Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Immunology and Infection

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Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

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Abstract

Protocol

O protocolo descreve o isolamento de células linfóides a partir de material humano paciente e, por conseguinte, requer uma homologação ética. O trabalho realizado no presente estudo foi concedido pelo Ethical Review Board Uppsala (DNR. 2013/387).

1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de tonsilas palatinas Humanos

CUIDADO: Todo o material de origem humana sem tela como sangue, tecidos ou fluidos corporais deve ser considerado como material potencialmente infectado. Portanto, as práticas de biossegurança recomendadas para o tratamento dos tecidos humanos devem ser seguidas.

Nota: Para evitar a contaminação, todas as soluções e equipamentos de cultura celular deve ser estéril. Todos os buffers e soluções devem ser pré-arrefecido e mantido em gelo. Tecidos das amígdalas e células isoladas devem ser mantidos e manipulados no gelo.

  1. Obter amígdalas frescos de pacientes submetidos a amigdalectomia ou tonsilotomia (Figura 2). Mergulhar o tecido ClumPS para um tubo de centrífuga de 50 ml cheio com solução salina arrefecida com gelo estéril de Hanks equilibrada (HBSS), suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10 mM de glutamina, 0,05 mg / ml de gentamicina e 1% de mistura de antibióticos-antimicótico (penicilina, estreptomicina e Anfotericina B).
  2. Manter os tubos com as amostras de tecidos das amígdalas submersas em todos os momentos no gelo. Tente processar as amígdalas, logo que possível, eo mais tardar três horas após a remoção cirúrgica.
  3. Coloque a amígdala em um 60 milímetros placa de cultura de células de plástico no gelo e manter o tecido umedecido com HBSS. Remover coágulos sanguíneos visíveis, gordo e tecidos conjuntivos com uma pinça limpa da superfície da amígdala.
  4. Usar uma nova placa de 60 mm de cultura de células, contendo 5 ml de HBSS. Cortar o tecido tonsilar moita em fragmentos de 3-10 mm, usando um par de tesouras estéril e / ou um bisturi.
  5. Prepara-se uma nova placa de 60 mm de cultura de células contendo 10 ml de HBSS e colocar um 100 um filtro de células de plástico na solução de HBSS.
  6. Transfira os Dissfragmentos da amígdala ected para o filtro de células com pinça estéreis. Usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de plástico, sem problemas espremer os fragmentos de tecido através do filtro de células. Certifique-se de que os fragmentos da amígdala está totalmente imerso no HBSS.
  7. Descartar o filtro celular com os restos de tecido e transferir a suspensão de células resultante a 60 mm de placa de cultura celular num tubo de centrífuga de 50 ml de plástico. Deixe o tubo em gelo enquanto prosseguir com passos 1.8 e 1.9.
  8. No caso de grandes amígdalas, maior do que 2 cm de tamanho (Figura 2), apertar os fragmentos de amígdalas de dois filtros de células para evitar o entupimento da malha no filtro.
  9. Obter o volume final de 35 ml da suspensão de células.
    Nota: Neste passo é possível preparar a suspensão de células para criopreservação (ver secção 2).
  10. Adicionar 10 ml de solução de gradiente de densidade de Ficoll, tais como para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Delicadamente sobrepor as suspens celularesde iões (passo 1.9) na parte superior da solução de gradiente de densidade. Evitar a mistura da suspensão de células e a solução do gradiente de densidade.
    Nota: A solução de gradiente de densidade tem de ser aquecida até à temperatura ambiente.
  11. Centrifugar a suspensão celular num rotor basculante para fora a 700 xg durante 20 min à TA. Não ative a função de frenagem na centrífuga como frenagem rápida pode perturbar o gradiente. Além disso, use a função de aceleração mais baixa disponível na centrífuga.
    Nota: Após este passo de centrifugação, observar PTM como uma camada fofa branca na interface, e glóbulos vermelhos (RBC), os fibroblastos e os detritos celulares como o sedimento no fundo do tubo.
  12. Recolher cuidadosamente a camada de multinacionais, usando uma pipeta de 10 ml. Colocar a suspensão de células para um novo tubo de centrífuga de 50 ml.
  13. Adicionar 25 ml de PBS gelado à suspensão de células e girar o tubo a 300 xg durante 5 min num rotor basculante para fora a 4 ° C.
  14. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 mle repita pellet celular lavagem passo mais duas vezes. Finalmente ressuspender o pellet celular em 15 ml de PBS.
    Nota: Após o passo final de lavagem, é possível criopreservar da suspensão celular (ver secção 2).
  15. Aplicar 10 ul de suspensão de células para dentro da câmara de contagem de células hemocitómetro e contar o número de células sob um microscópio. Dispensar a quantidade apropriada de células (por exemplo, 2-3 x 10 7) num tubo de centrífuga de 15 ml para subsequente separação esférulas magnéticas. Manter esta alíquota em gelo até o passo 3.2.

