Journal
/
/
Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie
JoVE Journal
Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Immunology and Infection
Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

6,624 Views

09:43 min

December 07, 2019

DOI:

09:43 min
December 07, 2019

5 Views
, , , , , , ,

Transcript

Automatically generated

Dit protocol is belangrijk omdat het kwantitatief phagocytose van gelabelde Aspergillus fumigateurs Conidia door menselijke leukocyten, samen met de gehechtheid van Conidia aan cellen, en gebrek aan interactie door stroom cytometrie meet. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het de snelle analyse van een groot aantal cellen vergemakkelijkt. Bovendien maakt het etiketteren van de celmarkers het mogelijk om de beoordeling van neutrofielen en monocyten binnen hetzelfde monster te scheiden.

In elke techniek kan worden gebruikt om andere klinische relevante schimmels zoals Mucorales te analyseren. In plaats daarvan rode bloedcellen kunnen worden gebruikt als fagocyten. Om deze procedure te beginnen, nat een papieren handdoek met ontsmettingsmiddel, en plaats het in een bio-veiligheidskast.

Plaats een plaat van volwassen Aspergillus fumigatus op de top van de papieren handdoek om oververdeling van vluchtige Conidia te voorkomen. Voeg 10 milliliter PBS met 0,01% wasmiddel op de top van de schimmel, en gebruik een Drigalski spatel om de vloeistof te verspreiden over de plaat, en wrijf de donkergekleurde Conidia. Breng de Conidia-ophanging over op een 50 milliliter via een zeef van 30 micrometer, die eventuele resterende mycelia zal verwijderen.

Voeg nog eens 10 milliliter PBS met wasmiddel aan de plaat, verdeel het met een spatel, en breng het naar dezelfde buis door de zeef. Bereid vervolgens een steriele oplossing van 0,1 molaire natriumcarbonaat, opgelost in PBS. En bereid een 0,1 millimolar oplossing van FITC poeder, in deze natriumcarbonaat oplossing.

Schors 100 miljoen of minder Conidia, in vijf milliliter van deze FITC-oplossing, in een buis van 15 milliliter. Incubeer in een rotator bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Om te zwellen naar Conidia, resuspend de FITC gelabeld Conidia in vijf milliliter rpmi medium, aangevuld met 10%FCS.

En incubeer in een rotator bij 37 graden Celsius voor de gewenste tijd. In een bio veiligheidskast, plaats vijf milliliter buffy jas in een 50 milliliter buis. Vul de buis met EL buffer, en omkeren drie keer.

Vijf tot acht minuten horizontaal uitbroeden, totdat het melkachtige uiterlijk van het mengsel helder wordt. Dan, centrifugeren op 300 keer G, en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in één milliliter EL-buffer door pipetteren.

Voeg nog eens 24 milliliter EL-buffer toe en keer de buis meerdere keren om. Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en stel de cellen opnieuw op in één milliliter RPMI-media, aangevuld met 10%FCS.

Om te beginnen, overdracht twee miljoen leukocyten en vier miljoen FITC-label Conidia in 1,5 milliliter RPMI aangevuld met 10% FCS, naar een 12-well cultuur plaat. Neem een controle van cellen alleen zonder Conidia, en een controle van cellen met niet-gelabelde Conidia. Incubeer de plaat in een bevochtigde koolstofdioxide incubator, op 37 graden Celsius voor de gewenste hoeveelheid tijd.

Wanneer de incubatie is voltooid, gebruik dan een cel schraper om de cellen te oogsten, en breng ze naar een 15 milliliter buis. Ten eerste, zet 100 microliter van elk monster en controles in een put van een 96-well V-bodem plaat. Voeg 150 microliter PBS toe met twee millimolar EDTA voor het wassen.

Voor kleurcompensatie, plaats een miljoen cellen zonder Conidia voor elke kleur, in andere putten van de plaat. Neem een put van cellen die ongetraind zal worden gelaten. Voeg 150 microliter PBS met twee millimolar EDTA toe aan elke put om te wassen.

Bedek vervolgens de plaat met een kleeffolie en verkroom op 300 keer G en vijf minuten op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de folie en gooi de supernatant door de plaat snel en krachtig om te keren slechts één keer over de gootsteen of een wegwerppapierhanddoek. Resuspend de cellen in 100 microliters van antilichaam mix, en meng goed door pipetting.

