Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

1Institute of Medical Virology, University of Zurich
Published 11/04/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De vermelding van influenza A virus (IAV) is een meerstaps proces dat begint met de binding van het virus aan receptoren op het plasmamembraan van doelcellen 1. De receptor voor IAV is siaalzuur dat aanwezig is op een grote verscheidenheid aan glycoproteïnen en glycolipiden is. Het hemagglutinine (HA) -eiwit van IAV die in de virale omhulling bindt aan siaalzuur en daardoor medieert hechting van het virale deeltjes naar de plasmamembraan van doelwitcellen 2. Het virus komt in de cellen via clathrine-gemedieerde endocytose, maar ook alternatieve ingang trajecten, zoals macropinocytose, beschreven 06/03. De interactie tussen HA en siaalzuur lijkt voldoende te bemiddelen zowel bevestiging en triggering internalisatie van virale deeltjes 7 zijn. Toch hebben alternatieve ingang receptoren voorgesteld en hun rol in IAV binnenkomst worden momenteel onderzocht 1,8,9.

Curteel wordt gestreefd naar gastheerfactoren die betrokken zijn in de virale levenscyclus met als doel het ontwikkelen dringend nieuwe antivirale therapieën 10-12 identificeren. Virusingang zou een gunstige stap voor het richten IAV groei om virale infectie te blokkeren in zijn vroegste punt. Meten verschillende stadia van IAV binnenkomst experimenteel is uitdagend gewoonlijk grote hoeveelheden virus moeten binnenkomende virus op te sporen. Bovendien, het detectiebereik veranderingen in virusingang alleen lineair door het ontbreken van virale replicatie. Dit onderstreept de behoefte aan assays met hoge gevoeligheid.

De assay hier geïntroduceerde maakt detectie mogelijk van bijgevoegde virus op het celoppervlak en detectie van geïnternaliseerde virus in verhouding tot de totale hoeveelheid van cel-geassocieerd virus. Het gebruik van gebiotinyleerde wildtype virus maakt handig meting door middel van kleuring met STV-Cy3 en uitlezing door flowcytometrie. Gebiotinyleerde virus is koud-gebonden aan cels beslaglegging laten maar internalisatie van virale deeltjes te voorkomen. Cellen kunnen worden gefixeerd, permeabel en gekleurd met STV-Cy3 bijgevoegde virus te meten. Het signaal van extracellulaire, verbonden virions kunnen worden ingetrokken wanneer een blokkeringsstap wordt aangebracht voordat fixatie waarin de cellen worden geïncubeerd met niet-gemerkt streptavidine (STV). In een volgende stap, na binding van gebiotinyleerd IAV, temperatuur verschoven naar 37 ° C en internalisatie van virale deeltjes mag plaatsvinden. Geïnternaliseerde deeltjes worden beschermd tegen de binding van STV waardoor de discriminatie tussen extra- en intracellulaire virussen.

Per experimentele conditie, zijn vier monsters vereist: '0 min': Het eerste monster gelabeld "0 min", om koud virus gebonden aan het celoppervlak te meten. "0 min + STV De tweede monster gelabeld" 0 min + STV ", geeft de basislijn signaalintensiteit van het experiment. Bijgevoegde virus wordt geblokkeerd with STV en het signaal na kleuring met STV-Cy3 moet veel lager zijn in vergelijking met het "0 min" sample. '30 Min ': Het derde monster '30 min' bevat bevestigd en geïnternaliseerd virus vanwege de temperatuurverandering tot 37 ° C gedurende 30 min. '30 Min + STV ': De vierde monster, '30 min + STV' maatregelen de intracellulaire fractie van virussen. De STV blokkeringsstap wordt toegepast na de 30 min incubatieperiode. Hierdoor worden virale deeltjes aan het celoppervlak gebonden STV waarbij alleen geïnternaliseerd virussen vindt kleuring met STV-Cy3. De relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd kan worden berekend als de verhouding van geïnternaliseerde virus (gemeten in de '30 min + STV "sample) gedeeld door de totale hoeveelheid virus (beschreven door '30 min 'sample).