2. criopreservação de células tonsilares

  1. Prepare meio de congelação (90% de FBS e 10% de DMSO) e mantê-lo em gelo. Para armazenamento a longo prazo manter os meios de congelação a -20 ° C.
  2. Determinar o número total de células utilizando uma câmara de contagem de hemocitómetro célula (passo 1.15). Calcula-se a quantidade necessária de meio de congelação de acordo com a densidade celular congelado desejado (por exemplo, 10 7 célulasS / ml de meio de congelação).
  3. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e ressuspender o sedimento de células em meio de congelação arrefecida com gelo (a partir do passo 2.1).
  4. Distribuir aliquotas de 1 mL da suspensão de células em tubos de ensaio estéreis concebidas para a armazenagem a longo prazo em azoto líquido. Congelar os frascos em uma câmara de isopropanol e armazená-los a -80 ° CO / N. Para a preservação a longo prazo transferir os frascos em azoto líquido que contém um tanque de armazenamento ou uma -140 ° C congelador de células.
  5. Para descongelar frascos com células congeladas, aquecê-los rapidamente em um banho de água a 37 ° C. Imediatamente quando descongeladas, dispersar a suspensão de células para 10 ml de HBSS pré-aquecido (com suplementos, passo 1.1) em um tubo de centrífuga de 15 ml. Girar o tubo a 300 xg durante 5 minutos, remover HBSS e ressuspender o pellet celular a uma densidade de células desejada em HBSS (com suplementos, passo 1.1).
    Nota: A viabilidade do af EMNsTer o descongelamento é de importância, uma vez que a presença de células mortas irá diminuir o rendimento final de B e linfócitos T purificados.
    Nota: De acordo com a nossa experiência a viabilidade celular inferior a 80% irá reduzir a eficiência de isolamento de células.

3. Selecção positiva de Linfócitos T População de tonsilares multinacionais

Nota 1: Este protocolo baseia-se na selecção positiva de linfócitos T CD3 + humanos de empresas multinacionais de amígdalas usando pérolas magnéticas acopladas ao anticorpo CD3. É possível começar esta seção de fresco (Seção 1) ou os congelados (Seção 2) as multinacionais.

Nota 2: Comece com 3 x 10 7 multinacionais. Não exceder este número de células, uma vez que as colunas de separação podem entupir e isso vai reduzir a eficiência do isolamento. Use colunas maiores se mais células serão tratadas. Os volumes utilizados no presente protocolo tem sido experimentalmente optimizado para o número de células USed em nossa configuração experimental.

  1. Preparar o tampão de separação [PBS (pH 7,2), 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA]. Filtra-se o tampão de separação através de um filtro de 0,45 um e armazenar a 4 ° C.
  2. Girar a suspensão PTM (passo 1.14) a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento resultante em 240 uL de células (80 ul por 10 7 células) de tampão arrefecido com gelo de separação. Transferir a suspensão de células para um tubo de 2 mL estéril.
  3. Adicionar 20 ul de anticorpo CD3 magnética para a solução de células. Incubar os tubos durante 1 hora a 4 ° C com agitação suave contínua para manter as células em suspensão.
  4. Transferir todo da suspensão de células para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de tampão arrefecido com gelo de separação para lavar as células.
  5. Centrifuga-se o tubo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C num rotor basculante para fora.
  6. Enquanto isso configurar o separador magnético e coluna. Fixar o separador magnético para o suporte e colocar a coluna na SEPARator. Lava-se a coluna por aplicação de 500 ul de tampão de separação gelada. Descartar o fluxo através.
  7. Coloque um novo tubo de recolha de 15 ml por baixo da coluna. Mantenha o tubo de coleta no gelo.
  8. Descartar o sobrenadante (passo 3.5), através da pipeta e ressuspender cuidadosamente a pelete de células em 500 ul de tampão de separação. Aplicar a suspensão de células na parte superior da coluna de pré-lavadas e deixá-lo correr através.
    Nota: aglomerados de células podem obstruir a coluna e, assim, reduzir a taxa de fluxo. Para evitar este problema, coloque um 40 um filtro de células de plástico no topo da coluna. Passando as células através desta malha vai melhorar muito a eficiência deste método.
  9. Lava-se a coluna 4 vezes com 1,5 ml de tampão de separação (500 ul para 10 7 células). Espere até que o reservatório coluna estar vazio (sem líquido deve ser observado na coluna) antes da aplicação do próximo passo de lavagem.
    Nota: as células não marcadas obter CD3, consideradas como fracção de linfócitos B, como eles sãoeluiu-se para dentro do tubo de recolha.
  10. Remova a coluna do separador e coloque em um novo tubo de 15 ml coleção. Pipetar 2 ml de tampão de separação na coluna. Usando o êmbolo fornecidas com a coluna eluir os linfócitos T seleccionados positivamente, os quais são considerados como a fracção de linfócitos T.
  11. Determinar o número de células purificadas (passo 1.15), se necessário. Suspensões celulares agora está pronto para os experimentos a jusante.

