंधान प्रश्न और उपलब्ध Cre लाइन 16,18,20 के आधार पर उचित बीआर कैसेट चुनें।
    1. एक गैर-inducible Cre माउस तनाव प्रयोग किया जाता है, तो निरंतर डीएनए व्युत्क्रमों / excisions अनुमति देते हैं और इस प्रकार 16 (उदाहरण Br1.0 या Br1.1 के लिए) मृत अंत उत्पादों को जन्म देना नहीं है कि एक br कैसेट चुनें।

3. ब्याज की ट्रांसजेनिक लाइन पार

  1. यहाँ दिखाया प्रोटोकॉल के लिए, hemizygous offsprings प्राप्त करने के लिए समयुग्मक Cre ईआरटी तनाव (सीआरई ईआरटी / Cre ईआरटी) के साथ समयुग्मक R26R-कंफ़ेद्दी तनाव (Br2.1 / Br2.1) क्रॉस (Br2.1 / +; Cre / +) मोनो allelic वे सभी एक ही Br2.1 एलील होते ही वंश अनुरेखण और एक के लिए तैयार हैंएकल Cre एलील।
    नोट: एक से दो Cre एलिलों (Br2.1 / +; Cre / सीआरई) होते हैं कि चूहों उत्पन्न कर सकता है लेबलिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए, जबकि दो Br2.1 एलिलों (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) होगा (22 में विस्तृत रूप में) रंग संयोजन वृद्धि हुई है।

4. Cre पर Recombinase प्रेरण

नोट: इन प्रयोगों में Tamoxifen के प्रशासन limbal और कार्निया बेसल K14 पॉजिटिव स्टेम / पूर्वज के नाभिक में रचनात्मक ईआरटी Recombinase की translocation प्रेरित करने के क्रम में, 3-4 दिनों की अवधि के लिए, दैनिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा किया गया उपकला कोशिकाएं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल चार चूहों के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, आंख की सतह के लिए Tamoxifen के सामयिक आवेदन उच्च दक्षता अर्जित करता है। Tamoxifen समाधान एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है। उपयोग करने से पहले समाधान गर्म।

  1. Tamoxifen के 100 मिलीग्राम वजन और मकई तेल की 5 मिलीलीटर में भंगएक 20 मिलीग्राम / एमएल tamoxifen के समाधान के रूप में।
  2. Intraperitoneally 3-4 दिनों के लिए लगातार आठ सप्ताह पुरानी चूहों को Tamoxifen (4 मिलीग्राम) समाधान के 200 μl इंजेक्षन।
    नोट: Tamoxifen समाधान एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है। उपयोग करने से पहले समाधान गर्म।
  3. सामयिक आवेदन के लिए: Tamoxifen के 60 मिलीग्राम वजन और एक 60 मिलीग्राम / एमएल tamoxifen के समाधान के रूप में करने के लिए मक्का का तेल के 1 मिलीलीटर में भंग। भंवर और 65 पर बनाए रखा एक मिलाते हुए पानी में स्नान समाधान सेट डिग्री सेल्सियस यह उपयोग करें जब तक स्नान में स्पष्ट छुट्टी यह हो जाता है जब तक।
    1. ध्यान से माउस की प्रत्येक आंख की सतह के लिए Tamoxifen समाधान के 100 μl लागू होते हैं।