Als controles raden we aan mock-geïnfecteerde cellen bevatten. Het signaal volgende STV-Cy3 kleuring van mock-geïnfecteerde cellen geeft de achtergrondals gevolg van de kleuringsprotocol. Hendel om IAV bevestiging is de voorbehandeling van cellen met bacteriële neuraminidase (NA). NA splitst siaalzuur van cellulaire glycoproteïnen, waardoor het verwijderen hechting receptoren van het celoppervlak. Natriumazide (SA) is een krachtige metabole remmer en blokkeert daarbij endocytose 13. Cellen behandeld met natriumazide moet positief voor virus bindend, maar negatief voor internalisatie zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op voor de start: Gebruik laminaire stroming kap en passende biocontainment bij het werken met levend virus. Hier beschrijven we de groei omstandigheden die geschikt zijn om de cultuur influenzavirusstam A / WSN / 33. Veelvoud van infectie (MOI) en incubatietijden kunnen variëren afhankelijk van virusstam gebruikt.

1. Bereiding van gebiotinyleerd A / WSN / 33 virus

  1. Seed Madin-Darby canine kindey (MDCK) cellen in een T175 cm2 kolf gebruikt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (Pen / Strep). Kweekcellen bij 37 ° C tot ongeveer 70% confluentie bereikt.
  2. Vóór infectie Verwijder medium en wassen cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH7.0-7.3) door toevoeging van een voldoende grote hoeveelheid om de cel monolaag bedekken.
  3. Verwijder PBS en cellen te infecteren met A / WSN / 33 met een MOI van 10 -4. Verdun virus in PBS gesupplementeerd met 0,02 mg Mg2 +, 0,01 mg Ca 2+ </ sup>, 0,3% runderserumalbumine (BSA) en 1% Pen / Strep (infectie-PBS). Gebruik een inoculum van 4 ml voor T175 cm2 kolf.
  4. Incubeer de cellen 1 uur bij 37 ° C. Inoculum verwijderd door aspiratie en pipetteer 10 ml DMEM aangevuld met 0,3% BSA, 20 mM HEPES en 1% Pen / Strep in de kolf.
  5. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende ongeveer 3 dagen tot cytopathisch effect (CPE) zichtbaar is, en oogsten supernatant. CPE kan worden herkend als afronden van cellen gevolgd door onthechting en dood van cellen 14.
  6. Spin supernatant bij 450 xg gedurende 5 min celresten te verwijderen. Transfer supernatant in een nieuwe Falcon-buis en herhaal deze stap nog een keer. Gooi de pellets.
  7. Transfer supernatanten in ultracentrifuge buizen en onderlaag supernatanten met 5 ml 30% sucrose NTE verdund in buffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Evenwicht buizen voor ultracentrifugeren en vul met PBS om een ​​eind volume van 30 ml te bereiken. Spin Supernatants bij 112.398 xg (overeenkomend met 25.000 rpm gedurende een SW28 rotor) gedurende 90 min in een ultracentrifuge.
  8. Verwijder voorzichtig supernatant door pipetteren en genieten viruspellet overnacht bij 4 ° C in 250 pi PBS. Resuspendeer pellet door en neer te pipetteren. Meet eiwitgehalte van gezuiverd virus door Bradford assay 15.
  9. Gebruik een biotinylering kit genereren gebiotinyleerd A / WSN / 33. Volg de instructies van de fabrikant.
  10. Kortom, voeg de juiste hoeveelheid biotine aan het gezuiverde virus en incubeer gedurende 2 uur op ijs. Transfer virus een ultracentrifuge buis en vul de buis met PBS om een ​​eind volume van 30 ml te bereiken. Spin virus bij 112.389 g gedurende 90 min in een ultracentrifuge. Verwijder supernatant door pipetteren en voeg 250 ul PBS. Genieten pellet gedurende de nacht bij 4 ° C. Aliquot en bewaar het gebiotinyleerde virus opgeslagen bij -80 ° C waar het stabiel voor minstens 24 maanden.
    NB: Het kan nuttig zijn om de titer van de gebiotinyleerde p bepalenreparatie van IAV door standaard plaque assay. Er moet echter worden opgemerkt dat het volgende protocol enige gebiotinyleerde virusdeeltjes meet. Resterende gebiotinyleerde deeltjes door onvolledige biotinylering zal bijdragen tot de infectieuze titer door plaque assay, maar niet het signaal gemeten in de vast- / internalisatie assay.

2. Bepaal de benodigde hoeveelheid Gebiotinyleerde Virus

OPMERKING: Voor het vast- / internalisering test wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de hoeveelheid gebiotinyleerd virus nodig om alle cellen van een monster besmetten bepalen.