4. Análise de Citometria de Fluxo Isolado tonsilar linfócitos B e T

CUIDADO: solução de paraformaldeído é irritante e possivelmente cancerígeno. Usar vestuário de protecção, luvas e proteção para os olhos / face.

Nota 1: Este protocolo descreve o método para a coloração directa do isolado B e células T de células activadas por fluorescência Sorting (FACS). O principal objectivo deste passo é o de avaliar a pureza do isolado de células populações afTer anticorpo CD3 separação magnética. Para este efeito, B estabelecida e marcadores de células T, os anticorpos monoclonais a fluoróforos, CD20 e CD2-FITC-APC, são utilizados. Também a inclusão de anticorpos de controlo de isotipo é altamente recomendável para distinguir o "fundo" ligação não específica dos anticorpos CD2 e CD20 (ver passo 4.8).

Nota 2: Não é possível manter as fracções de células purificadas numa solução de paraformaldeído a 1% (PFA) no escuro a 4 ° C até o tempo de coloração (por exemplo, no dia seguinte.). Além disso, o mesmo procedimento é aplicável, se houver um intervalo de tempo entre a coloração e análise de FACS. Recordar que em ambos os casos, as células devem ser devidamente lavados com PBSA (PBS contendo BSA a 0,2%) tampão, antes da coloração ou análise de FACS.

  1. Retire 6 x 10 6 células de multinacionais do passo 1,15 (antes de aplicar para a coluna), fração de linfócitos B a partir do passo 3.9 e fração de linfócitos T do passo 3.10.
  2. Gire a célulasuspensões a 300 xg durante 5 min a 4 ° C utilizando um rotor basculante para fora.
  3. Remover o sobrenadante com uma pipeta e lava-se a pelete celular uma vez com 1 ml de gelo-frio PBSA. Rodar as suspensões celulares a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender com a pipeta células em 600 ul de tampão de PBSA gelada.
  4. Adicionar 100 ul da suspensão de células para a parte inferior de um tubo de FACS.
  5. Adicionar 100 ul de PBS contendo soro humano inactivado pelo calor 10% a cada tubo, misturar bem e incubar durante ~ 1 min à temperatura ambiente ou 20 min no gelo.
    Nota: os linfócitos B transportam receptores de Fc. A fim de bloquear a receptores Fc das fracções purificadas de células são incubadas com soro humano inactivado pelo calor 10%. O soro humano é inactivado pelo calor por incubação a 56 ° C durante 1 h. Divida o soro inactivado calor em pequenas alíquotas e armazenar congelados a -20 ° C.
  6. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C num SWing-out rotor.
  7. Remover o sobrenadante com uma pipeta e lava-se a pelete de células com 1 ml de PBSA. Repetir a centrifugação (300 xg durante 5 min a 4 ° C).
  8. Adicionar 100 ul de PBSA a cada tubo em gelo. Adicionar a quantidade apropriada de anticorpo monoclonal conjugado com fluoróforo, de acordo com a recomendação do fabricante (por exemplo, 20 uL de anti-CD20 e / ou 5 ul de anticorpos anti-CD2 em 100 ul de PBSA). Nota: Não se esqueça de atribuir tubos de controlo suficientes para a análise FACS. Neste protocolo os seguintes controles devem ser incluídos: 1) células coradas com os anticorpos anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) células coradas com os anticorpos anti-CD2 e anti CD20 de controle de isótipo individualmente e, 3) células sem adição de anticorpos.
  9. Resumidamente vortex do tubo e incubar durante 30 min a 4 ° C no escuro.
  10. Lave 2 vezes com PBSA. Adicionar 2 ml de solução de PFA 1% para as amostras. Permitir que as células permanecem na solução PFA a 476; C no escuro até o momento da análise FACS.
  11. Imediatamente antes de executar as amostras na máquina de FACS, lavar as células 2 vezes com PBSA (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Suspenda as amostras em 1 ml de PBS e manter a 4 ° C (ou em gelo), protegida da luz, antes da separação no citómetro de fluxo.
  12. Fazer a triagem FACS seguindo o protocolo do citômetro de fluxo fabricante.

