Developmental Biology
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लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी ट्रेसिंग
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Summary January 12th, 2020
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हम लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Transcript
इस प्रोटोकॉल में वर्णित ट्रेसिंग तकनीक हमें न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने और ड्रोसोफिला के मोटर न्यूरॉन सिस्टम में कनेक्टिविटी को स्नैप करने में मदद करती है। लिपोफिलिक डाई तेजी से एक अत्यंत उच्च घनत्व के साथ सेलुलर झिल्ली के हर हिस्से को फैलाना कर सकते हैं। यही कारण है कि हमारा प्रोटोकॉल एक लेबल न्यूरॉन की संरचनाओं को खोजने के लिए कुशलतापूर्वक हल करता है।
यदि एक एक्सॉन टर्मिनल एक इंजेक्शन माइक्रोपिपेट के साथ सुलभ है, तो इस तकनीक को मक्खियों के लार्वा और वयस्क चरणों में या अन्य जीवों में किसी भी न्यूरॉन पर लागू किया जा सकता है। यदि आपके पास नमूने पर ऑपरेशन को सटीक रूप से विच्छेदन या उपयोग करने का कोई अनुभव नहीं है, तो चुनौतीपूर्ण हो सकता है। भ्रूण की शारीरिक रचना को समझना, विच्छेदन या एक dinjection बाहर ले जाने के लिए उपकरणों के उचित भागने के लिए मार्गदर्शन के साथ मदद मिलेगी ।
शुरू करने के लिए, तैयार करने और सभी भ्रूण संग्रह सामग्री लेआउट। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को तोड़कर निस्पंदन उपकरण तैयार करें, और टोपी में एक छेद खोलें। फिर ट्यूब और टोपी के बीच में 100 माइक्रोमीटर छिद्रों के साथ एक जाल फिल्टर सेट करें।
डाई इंजेक्शन माइक्रोपिपेट और विच्छेदन सुई को एक ही केशिका टयूबिंग से 1.2 मिलीमीटर के आंतरिक व्यास के साथ तैयार करें। लंबाई में लगभग 0.4 सेंटीमीटर के टेपर के साथ एक तेज सुई बनाने के लिए 170 वोल्ट अधिकतम उत्पादन से 7% पर माइक्रोपिपेट, पुलर के साथ टयूबिंग खींचें। डाई इंजेक्शन माइक्रोपिपेट तैयार करने के लिए ग्राइंडर को वेटिंग एजेंट के साथ भिगो दें और सुई को 25 से 30 डिग्री पर माइक्रोपिपेट क्लैंप पर रखें।
फिर बेवेलिंग सतह के केंद्र से दो तिहाई त्रिज्या पर टिप कम करें। सुई पीस जबकि ट्यूबिंग के साथ एक सिरिंज हवा में हवा धक्का । एक ठीक टिप स्थायी मार्कर के साथ माइक्रोपिपेट चिह्नित करने के लिए beveling के बाद टिप पर खोलने की स्थिति का संकेत है क्योंकि यह एक कोण पर गठन किया है कि संकीर्ण खोलने का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।
मक्खियों को कमरे के तापमान पर रात भर अंडे डालने की अनुमति दें और सुबह अंडे के साथ पाइप एकत्र करें। भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए, पांच मिनट के लिए 50% ब्लीच के साथ प्लेट पर अंडे को डिक्लोरिनेट करें। एक बार क्लोरियंस साफ हो जाने के बाद, भ्रूण को अलग करने के लिए फिल्ट्रेशन उपकरण या सेल छलनी के माध्यम से प्लेट की सामग्री डालें।
प्लेट पर छोड़े गए ब्लीच को पतला करने के लिए पानी की एक निचोड़ बोतल का उपयोग करें और मिश्रण को फिल्टर में डिकंट करके जितना संभव हो उतने भ्रूण इकट्ठा करें। भ्रूण को तीन से चार बार पानी से धोएं जब तक ब्लीच की गंध नष्ट न हो जाए। उपकरण से फिल्टर निकालें और उन्हें पानी के साथ एक और साफ प्लेट पर धो लें।
फिर नई थाली है कि भ्रूण पर हैं से पानी को डिकेंट। अंडे बिछाने के बाद 15 घंटे में पांच से 10 भ्रूण का चयन करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और उन्हें पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ के साथ डबल तरफा टेप पर रखें। भ्रूण को क्षारीयता से बचाने के लिए विच्छेदन पूल में कीट घंटी नमकीन जोड़ें।
भ्रूण के आंतरिक ऊतकों को नुकसान न पहुंचाने के लिए, टेप से बिचौलिए झिल्ली से भ्रूण को बाहर खींचने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे एक ग्लास सुई का उपयोग करें। तो यह अपने पीछे से पूर्वकाल के अंत तक सतह पर एक ही भ्रूण के मध्य रेखा के माध्यम से काट दिया । केंद्र से एपिथेलियल ऊतकों को फ्लिप करें और ग्लास स्लाइड की सतह पर एपिडर्मल एज संलग्न करें।
पृष्ठीय देशांतर श्वासनली चड्डी के साथ-साथ किसी भी शेष हिम्मत को हटाने के लिए हवा को एस्पिरेट या उड़ाने के लिए लगभग 300 माइक्रोमीटर के टिप खोलने के साथ एक ट्यूब कनेक्टेड सुई का उपयोग करें। एक कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए भ्रूण को ठीक करने के लिए 4% पीएफए और पीबीएस का उपयोग करें । फिर उन्हें पीबीएस से तीन बार धोएं।