इमेजिंग के लिए 5. ऊतक तैयार

  1. Isoflurane का उपयोग बलिदान जानवरों Tamoxifen इंजेक्शन और कर्नल निम्न उपयुक्त समय बिंदुओं पर सीओ 2 साँस लेना द्वारा पीछा संज्ञाहरण (सजगता के अभाव के कारण उचित anesthetization पुष्टि) (2% ऑक्सीजन में वाष्पीकृत)प्रासंगिक ऊतक लेवल।
    1. इन प्रयोगों के लिए, निम्न बिंदुओं पर समय आंखों पता लगाना: 1, 4, 8, 12, और 16 सप्ताह के बाद Tamoxifen इंजेक्शन। घुमावदार संदंश का उपयोग करके स्पष्टीकरण पाना। नेत्रगोलक थैली से बाहर पॉप करने के कारण पलकें दबाएं। ऑप्टिक तंत्रिका पकड़े नेत्रगोलक पीछे संदंश रखें। धीरे नेत्रगोलक खींचने के लिए और यह अलग।
      नोट: नीचे वर्णित के रूप में इस स्तर पर, ऊतकों लेबल की कोशिकाओं के wholemount विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता। नियमित रूप से जमे हुए ऊतक वर्गों भी पीएफए ​​में तय की और नीचे के रूप में वर्णित (धारा 6 और 22 देखें) imaged, तैयार किया जा सकता।
  2. पीबीएस के साथ भरा एक 60 मिमी डिश में हर आंख रखें।
  3. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत उपयोग कर संदंश नीचे का सामना करना पड़ कॉर्निया के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के पास आंख पकड़ और ऑप्टिक तंत्रिका, मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटाने और आंख के पीछे के हिस्से में एक छोटा सा चीरा बनाने के क्रम में एक छुरी का उपयोग करें।
  4. वसंत कैंची का प्रयोग सावधानी से बढ़ानालेंस बाहर पॉप और संदंश का उपयोग आईरिस को दूर दे काटा।
  5. एक छुरी का उपयोग कर परिधि की ओर केंद्र से शुरू 4-5 रेडियल चीरों बनाकर कॉर्निया समतल।
  6. किनारी से परे अतिरिक्त परिधीय ऊतक में कटौती करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें।
  7. तो संक्षेप में पीबीएस के साथ उन्हें धोने, 10 मिनट के लिए पीएफए ​​4% में कॉर्निया को ठीक करें।
  8. 10 मिनट के लिए DAPI साथ नमूने सेते और संक्षेप में पीबीएस से धो लें।
  9. उपकला पक्ष का सामना करना पड़ के साथ कांच स्लाइड पर माउंट कॉर्निया। एक कवर गिलास के साथ कॉर्निया और कवर के शीर्ष पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद रखें। स्लाइड आर टी ओ / एन शुष्क करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड रखें।

6. confocal माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग विश्लेषण

  1. YFP / GFP / सीएफपी उत्सर्जन की जुदाई में सक्षम बनाता है जो एक वर्णक्रमीय confocal प्रणाली का प्रयोग करें। सेट प्रतिदीप्ति उत्तेजना और ब्रोमीन कैसेट का फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आधार पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य। कम से कम क्रॉस पर निशाना प्रत्येक प्रोटीन के लिए सबसे उपयुक्त उत्तेजना तरंगदैर्ध्य चुनेंउत्तेजना। अलग प्रोटीन से संकेतों का रिसाव कम करने के क्रम में संकीर्ण उत्सर्जन सीमा का चयन।
    1. Br2.1 कैसेट के लिए, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रतिदीप्ति उत्तेजना (पूर्व) और उत्सर्जन (ईएम) की स्थापना निम्नलिखित का उपयोग: - सीएफपी पूर्व 405 एनएम / उन्हें 420-480 एनएम - DAPI के पूर्व 458 एनएम / उन्हें 470-500 एनएम, GFP - पूर्व 488 एनएम / उन्हें 497-508 एनएम, YFP - पूर्व 514 एनएम / उन्हें 529-540 एनएम, और आरएफपी - पूर्व 561 एनएम / उन्हें 575-615 एनएम।
  2. उच्च संकल्प के साथ बड़े ऊतक क्षेत्रों कल्पना करने के क्रम में, टाइल इमेजिंग हासिल। यानी चित्रा 2A बी, छवि 12 x 12 छवियों की एक सरणी प्राप्त करने के द्वारा पूरे कॉर्निया में दिखाया गया है परिणामों के लिए, प्रत्येक क्षेत्र में 4 फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग कर 144 क्षेत्रों (एक्स 512 512) हासिल। कुल मिलाकर 576 छवियों को इकट्ठा और फिर विलय।
  3. विभिन्न गहराई और ऊतकों की संरचनाओं में टैग कोशिकाओं के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए, ब्याज की अलग-अलग क्षेत्रों के Z ढेर छवियों हासिल। के क्रम मेंओ छवि के कॉर्निया की पूरी गहराई, 3 माइक्रोन अंतराल पर 8 ऑप्टिकल वर्गों हासिल। अधिकतम तीव्रता के आधार पर छवि के अनुमानों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एकत्र वर्गों के orthogonal विचारों पारंपरिक इमेजिंग सॉफ्टवेयर 24 का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है।