Voor kleurcompensaties, resuspend de respectieve cellen in 100 microliter pbs met twee millimolar EDTA, en voeg een enkel antilichaamtype aan elke put, op dezelfde hoeveelheid die wordt gebruikt in de antilichaam mix. Dek af met een kleeffolie en broed 20 minuten in het donker op kamertemperatuur. Verwijder hierna de folie en voeg 150 microliter PBS met twee millimolar EDTA toe aan elke put om te wassen.

Bedek de plaat opnieuw met kleeffolie. Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de folie en gooi de supernatant weg door de plaat snel en krachtig om te keren over een gootsteen of wegwerppapierhanddoek.

Resuspend de cellen in 200 microliter van PBS met 2 millimolar EDTA, en breng de cel suspensie van elke put, in een aparte ronde bodembuis. Start de stroom cytometer, en laat het opwarmen. Maak in de acquisitiesoftware een nieuw experiment en stel de nieuwe voorbeelden in en label deze.

Stel de parameters en de detectoren in voor de juiste fluoroforen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Geef in deze software de juiste puntplospunten weer zoals beschreven in het tekstprotocol. Met behulp van de cellen alleen monster, verwerven van een aantal cellen en zet de poort rond leukocyten.

Gebaseerd op de leukocyte poort, poort voor CD45 positieve cellen, te scheiden van Conidia in de SSC CD45 plot. In een stip plot, CD14, CD66b, gate neutrophils en monocyten afzonderlijk. Verander hierna van het alleenmonster van de cellen naar niet-gelabelde Conidia.

In een stip plot, anti-FITC, APC FITC, display neutrophils in set kwadranten voor anti-FITC, en FITC signalen. Open de statistiekenweergave en pas de kwadranten aan, zodat maximaal 1% van de cellen in de kwadranten Q1, Q2 en Q4 mogelijk is. Herhaal dit proces voor de monocyten poort. In de leukocyte poort, record alle monsters met ten minste 20.000 gebeurtenissen.

Phagocytose van FITC-gelabelde Conidia door menselijke neutrofielen kan worden gelezen uit de statistieken standpunten. In deze studie wordt een snelle stroomcytometrische methode gebruikt om de interactie van Aspergillus fumigateurs Conidia te meten met een groot aantal primaire menselijke leukocyten. Met behulp van de juiste antilichamen en de hier getoonde gatingstrategie wordt een algemene gating van menselijke leukocyten door FSC- en SSC-kenmerken gevolgd door een scheiding van leukocyten in de vrije Conidia, door de pan leukocyte marker, CD45.

Conidia kan bijna celgrootte bereiken op het moment van stroomcytometrie, vooral bij het gebruik van gezwollen Conidia, en of lange incubatietijden, en dus kan kopen ons analyse. Aangezien menselijke primaire monocyten en neutrofielen Conidia anders opnemen, maakt dit protocol de afzonderlijke analyse van deze celbevolking mogelijk, op basis van kleuring met de gevestigde cellijnmarkeringen, CD14 voor monocyten en CD66b voor neutrofielen. Het percentage menselijke primaire fagocyten dat Conidia internaliseert kan zeer variabel zijn bij bloeddonoren, maar hangt ook af van experimentele factoren, zoals incubatietijd en zwellingstoestand van Conidia.

Spore internalisatie kan worden gedetecteerd na 0,5 uur co-incubatie, en neemt toe met de tijd. Pre-gezwollen Conidia worden gemakkelijker opgenomen dan rustsporen, zelfs bij korte incubatietijden. Als Conidia zijn vastgesteld met formaldehyde, is fagocytose verminderd in vergelijking met native Conidia.

Na deze procedure kunnen supernatants van co-geïncubeerde immuuncellen en Conidia door Eliza worden verzameld en geanalyseerd om te controleren of de interactie een cytokine vrijlaat door de immuuncellen. Houd er rekening mee dat menselijk bloed mogelijk infectieziekten kan overbrengen. Dit werk vereist vaccinatie in hepatitis B, het gebruik van een bio-veiligheidskast, evenals het dragen van handschoenen op een lab jas.

Summary

Automatically generated

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.

Read Article