कक्षीय शेखर पर एक घंटे के लिए Cyanine3 डाई और PBS के २०० माइक्रोलीटर के साथ संयुग्मित एंटी सहिजन पेरोक्सिडेस एंटीबॉडी के एक माइक्रोलीटर के साथ भ्रूण दाग । और पीबीएस में वॉश दोहराएं। इंजेक्शन माइक्रोपिपेट को भरने के लिए, इसे केशिका धारक में रखें।
अगले स्टेज पर डाई स्लाइड रखें और स्लाइड पर इसे पोजीशन करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का इस्तेमाल करें । फिर डाई पर माइक्रोपिपेट रखने के लिए मंच को समायोजित करें। इंजेक्शन दबाव को 200 और 500 हेक्टोपॉस्कल के बीच सेट करके माइक्रोपिपेट में डाई को इकट्ठा करें, इंजेक्शन का समय 0.1 और 0.5 सेकंड के बीच और मुआवजे का दबाव पांच मिनट के लिए शून्य हो गया।
एक बार डाई एकत्र हो जाने के बाद डाई स्लाइड को हटा दें और नमूना माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। फिर 30 से 60 हेक्टोपॉस्कल की सीमा तक मुआवजे के दबाव को बढ़ाएं और माइक्रोपिपेट को नमूने में कम करें। भ्रूण का पता लगाने और भ्रूण के साथ माइक्रोपिपेट संरेखित करने के लिए 10 बार उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
ऑब्जेक्टिव लेंस को 40 बार पानी के विसर्जन में बदलें। और लेंस को पीबीएस में जलमग्न कर देते हैं। एंटी-एचआरपी Cy3 द्वारा चिह्नित न्यूरोनल आकृति विज्ञान की जांच करने और इंजेक्शन साइट निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
जब भ्रूण ध्यान में है माइक्रोपिपेट की स्थिति को बदलने के लिए ब्याज के अक्षतंप की नोक के साथ कोमल संपर्क बनाते हैं । फिर डाई ड्रॉपलेट देखने के लिए इंजेक्शन के दौरान ब्राइट फील्ड माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल करें। डीडीआई या डायो के साथ एसीएस या आरपी3 के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर दाहिने पेट के हेमीसेगमेंट में डाई को छोड़ दें।
डाई को छोड़ने और माइक्रोपिपेट को हटाने के लिए हाथ नियंत्रण का उपयोग करें। फिर अगले इंजेक्शन साइट पर जाएं। इमेजिंग से पहले एक कक्षीय शेखर पर कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए नमूना इनक्यूबेट ।
ठीक संदंश का उपयोग करके, ग्लास स्लाइड से टेप निकालें। नमूना माउंट करने के लिए, चार कोनों पर वैक्यूम तेल की एक छोटी राशि के साथ एक कवर पर्ची तैयार करें। ध्यान से इसे नमूने पर रखा, हवा के बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
उद्देश्य लेंस और स्लाइड के बीच काम की दूरी की अनुमति के लिए नमूने से अंतरिक्ष को समायोजित करने के लिए कवर स्लिप नीचे पुश करें। टास्क वाइप्स के साथ किसी भी अतिरिक्त पीबीएस निकालें। नेल पॉलिश के साथ कवर स्लिप के किनारों को पूरी तरह से सील करें।
इमेजेज सॉफ्टवेयर के साथ 10 बार और 100 गुना आवर्धन एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ और छवियों को संसाधित करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एसीएस मोटर न्यूरॉन इनरवेटिंग मांसपेशी एक और आरपी3 मोटर न्यूरॉन इनरवेटिंग मांसपेशियों को छह और सात लेबल करने के लिए किया गया था। एसीसी और RP3 मोटर न्यूरॉन्स से Dendritic शाखाओं व्यापक ओवरलैप दिखाते हैं ।
दोनों न्यूरॉन्स द्विध्रुवी हैं, जो डेंड्राइट्स की दो अलग-अलग आबादी स्थापित करते हैं। इस विधि की मात्रात्मक क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, डेंड्राइट युक्तियों की कुल संख्या जंगली प्रकार और Dscam1 म्यूटेंट में गिना गया था। एसीएस के इप्सिलेटरल डेंड्राइट्स को जंगली प्रकार के लिए दिखाया गया है, लेकिन Dscam1 म्यूटेंट के लिए कुछ ipsilateral dendrites मनाया गया।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि डाई ड्रॉपलेट का आकार महत्वपूर्ण है, जो लगभग 10 से 20 माइक्रोमीटर है। डबल साइड टेप पर आकार का परीक्षण करें और फिर इसे इंजेक्शन साइट पर लागू करें। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, हम प्लाज्मा झिल्ली के सुपर रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए डीआईडी जांच की फोटो स्विचेबल संपत्ति का लाभ उठा सकते हैं।
इस तरह हम न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर सिनैप्टिक झिल्ली के अल्ट्रा स्ट्रक्चरल लक्षण वर्णन का अध्ययन कर सकते हैं। हमने क्लिक किया। हमने उत्परिवर्ती तनाव में एसीएस डेंड्राइट्स का फेनोटाइपिक विश्लेषण किया, और पता चलता है कि एक Dscam1-डॉक-पाक इंजेक्शन एसीएस में डेंड्राइट आउटग्रोथ की साइट को परिभाषित करता है।
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