Tamoxifen प्रेरण के साथ 7. कॉर्नियल चोट संयुक्त

  1. Isoflurane साथ चूहों (ऑक्सीजन में वाष्पीकृत 2%) anesthetize और प्रशासन के दर्दनाशक दवाओं (10 मिलीग्राम / किग्रा Carpofen, subcutaneously इंजेक्ट)। पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए unresponsiveness द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें।
  2. Tamoxifen पाउडर का 1 ग्राम वजन और 200 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता समाधान का उत्पादन करने के लिए बाँझ DMSO के 5 मिलीलीटर में भंग।
  3. समाधान स्पष्ट हो जाता है जब तक एक पानी के स्नान में 65 डिग्री सेल्सियस के लिए Tamoxifen समाधान गर्म। उपयोग करें जब तक स्नान में समाधान रखें।
  4. संज्ञाहरण के दौरान निर्जलीकरण को रोकने के लिए इलाज contralateral आंख से आंख मरहम लागू करें। यह पर्याप्त चोर आ गया है की पहुंच से बाहर है, जब तक एक जानवर को मत छोड़ोस्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए sciousness। पूरी तरह से ठीक है, जब तक अन्य चूहों की कंपनी के लिए लोग घायल हो गए आंख से गुजरा था कि चूहों वापस नहीं है। चूहे बारीकी से चोट के बाद निगरानी की जानी चाहिए। वे अपने शरीर के वजन के 10% से अधिक खोने के मामले में, कार्निया कटाव, या बेचैनी से ग्रस्त हैं, प्रयोग बंद कर दिया जाना चाहिए। दोहराएँ दर्दनाशक दवाओं प्रशासन पूरे प्रयोग के दौरान हर 24 घंटा।
  5. इसे से जुड़े एक सुई के बिना, एक बाँझ सिरिंज का उपयोग करना; topically प्रत्येक माउस की एक आंख की पूरी कॉर्निया की सतह पर 200 μl Tamoxifen समाधान लागू होते हैं।
    नोट: तरल समाधान आरटी पर आंख की सतह पर जल्दी solidifies। कार्निया चोट का असर घाव की गंभीरता पर निर्भर करता है। Tamoxifen / DMSO के समाधान में से एक आवेदन के बाद कोई प्रतिकूल प्रभाव चूहों में मनाया जाता है। बार-बार आवेदन पत्र के मामले में कार्निया अस्पष्टता मनाया जा सकता है।
  6. संप्रदाय देखना (ऊतक तैयार करने और इमेजिंग के साथ जारी रखेंआयनों 5 और प्रासंगिक समय बिंदुओं पर 6)। एक सप्ताह के बाद लोग घायल हो गए (चित्रा 2 और 24) (चरण 5.1 में विस्तृत रूप में) यहाँ दिखाए गए परिणामों, चूहों बलिदान के लिए।