5. Detecção de PCR de ADN de adenovirus em Isolado de Tonsillar linfócitos B e T

Nota 1: Os iniciadores do gene de adenovirus hexon são AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') e AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Estes iniciadores gerar um amplicão de 139 pb. O gene de rRNA 18S de acolhimento pode ser detectada com iniciadores tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') e tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). O tamanho esperado de 300 pb do amplicon.

Nota 2: Cada PCRrun inclui um controle negativo (destilada H 2 O) e um controlo positivo de DNA obtido a partir de linha de células B humanas (BJAB) infectadas com adenovírus humano tipo 5 12.

  1. Extracto de ADN (a partir de pelo menos 1 x 10 6 células, etapa 3.11) utilizando membrana de sílica método de purificação com base em coluna. Extrair ARN utilizando uma solução de fenol e isotiocianato de guanidina 13.
  2. Adicionam-se 100 ng de ADN a partir de linfócitos B e T, a uma mistura de reacção contendo tampão 1x HF, 0,2 mM de mistura de trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 0,25 uM de cada iniciador e 1 U de alta-fidelidade da polimerase de ADN num volume total de 20 ul.
  3. Efectue a amplificação de PCR sob as seguintes condições de ciclo: 30 s de desnaturação a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C (hexon) ou 58 ° C (18S rRNA) durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg. A reacção de PCR foi terminada com um passo de extensão final de 7 minutos a 72 ° C.
  4. Separa-se a amplif PCR resultanteprodutos icação sobre um gel de agarose a 1,5% em tampão 1 x TBE e as bandas esperadas visualização por coloração com mancha de ácido nucleico.

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Representative Results

Uma separação eficiente de MNCs tonsilares resultados em subpopulações de linfócitos altamente purificados B e T. Isto foi confirmado por análise de FACS utilizando anticorpos anti-CD20 e anticorpos anti-CD2 para a detecção de linfócitos T e B, respectivamente, populações (Figura 3A). Em contraste, uma separação ineficiente das MNCs resulta em fracções de células que são uma mistura de células a partir de ambas as subpopulações de linfócitos B e T (Figura 3B).

O isolado tonsilar linfócitos B e T (Figura 3A) são de qualidade suficiente para as análises a jusante como o isolamento de ácido nucleico. No protocolo de corrente, o ADN e o ARN extraído de linfócitos B e T são utilizados para a detecção de ADN de adenovírus e ARN celular. Os resultados mostram a detecção específica de ADN de adenovírus em linfócitos T das amígdalas (Figura 4). Também o ARN isolado a partir de tonsilas linfócitos B e T é de qualidade e quantidade suficientes para downstrea aplicações m (Figura 5).