  1. Cultuur en trypsinize A549 cellen volgens instructies van de fabrikant. Tel de cellen met behulp van een cel kamer. Pipetteer 200.000 A549 cellen in FACS buisjes deepwell. Spin 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet met 200 pi PBS. Koele cellen neer op ijs gedurende 10 minuten.
  2. Bereid 5-voudige seriële verdunningen van de biotinylated virus voorraad in infectie-PBS.
  3. Spin buizen die de cellen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet met 100 pi-virus bevatten infectie-PBS. Zoals mock controle gebruik infectie-PBS zonder gebiotinyleerd virus. Incubeer buizen op ijs gedurende 1 uur.
  4. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS. Herhaal deze stap nog een keer.
  5. Voor bevestiging, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 pl 3,7% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens wasstap in 2,4 beschreven).
  6. Voor permeabilisatie, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 pl PBS dat 0,5% Triton X-100. Incubeer gedurende 6 min bij RT. Herhaal vervolgens wasstap in 2,4 beschreven).
  7. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 pl 2% BSA verdund in PBS dat STV-Cy3. (Let op, de juiste concentratie van STV-Cy3 moet worden bepaald voordat het experiment te starten met een concentratie van 1:. 200 en test 2-voudige verdunningen tot 1:. 2400 In onze handen, een verdunning van 1: 1000 bewezen om optimaal.)
  8. Incubeer 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4, maar resuspendeer de pellet in 200 ul 2% BSA verdund in PBS.
  9. Analyseer de monsters met flowcytometrie 16. Poort op de Cy3-positieve populatie. Kies de laagste concentratie van gebiotinyleerd virus waardoor het maximum aantal Cy3-positieve cellen in de populatie A549.

3. Bepaal de benodigde hoeveelheid Streptavidine


Opmerking: De efficiëntie van het blokkeren van het signaal afkomstig van extracellulaire virus bepaalt het detectiebereik van de assay. Daarom is het belangrijk om de STV-Cy3 signaal zoveel mogelijk teniet. The benodigde hoeveelheid STV nodig is afhankelijk van de hoeveelheid van gebiotinyleerd virus voorraad gebruikt (bepaald in paragraaf 2).

  1. Volg de stappen 2,1-2,4, maar gebruik virus concentratie bepaald in punt 2.
  2. Bereid vijfvoudige seriële verdunningen van STV verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide.
  3. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV verdunning. Zoals mock controle gebruik PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide zonder STV. Incubeer buizen voor 30 min op ijs. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4.
  4. Volg de stappen 2,5-2,9. Voor de internalisatie assay kiezen voor de laagste concentratie STV resulteert in een sterke blok van de Cy3-signaal (in vergelijking met het monster waarin geen STV aanwezig was). Hiervoor kan het percentage CY3-positieve cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal gebruikt. Idealiter zou de Cy3 signaal STV-behandelde monsters zo dicht mogelijk bij het signaal van mock-geïnfecteerdcellen mogelijk.

4. Attachment / Internalizatie Assay


OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia te bereiden voor aanvang van de test. Voor de drie controlegroepen gepresenteerd in de resultaten sectie (mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase voorbehandeld cellen en natriumazide behandelde cellen) kleine wijzigingen in het protocol vereist.