Representative Results

हाल ही में, हम स्टेम कोशिकाओं और कार्निया उपकला 24 के पूर्वज कोशिकाओं की उत्पत्ति, अस्तित्व और प्रवास की पहचान करने के उद्देश्य से। सबूत जमते कार्निया उपकला limbal आला, कार्निया परिधि में एक अंगूठी के आकार के क्षेत्र में विशेष रूप से स्थित स्टेम कोशिकाओं से पुनर्जीवित कर रहा है कि हठधर्मिता का समर्थन करता है। इस सिद्धांत में इन विट्रो द्वारा और इन विवो डेटा में, और सफल अग्रणी limbal स्टेम सेल थेरेपी 27-29 के लिए आधार प्रदान की है कि नैदानिक ​​सबूत द्वारा समर्थित है। हालांकि, इस विषय अत्यधिक होने के कारण माउस किनारी कार्निया नवीकरण 30 में भाग नहीं करता है कि सुझाव दिया कि limbal ग्राफ्टिंग प्रयोगों पर आधारित एक अध्ययन के हाल के वर्षों में बहस बने रहे। इस दिलचस्प परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, R26R-कंफ़ेद्दी चूहों प्रदर्शन किया गया का उपयोग कर वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए 120 दिनों 24 के लिए स्थिर राज्य की शर्तों के तहत limbal और कार्निया उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के भाग्य का पालन करने के लिए।आंखें enucleated थे और फ्लैट माउंट कॉर्निया 10 और 120 दिनों Tamoxifen के बाद इंजेक्शन वर्णक्रमीय confocal लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। जैसी कि उम्मीद थी कार्निया केंद्र की ओर किनारी से करता हूं कि 1-4 महीने बाद (चित्रा 2 बी और 24), लम्बी धारियाँ धीरे-धीरे विकसित करते हुए, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के छोटे छिटपुट समूहों, 10 दिनों के इंजेक्शन के बाद सतह नेत्र भर में मनाया गया। यह परिणाम कॉर्निया कॉर्निया के केंद्र की ओर किनारी से विस्थापित कि कोशिकाओं से पुनर्जीवित कर रहा है कि पता चलता है। इसके बाद, लोग घायल हो गए शर्तों के तहत कार्निया उत्थान जांच की गई थी। कुशल सेल ट्रैकिंग उत्प्रेरण जबकि शर्तों लोग घायल हो गए तहत K14 पॉजिटिव limbal / कार्निया कोशिकाओं के भाग्य का परीक्षण करने के लिए, हम सामयिक आवेदन पर कार्निया चोट के कारण जो डाइमिथाइल sulfoxide टेमोक्सीफेन (DMSO), भंग कर दिया। एक भी सामयिक आवेदन (चित्रा -2), मो लागू किया गया था, तो इस तरह से हम हल्के लोग घायल हो गए प्रेरित करने में कामयाब अतिरिक्त DMSO अकेले उपचार Tamoxifen प्रेरण या DMSO अकेले topically Tamoxifen प्रेरण करने से पहले 2 अनुक्रमिक दिनों में लागू किया गया था जब गंभीर घाव से पहले दिन में लागू किया गया था कि अगर लोग घायल हो गए derate।

धीरे-धीरे विकसित की है और स्थिर राज्य की शर्तों के तहत 4 महीने के भीतर कार्निया केंद्र पहुंच गया है कि पतली limbal धारियों के विपरीत, चोट के बाद सेल प्रवास तेजी से गया था। उल्लेखनीय है, लंबे और घने limbal धारियों पहले से ही 7 दिनों के भीतर इन परिस्थितियों में विकसित किया गया। दिलचस्प है, रंग विविधता कभी कभी कम से कम (चित्रा 2 डी) था। हमारे हाथ में, कभी-कभी, मुख्य रूप से लाल कोशिकाओं विशिष्ट fluorophores के प्रति पक्षपाती जा सकता है कि रंग विविधता का संकेत है, पूरे कॉर्निया में पहचान की गई। Br1.0L 31 में और Br2.1 21 में पहले से सूचना दी, क्योंकि यह अवांछित पूर्वाग्रह खुराक प्रतिक्रिया परीक्षण से calibrated किया जा सकता है।