figura 1
Figura 1. Visão geral do procedimento de isolamento de linfócitos tonsilar. Amostras de tonsilas palatinas são processados ​​e multinacionais tonsilar são isolados a partir de suspensão de células por centrifugação em gradiente de densidade. Os linfócitos B e T são purificadas em subpopulações por uma selecção positiva da fracção de linfócitos T com anticorpo CD3 humano magnética. Esta etapa de purificação torna possível avaliar ainda mais as fracções de células isoladas; por exemplo, para determinar se algumas espécies virais são enriquecidas em nenhuma das sub-populações. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. cirurgicamente removido tonsilas palatinas. Amígdalas removidas por amigdalectomia (esquerda) e tonsilotomia (à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Representante resultados FACS das frações celulares enriquecido. (A) vs. Atacante dispersão lateral enredo mostrando B (CD20) e T (CD2) populações de linfócitos em multinacionais tonsilar, linfócitos T e frações de efluentes. A pureza dos linfócitos T e B em fracções de células enriquecidas é mais do que 90%. Uma vez que as células B compreendem 92% do total de células de efluentes, esta fracção é denominada como a subpopulação de linfócitos B. (B) parcelas FACS mostrando separação ineficiente do B e T SUBP celularopulations, devido ao número não optimizada dos PTM aplicada à coluna e os passos de lavagem insuficiente. Além da necessidade de célula magnética activada triagem otimização, há um fundo alta de CD2 - / CD20 -. Células, o que mostra que a coloração FACS não está bem otimizado por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Detecção de PCR do DNA de adenovírus em fracções de linfócitos tonsilares. O ADN total é extraído a partir do B e linfócitos T isolados a partir de amígdalas a esquerda e direita de um paciente submetido a amigdalectomia. Ponto final de PCR é realizada com 100 ng do DNA purificado. Pista 1: fracção de linfócitos B (B) da amígdala esquerda; pista 2: fracção de linfócitos T (T) da left amígdalas; pista 3: fração de linfócitos B (B) da amígdala direita; pista 4: fração de linfócitos T (T) da amígdala direita. Adenovirus DNA (Ad) só é detectável no isolado fração de linfócitos T. Gene 18S rRNA atos celular como um controle interno para mostrar essa mesma quantidade de DNA é usado para a reação de PCR em todas as amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. ARN extraído de alta qualidade isolado B e subpopulações de células T. O RNA total citoplasmático extraído do isolado linfócitos B e T foi separada num gel de agarose a 1%. Pista 1: fracção de linfócitos B (B) da amígdala esquerda; pista 2: fracção de linfócitos T (T) da amígdala esquerda; pista 3: fração de linfócitos B (B) da amígdala direita; pista 4:Fração de linfócitos T (T) da amígdala direita. Padrão de migração de 28S rRNA, 18S rRNA e RNA pequeno é indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um dos factores mais importantes que afectam o resultado do presente protocolo é a utilização de material fresco das amígdalas como o material de partida. Portanto, as amostras de amígdalas deve ser processado dentro de 3 horas após a cirurgia. Amígdalas poderiam ser obtidos de adultos e crianças. O material tonsilar das crianças é geralmente menor, devido à remoção cirúrgica parcial das amígdalas (tonsilotomia). Portanto, o número de PTM obtido a partir de amostras tonsilotomia (1 x 10 7 x 10 -1 8) é menor em comparação com amostras amigdalectomia (1 x 10 8 x 10 -2 9). No entanto, o processo de isolamento de células seria o mesmo, independentemente do tipo de cirurgia.

Maximizando a pureza das subpopulações de células obtidas a partir de células-magnética activado método de triagem requer alguma optimização. A quantidade eo tempo de incubação com CD3 magnética eo número de multinacionais aplicados à coluna são os principais fatores que devem ser optamimized. Aplicando muitas células irá resultar em entupimento da coluna e enriquecimento ineficiente de subpopulações de células. Durante a optimização deste protocolo, verificou-se que a aplicação de mais do que 3 x 10 7 EMNs na coluna de separação irá causar uma obstrução da coluna e as fracções de células impuros subsequentes (Figura 3B). Assim, começando com 3 x 10 7 EMNs dá fracções enriquecidas com linfócitos bem qualidade e em quantidade suficiente para a extracção do ADN e ARN (Figuras 4 e 5). O número final de linfócitos B e T isoladas deverá ser de 1-2 x 10 7 e 5-7 x 10 6, respectivamente. Assim, a utilização de 20 ul de anticorpo CD3 magnético por 3 x 10 7 PTM parece ser óptimo para o sucesso da separação de linfócitos B e T (Figura 3A).

Um relatório anterior estabeleceu que os linfócitos B e T compreendem 60-70% e 30-40% das MNCs tonsilares respectivamente, enquanto que a outratipos de células como macrófagos, células natural killer e células dendríticas formam 1-8% das multinacionais tonsilar 14. Proporções de células semelhantes foram obtidos com o nosso protocolo de isolamento, como mostrado por imunocoloração dos linfócitos B e T com a técnica de FACS (Figura 3A).

O número de passos de lavagem e do volume de tampão de lavagem são parâmetros críticos para um bom resultado. Por conseguinte, a lavagem excessiva fará com que as células T CD3 associados magnética para acabar no fluxo de passagem, enquanto que a lavagem insuficiente irá reduzir a pureza da fracção de células T.

Uma vez que as etapas críticas do protocolo são otimizadas para o tipo de tecido e as análises a jusante esperados, este método é simples, eficiente, simples e economizando tempo. No entanto, uma limitação deste método é relativamente elevado custo dos reagentes de separação de células magnético associado comerciais, o que poderia limitar a purificação em grande escala de tonsillaR B e linfócitos T.

Em resumo, este protocolo proporciona uma estratégia para a obtenção de B e T subpopulações de amígdalas palatinas e pode ser modificada para isolar fracções de células de outros tecidos, como baço, timo, nódulos linfáticos e no sangue. Aplicamos este método adicional para mostrar que detectar uma infecção por adenovirus, especificamente na fracção de células T das amígdalas (Figura 4). Assim, esse protocolo deve ser útil para uma ampla área de aplicações, incluindo estudos sobre interações patógeno-hospedeiro, a citotoxicidade de células T, activação de células T, sinalização celular e B e T superfície celular expressão marcador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

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References

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