  1. Bereid 16 buizen deepwell elk 200.000 A549 cellen. Naast de experimentele set bestaande uit 4 tubes, zijn er 3 controle omstandigheden, die elk 4 tubes: mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase (NA) -pretreated cellen en natrium-azide behandelde cellen. Elke groep bestaat uit 4 tubes bestempeld als "0 min", "0 min + STV ', '30 min', '30 min + STV '.
  2. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS.
  3. Spin buizen bij 4 ° C bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ul DMEM met 0,3% BSA, 20 mM HEPES en 1% penicilline-streptomycine (incubatiemedium). Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C.
    OPMERKING: Bij de neuraminidase control: Gebruik bacteriële neuraminidase (sialidase bijvoorbeeld van Vibrio cholera) bij een concentratie van 200 mU / ml verdund in incubatiemedium om de cellen te resuspenderen.
  4. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS. Herhaal deze stap nog een keer, daarna afkoelen buizen neer op ijs gedurende 10 minuten.
  5. Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 ul gebiotinyleerd virus (gebruik het virus concentratie bepaald in punt 2 verdund in infectie-PBS). Incubeer 1 uur op ijs. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4.
    LET OP: Voor de mock-geïnfecteerde controle: Gebruik infectie-PBS zonder virus. Voor natriumazide control: Gebruik virus infectie verdund in PBS, aangevuld met 0,1% natriumazide.
  6. Proverwerking van de monsters na de infectie op het ijs:
    1. Voor het "0 min" monsters, volgt stap 2,5 en bewaar monsters bij 4 ° C tot de andere monsters worden gefixeerd.
    2. Voor het "0 min + STV" monsters, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV (gebruik de concentratie bepaald in punt 3) verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide (tot internalisatie te voorkomen tijdens het hanteren van het monster). Incubeer 30 min op ijs. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C.
    3. Voor de '30 min 'samples, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 gl PBS met 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 ° C. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C.
      OPMERKING: Bij de natriumazide control: Gebruik PBS aangevuld met 2% BSA en 0,1% natriumazide voor 30 min incubatie bij 37 ° C.
    4. Voor de '30 min + STV monsters draaien buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 gl PBS met 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 ° C. Vervolgens, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV (gebruik de concentratie bepaald in punt 3) verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide (tot internalisatie te voorkomen tijdens het hanteren van het monster). Incubeer 30 min op ijs. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C.
      OPMERKING: Bij de natriumazide control: Gebruik PBS aangevuld met 2% BSA en 0,1% natriumazide voor 30 min incubatie bij 37 ° C.
  7. Volg de stappen 2,6-2,8 en monsters analyseren door flowcytometrie. Bepaal het percentage Cy3-positieve cellen in elk monster.
  8. Bereken het percentage bevestigd virus en de relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd.
    1. Om de hoeveelheid bijgevoegde virus te berekenen, gebruikt het percentage van Cy3-positive gated cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal. Ter vergelijking, ingesteld onbehandelde cellen tot 100% (figuur 4B).
      Opmerking: Het percentage bijgevoegde virus wordt beschreven door de "0 min" sample.
    2. Om de hoeveelheid virus geïnternaliseerd berekenen, neemt de verhouding van de "30 min + STV" monster tot "30 min" sample (Figuur 5B).
      Opmerking: Zoals hierboven vermeld, kan het percentage positieve Cy3 gated cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een cartoon beschrijving van de vier experimentele condities getoond in figuur 1 Resultaten van een representatief experiment zijn weergegeven in de figuren 2 -. 5. In de "0 min" sample, gebiotinyleerd virus koud gebonden aan cellen die kan worden gevisualiseerd door STV Cy3-kleuring gericht (figuren 1 en 2). Wanneer een blokkeringsstap (in de "0 min + STV" monster) wordt toegepast, kan virus op het celoppervlak niet meer worden gedetecteerd door STV Cy3-kleuring. Hierdoor wordt de signaalintensiteit in de "0 min + STV" sample sterk verminderd in vergelijking met de "0 min" sample (figuren 1 en 2). Bij verhoging van de temperatuur tot 37 ° C, bevestigd virus opgenomen in de cellen ("30 min" sample). Geïnternaliseerd virus is niet gevoelig voor blokkering met ongelabelde STV wat resulteert in een minder dramatische daling van de signaalintensiteit in het & #8220; 30 min + STV "monsters ten opzichte van de" 30 min "monster waarin geen STV blokkering werd toegepast (figuren 1 en 2).

Als controles wij werkzaam pseudo-infectie, NA behandeling en SA behandeling. Figuur 3 toont de percentages van Cy3-positieve cellen voor alle in hoofdstuk beschreven 4. Mock-geïnfecteerde cellen geven de achtergrond intensiteit van het signaal voor het experiment en fungeren als negatieve controle voor experimentele condities virus attachment (figuur 4). Een extra controle op virussen gehechtheid behandeling met bacterieel tot expressie NA. NA verwijdert siaalzuur, de receptor voor iav bevestiging, van glycoproteïnen op het celoppervlak en vermindert zodoende binding van het virus om cellen te 17 richten. Zoals getoond in figuur 4, de behandeling met NA schaft sterk IAV bevestiging met ongeveer 90% vergeleken met onbehandelde cellen. Met betrekking tot internalisatie, gebruikten we SA als controle. SA tr eatment onmiddellijk put cellulaire ATP-niveaus waardoor energieverbruikende processen zoals endocytose 13 remmen. Incubatie van cellen met SA tijdens en na infectie remde internalisatie van viruspartikels. De relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd (afgebeeld in figuur 5) werd verhoogd van ongeveer 10% tot 45% door incubatie bij 37 ° C gedurende 30 min in onbehandelde cellen. Na SA behandeling evenwel het percentage relatieve geïnternaliseerde virus was ongeveer 15% voor beide cellen gedurende 0 en 30 minuten bij 37 ° C. Dit geeft aan dat inderdaad SA vermindert de effectieve opname van virale deeltjes in cellen.