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R26R-कंफ़ेद्दी निर्माण के चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्रण। (ए) R26R-कंफ़ेद्दी निर्माण उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के लिए एक सीएजी प्रमोटर शामिल है, एक loxP (काला त्रिकोण) नव आर -roadblock और Rosa26 ठिकाना 16,21 पर Brainbow2.1 कैसेट -flanked। Brainbow2.1 कैसेट दो सिर से पूंछ loxP-घिरे dimers भी शामिल है। एक डिमर परमाणु स्थानीय हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और एक रिवर्स उन्मुख साइटोप्लास्मिक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (- pfy उल्टा उन्मुखीकरण नामित किया गया है YFP,) के होते हैं। 16 - दूसरे डिमर साइटोप्लास्मिक आरएफपी और एक रिवर्स उन्मुख झिल्ली सीमित सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पीएफसी उल्टा उन्मुखीकरण नामित किया गया है सीएफपी,) शामिल हैं। (बी - ई) Cre पर Recombinase सक्रियण पर, अलग अलग छांटना और उलटा घटनाओं को हो सकती है; संभावित परिणामों exemplifi हैंबी में एड - ई। रचनात्मक गतिविधि इस प्रकार जीन हटाने और / या व्युत्क्रमों और चार फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक यादृच्छिक अभिव्यक्ति में परिणाम के लिए अग्रणी कैसेट की स्टोकेस्टिक पुनर्व्यवस्था लाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। Homeostasis और चोट के तहत ट्रेसिंग कॉर्नियल वंश। R26R-कंफ़ेद्दी / प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप K14-CRE चूहों 4 मिलीग्राम tamoxifen के साथ इंजेक्शन थे। (- बी ए) अंक पोस्ट संकेत समय में प्रेरण कॉर्निया imaged थे चपटा। Cre प्रेरण के साथ युग्मित कॉर्नियल लोग घायल हो गए DMSO में भंग Tamoxifen के सामयिक आवेदन के द्वारा प्राप्त किया गया था (सी - डी)। मूसा के चित्र प्राप्तवर्णक्रमीय confocal माइक्रोस्कोपी खपरैल का छत मल्टीचैनल द्वारा दिखाए जाते हैं (एक - डी)। Homeostasis में, धीमी गति से पलायन कोशिकाओं के रेडियल limbal धारियों किनारी और कार्निया केंद्र के बीच बढ़ाया। इन पट्टियों 4-5 महीने (बी) के भीतर कार्निया केंद्र तक पहुंच गया, धीरे-धीरे विकसित की है। कार्निया कोशिकाओं के समूहों के रूप में अच्छी तरह से (सफेद तीर, बी) स्पष्ट थे। इसके विपरीत, बड़े limbal धारियाँ लोग घायल हो गए शर्तों (सी) के तहत एक ही सप्ताह के भीतर दिखाई दिया। लाल कोशिकाओं (डी) की ओर रंग विविधता के पूर्वाग्रह के लिए एक उदाहरण है। limbal-कार्निया सीमा एक धराशायी लाइन द्वारा एनोटेट है। स्केल बार 500 माइक्रोन है। लघुरूप: सीएफपी, सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; GFP, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएफपी, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; YFP, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन। यह आंकड़ा 24 से संशोधित किया गया है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

Discussion

वंश अनुरेखण प्रयोगों कई वर्षों के लिए आयोजित किया गया है। हाल ही में तकनीकी सुधार और कंफ़ेद्दी माउस उपभेदों के उद्भव के अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोल दिया। आज, शोधकर्ताओं ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक विशेष रचनात्मक लाइनों, पीटा चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों की एक बड़ी संख्या से फायदा हो सकता है। यह मजबूत और विश्वसनीय डेटा प्रदान करते हुए, श्रमसाध्य अभ्यास से परहेज, बुनियादी विशेषज्ञता के साथ वैज्ञानिक सवालों के समाधान के लिए बहुमुखी प्रायोगिक प्रणाली डिजाइन करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है।

R26R-कंफ़ेद्दी चूहों कुशल ट्रैकिंग और एक जीवित जीव में कोशिकाओं की प्रकृति और व्यवहार के अध्ययन के लिए एक सुंदर उपकरण हैं। प्रणाली स्थापित करने के लिए आसान है और यह, embryogenesis दौरान एकल कक्षों के गैर इनवेसिव वंश ट्रेसिंग की अनुमति देता है स्टेम सेल पुनर्जनन समस्थिति के तहत, या इस तरह के चोट, सूजन और कैंसर के रूप में विभिन्न परिस्थितियों में। प्राप्य डेटा एक मजबूत descript प्रदान करता हैएक quantifiable तरीके से लक्षित कोशिकाओं, प्रतिरूप सेल विस्तार और सेल प्रवास के अस्तित्व के आयन। एक महत्वपूर्ण कदम मज़बूती से एक सटीक विकास के चरण में कुशल ऊतक विशिष्ट लेबलिंग अनुमति कर सकते हैं कि उचित आनुवंशिक माउस तनाव का चयन करने के लिए किया जाएगा। इस प्रणाली की एक सीमा एक जीवित जीव की निगरानी के लिए, ऊतक सुलभ और पारदर्शी होना चाहिए। इसी तरह, एक जीवित जानवरों के भीतर एक मोटी ऊतक पर नज़र रखने के लिए केवल दो photon या बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मदद की जा सकती है। हालांकि, सेल ट्रैकिंग पोस्टमार्टम ऊतक वर्गों पर संभव है और यह स्पष्टता विधि 32,33 से पारदर्शी बनने के लिए बदल दिया गया है के बाद शायद बरकरार ऊतक का अध्ययन किया जा सकता है। माना जा करने के एक और सीमा एक ही fluorophore कि एक्सप्रेस सन्निकट कक्षों की संभावना एक ही प्रतिरूप वंश के हैं, हालांकि, यह है कि वे बेतरतीब ढंग से एक ही फ्लोरोसेंट जीन व्यक्त की है कि स्वतंत्र सेल मूल से प्राप्त किया जा सकता है कि यह भी संभव है कि है। इस possibiliकई रंग संयोजन की अनुमति देने के लिए कई बीआर एलिलों का उपयोग करते समय Ty बहुत संभावना नहीं बन जाता है।

भविष्य में, जीन और स्वास्थ्य और विकृति में उनकी म्यूटेशन के अध्ययन की अनुमति होगी उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों (यानी, पीटा, Knockin और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) के साथ कंफ़ेद्दी प्रणाली के संयोजन। इसी तरह, वंश सेल भाग्य का निर्णय में संकेत दे रास्ते की भागीदारी पर नए अंतर्दृष्टि लाएगा अलग प्रणाली अव्यवस्थाएं (यानी, सेल आला विनाश, लेजर मध्यस्थता सेल पृथक, दवा इलाज स्टेम) के तहत ट्रेसिंग। अंत में, फ्लोरोसेंट और bioluminescence लेबलिंग का मिश्रित उपयोग, धार माइक्रोस्कोपी रास्ते संकेतन और काटने की आनुवंशिक संवाददाताओं से शोधकर्ताओं ने अपने अपने देशी वातावरण में आसपास का जवाब कैसे एकल कक्षों जानने के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करेगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette Jackson strain #013731
K14-CreERT mice Jackson strain #005107
tamoxifen Sigma T5648
isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care
Carprieve 30 b.wt
DMSO Sigma D2650
DAPI Sigma D9542 used at concentration of 4 µg/ml
Immu Mount Thermo Scientific 9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage Zeiss The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software Zeiss
Duratears-eye ointment Alcon

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