Figuur 1
Figuur 1. Principe van de test. Cartoon uitleggen van het beginsel van de vast- / internalisatie assay.= "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaat IAV bevestiging en internalisatie. (A) Histogram tonend de signaal intensiteit van de Cy3 signaal voor onbehandelde cellen. Worden de "0 min", "0 min + STV", "30 min" en "30 min + STV" sample. (B) Percentage van Cy3-positieve cellen van A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Vertegenwoordiger resultaat voor de bevestiging en de internalisering inbegrip van de controles. rong> Percentage van Cy3-positieve A549 cellen na aangewezen behandeling. Getoond worden mock-geïnfecteerd, onbehandeld, NA-behandelde en SA-behandelde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Remming van virus attachment door neuraminidase. (A) Histogram die de Cy3 signaalintensiteit van "0 min" samples. Weergegeven zijn onbehandelde cellen (blauw) en twee controlemonsters: mock-geïnfecteerde en NA-behandelde cellen (in rood en oranje, respectievelijk). (B) Percentage van Cy3-positieve cellen van A. Getoond worden mock, onbehandeld en NA-behandelde cellen van de "0 min" monster. De waarde voor onbehandelde cellen werd ingesteld op 100%.com / files / ftp_upload / 53.372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Remming van virus internalisatie door natriumazide (SA). (A) Histogram die de Cy3 signaalintensiteit van de "30 min" en "30 min + STV" monsters van onbehandeld (in rood en oranje, respectievelijk) en SA- behandeld (in blauw en groen, respectievelijk) cellen. (B) Percentage van relatieve geïnternaliseerd virus van onbehandelde en SA-behandelde cellen na de 0 en 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ons protocol beschrijft een gemakkelijke manier van meten virusbinding en internalisatie onder toepassing van stroomcytometrie. Het maakt gebruik van gemerkte wildtype virus dat nabootst nauwer virusinfecties vergelijking met het gebruik van virus-achtige deeltjes (VLP). Terwijl onze protocol is geoptimaliseerd voor bevestiging en internalisering van IAV meten kan gemakkelijk worden aangepast voor andere virussen. Bovendien, als flowcytometrie wordt gebruikt voor het uitlezen, co-kleuringen eenvoudig worden toegevoegd aan het protocol bijvoorbeeld om expressie te testen na knockdown of overexpressie van een eiwit van interesse. Dus de assay maakt wijziging van het protocol afhankelijk van de individuele behoeften. Van de nota, kan de test ook worden uitgevoerd voor een reeks van tijdstippen virus internalisatie kinetische gegevens meten over de tijd en het verkrijgen. Dit kan bijzonder belangrijk zijn wanneer de assay worden aangepast voor een ander virus met onbekende internalisatie kinetiek.

However, zij opgemerkt dat het raam van detectie relatief kleine verschillen in bijlage of internalisatie plaatsvinden op een lineaire schaal vanwege de afwezigheid van virale replicatie. Om het vertrouwen te vergroten en om ruis te raden we inbegrip van de controles te verminderen (bijvoorbeeld de knoppen hierboven beschreven) en verschillende herhalingen. Terwijl de getoonde resultaten tonen een representatief experiment vonden wij goede consistentie tussen verschillende experimenten: Bijvoorbeeld, voor bevestiging, het percentage Cy3-positieve cellen varieerde van 60-80%; voor geïnternaliseerde virus we verkregen waarden variërend tussen de 40-60%.

Vóór de test wordt gestart, is het belangrijk om de werkende concentraties van de gebruikte reagentia zoals STV STV-Cy3 en de hoeveelheid gebiotinyleerd virus titreren. Merk op dat de hoeveelheid reagentia en incubatietijden kunnen variëren afhankelijk van de cellijn en virusstam gebruikt. Om het venster van detectie, het percentage cellen positief voor virus attachmen maximaliserent moet zo hoog mogelijk in de "0 min en" 30 min "sample (afhankelijk van de hoeveelheid gebiotinyleerd gebruikte virus) en zo laag mogelijk in de" 0 min + STV "sample (afhankelijk van de hoeveelheid STV gebruikt ). Bovendien kan ruis worden verminderd door het houden van de cellen bij 4 ° C gedurende centrifugeren en wassen met ijskoude PBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Swiss National Science Foundation (31003A_135278) naar SSt. MOP is de begunstigde van een doctoraal subsidie ​​van het Fonds AXA Research. Wij danken Patricia Nigg voor hulp bij het ​​ontwerp van figuur 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats