चूहा वृषण से Sertoli कोशिकाओं के अलगाव और Peritubular प्रकोष्ठों

Immunology and Infection

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Summary

प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं में सूजन या संक्रमण, और उनके immunoprotective गुण के उपयोग के दौरान वृषण-प्रतिरक्षा विशेषाधिकार, संकेत पारगमन के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। यहाँ हम उच्च शुद्ध प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं और चूहे वृषण से peritubular कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक एंजाइम आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन है।

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Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

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Abstract

वृषण, और विशेष रूप से नर युग्मक में, एक अनोखा तरीका में प्रतिरक्षा प्रणाली को चुनौती दी है क्योंकि भेदभाव शुक्राणु पहले यौवन के समय में दिखाई देते हैं - दस साल से अधिक प्रणालीगत प्रतिरक्षा सहिष्णुता की स्थापना के बाद। स्पेर्मेटोजेनिक कोशिकाओं प्रोटीन है कि गैर आत्म प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा के रूप में देखा जा सकता है की एक संख्या व्यक्त करते हैं। वृषण तो एक हाथ पर इन नव-एंटीजन को सहिष्णुता स्थापित करने के लिए है, लेकिन अभी भी खुद को दूसरी ओर संक्रमण और ट्यूमर के विकास से बचाने के लिए सक्षम हो सक्षम होना चाहिए। इसलिए वृषण शरीर में कुछ विशेषाधिकार प्राप्त प्रतिरक्षा साइटों है कि एक हानिकारक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया evoking बिना विदेशी एंटीजन बर्दाश्त से एक है। Sertoli कोशिकाओं वृषण के इस विशेषाधिकार प्राप्त प्रतिरक्षा पर्यावरण के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और यह भी एक विदेशी माहौल में cotransplanted कोशिकाओं के अस्तित्व को लम्बा खींच। इसलिए प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं वृषण ई नहीं है कि हो सकता है की प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैasily स्थापित सेल लाइनों या अन्य सेलुलर मॉडल के द्वारा बदल दिया। और peritubular कोशिकाओं वांछित है - - चूहे वृषण से एक ही दिन के भीतर यहाँ हम Sertoli कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत और व्यापक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Introduction

वृषण पुरुष युग्मक और यौन हार्मोन, यानी, एण्ड्रोजन का उत्पादन। अंग दो डिब्बों से बना है। मध्य डिब्बे में, कि, कुल वृषण मात्रा 1 के बारे में 10-12% का प्रतिनिधित्व करता steroidogenesis लेडिग की कोशिकाओं के भीतर जगह लेता है। ट्यूबलर डिब्बे वृषण मात्रा 1 के 60-80% के बारे में प्रतिनिधित्व करता है और रोगाणु कोशिकाओं और दैहिक कोशिकाओं के दो प्रकार के होते हैं - peritubular कोशिकाओं और Sertoli कोशिकाओं। वृषण 250-300 lobules में संयोजी ऊतक सेप्टा से विभाजित है, प्रत्येक 1-3 अत्यधिक जटिल बीजदार नलिकाओं से युक्त। इन नलिकाओं एक बेसल झिल्ली, कोलेजन के एक पत्रक, और peritubular कोशिकाओं की एक परत परिधीय (चित्रा 1 ए) द्वारा संलग्न हैं।

कीटाणु उपकला बेसल झिल्ली की luminal ओर स्थित है। Sertoli कोशिकाओं बड़ी लम्बी कोशिकाओं कि लुमेन के लिए बेसल झिल्ली से पूरे कीटाणु उपकला अवधि रहे हैं। वे दृढ़ता हैं एटीटीबेसल झिल्ली के लिए बैठ जाता है और उस interstitium से कीटाणु उपकला occludes और रक्त-वृषण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है basolateral संगठित तंग जंक्शनों के माध्यम से एक सतत सेलुलर चादर के रूप में। Sertoli कोशिकाओं प्रमुख cytoplasmic अनुमानों और असर है कि उन्हें जनन कोशिकाओं की एक प्रजाति विशेष लेकिन लगातार संख्या के साथ तंग रूपात्मक और कार्यात्मक संपर्क में पाने के लिए सक्षम है। द्विगुणित कीटाणु स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और शुक्राणुजन में अंतर है।

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मैं टेट्राप्लोइड spermatocytes उत्पन्न कर रहे हैं कि अर्धसूत्रीविभाजन II के दौरान चार अगुणित spermatids में आगे विकसित अल्पकालिक। सभी जनन कोशिकाओं cytoplasmic पुलों से जुड़े रहते हैं ताकि वे एक सेलुलर शुद्ध फार्म रहे हैं। spermatids की परिपक्वता के दौरान प्रिंसिपल घटना, अवशिष्ट निकायों के गठन, एक प्रक्रिया बुलाया spermiogenesis में कोशिका द्रव्य के बड़े हिस्से से बाहर निकालना है। अवशिष्ट शव Sertoli कोशिकाओं द्वारा phagocytosed रहे हैं। देर spermatids फिर में जारी कर रहे हैंट्यूबलर लुमेन और आगे की परिपक्वता के लिए अधिवृषण में पहुँचाया। Sertoli कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं परस्पर भौगोलिक विवरण और कार्यात्मक spermatogenesis समन्वय करने के लिए दिखाई देते हैं।

अलग-अलग वृषण सेल प्रकार की तैयारी लगभग एक सदी पहले शुरू हुई जब छोटे टुकड़े वृषण खेती की जाती थी और सेल प्रकार माइक्रोस्कोपी 2 द्वारा की पहचान की। ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग Tunica धवल खोलने के बाद नलिकाओं से सावधान विच्छेदन के द्वारा यह संभव हो गया था बाद में ट्यूबलर और मध्य डिब्बों 3 अलग करने के लिए। 1975 में वेल्श और Wiebe मध्य ऊतक और बाहरी peritubular सेल परत 4 को हटाने के लिए एक pancreatin उपचार पालन करने से नलिकाओं को मुक्त करने के क्रम में एक कोलैजिनेज़ उपचार की शुरुआत की। क्योंकि spermatogenesis अभी तक शुरू नहीं हुई है से जल्दी जवान अपरिपक्व चूहों पर (वर्ष 20 के आसपास दिन) में जो इस्तेमाल किया गया था Sertoli कोशिकाओं ट्यूबलर सेल की आबादी का एक बड़ा अंश शामिल हैं। इस उम्र चूहे Sert परओली कोशिकाओं के विभाजन के लिए संघर्ष, और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के लिए फार्म ताकि रक्त-वृषण बाधा 5 की स्थापना की है।

वेल्श और Wiebe Dorrington एट अल। के स्वतंत्र trypsin का एक संयोजन पेश किया है और deoxyribonuclease soybeen trypsin अवरोध और collagenase उपचार है कि इसी वर्ष 6 में प्रकाशित किया गया था द्वारा पीछा किया। दोनों समूहों को भी आदेश लगभग 70% Sertoli कोशिकाओं होता है कि चढ़ाना के लिए एक सजातीय सेल निलंबन का उत्पादन करने में यांत्रिक बल (एक सिरिंज सुई या एक पाश्चर विंदुक क्रमशः के माध्यम से बार बार पच ट्यूबलर टुकड़े ड्राइंग) का इस्तेमाल किया। संस्कृति में 3 दिन, एक माध्यम है कि सीरम मुक्त है उपयोग करने के बाद, Sertoli कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 90% तक बढ़ जाती है। यह काफी हद तक जनन कोशिकाओं contaminating की मौत के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। अवशिष्ट peritubular कोशिकाओं (पीटीसी), तथापि, दृढ़ता से अपने बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से संलग्न रहते हैं। पीटीसी, लेकिन नहीं Sertoli कोशिकाओं, उत्पादन करने के लिए जाना जाता हैफ़ाइब्रोनेक्टिन कि पीटीसी के साथ संदूषण का आकलन करने के लिए एक मार्कर प्रोटीन के रूप में सेवा कर सकते हैं। इसलिए, तुंग एट अल। तर्क है कि एक अतिरिक्त hyaluronidase उपचार Sertoli सेल अंश 7 की शुद्धता में सुधार हो सकता है। वास्तव में वे दिखा सकता है कि एक अतिरिक्त उपचार पीटीसी द्वारा प्रदूषण को कम करने के लिए लगभग 20 गुना है, जो विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है जब तुलना में एक सीरम युक्त मध्यम शुद्ध Sertoli कोशिकाओं की खेती के लिए प्रयोग किया जाता है में सक्षम था। तब से तुंग एट अल के सुधार प्रक्रिया पर। प्रचलित प्रोटोकॉल बन गया है और बड़े पैमाने पर क्षेत्र 8 (चित्रा 1 बी) में अन्य प्रमुख समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया था।

कोलैजिनेज़ उपचार के दौरान पीटीसी के बहुमत जारी कर रहे हैं और Sertoli कोशिकाओं के समानांतर में अलग किया जा सकता है। जबकि पीटीसी सख्ती पैदा करना और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) का जवाब नहीं है, Sertoli कोशिकाओं अब बँटवारा गुजरना नहीं है और विशेषता रूपात्मक परिवर्तन से एफएसएच का जवाबऔर चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) 9 एकाग्रता में वृद्धि हुई है। इसी तरह बहुत enzymatic पाचन प्रोटोकॉल आदमी 10, 11,12 माउस, साइबेरियाई हम्सटर 13 या 14 याक की तरह अन्य जानवरों से प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगाणु कोशिकाओं को एक hypotonic सदमे contaminating की बड़ी मात्रा को हटाने के लिए अलगाव की प्रक्रिया 15 के अंत में नियोजित किया जा सकता है। वयस्क चूहे से 16 वृषण यह भी Sertoli कोशिकाओं के कुशल अलगाव की अनुमति देता है। एक समृद्ध Sertoli सेल निलंबन भी नशा एक प्रकार का धतूरा साथ agglutinin 17 लेपित लेक्टिन बर्तन पर निलंबन चढ़ाना द्वारा जनन कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। केवल Sertoli कोशिकाओं और कुछ अवशिष्ट पीटीसी लेक्टिन प्लेटों का पालन करें।

प्राथमिक Sertoli सेल संस्कृतियों, मुख्य रूप से चूहे से, हार्मोन के लिए जवाबदेही की जांच कर या माउस Sertoli सेल ली तरह सेल लाइनों की स्थापना के लिए शुरू में इस्तेमाल किया गया हैne TM4 18। यह सेल लाइन एक सौ से अधिक अध्ययनों में आज तक जांच की गई है। एक translational दृष्टिकोण में Sertoli कोशिकाओं प्रणालीगत प्रतिरक्षादमन 19 बिना सह सुसंस्कृत कोशिकाओं और लंबी अवधि के भ्रष्टाचार के अस्तित्व के लिए xeno- या अनुवांशिक रूप से भिन्न अग्नाशय टापू के सह-प्रत्यारोपण में जैसे ऊतकों के इम्युनो-संरक्षण के लिए उपयोग किया गया है। और दैहिक-रोगाणु सेल (Sertoli कोशिकाओं - रोगाणु कोशिकाओं) बातचीत 20, 21 - पृथक Sertoli कोशिकाओं को भी उपकला-mesenchymal (PTCc Sertoli कोशिकाओं) के अध्ययन के लिए सह संस्कृति प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं टोल की तरह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति और proinflammatory साइटोकिन्स के स्राव के साथ ही संकेत पारगमन झरने की जांच nonpathogenic और uropathogenic के साथ संक्रमण के बाद अभिव्यक्ति साइटोकाइन के लिए अग्रणी के लिए नियोजित किया गया है कोलाई 22। हाल के अन्य जांच वृषण प्रतिरक्षा पी के अध्ययन के लिए Sertoli कोशिकाओं का उपयोग कर रहे थेrivilege 23 और दिखा दिया कि टेस्टोस्टेरोन पूर्व उपचार LPS प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया 24 को रोकता है।

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Protocol

1. पशु आचार वक्तव्य

यहाँ वर्णित प्रयोगों स्थानीय प्राधिकारी के रूप में, Regierungspräsidium Giessen, जर्मनी के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए देखभाल और पशु के उपयोग के लिए अभ्यास के जर्मन संहिता (अनुमति नहीं करने के लिए इस बात की पुष्टि:। सैनिक 20/23 Nr ए 31 / 2012)।

2. मीडिया, एंजाइम समाधान और पशु की तैयारी

  1. 100 मिलीलीटर इथेनॉल में आयोडीन की 1 ग्राम भंग करके 1% आयोडीन शराब तैयार करें।
  2. 2x 500 मिलीलीटर Dulbecco's फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) सीए के बिना 2 + और ​​2 मिलीग्राम + 7.5 एमएल डी ग्लूकोज (100 ग्राम / एल) और 5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर समाधान (15 मिलीग्राम / एमएल डी के साथ प्रत्येक पूरक तैयार -glucose, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन अंतिम)।
  3. 1x 500 मिलीलीटर रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) के साथ 5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर समाधान (50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन पंख 1,640 मध्यम अनुपूरकअल)।
  4. एक ट्रिप्सिन-DNase मैं समाधान तैयार (2.5 मिलीग्राम / एमएल trypsin और 10 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं) 25 मिलीग्राम trypsin और 0.1 मिलीलीटर DNase जोड़कर मैं (1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं) 9.9 मिलीलीटर पीबीएस के लिए।
  5. एक समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) अवरोध ट्रिप्सिन के लिए 5 मिलीलीटर पीबीएस में 50 मिलीग्राम ट्रिप्सिन अवरोध भंग। Trypsin अवरोध बी समाधान के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस (2.5 मिलीग्राम / एमएल) में 25 मिलीग्राम ट्रिप्सिन अवरोध भंग।
  6. एक कोलेजिनेस-hyaluronidase-Deoxyribonuclease मैं (DNase मैं) समाधान के लिए भंग 10 मिलीग्राम कोलेजिनेस ए (1 मिलीग्राम / एमएल अंतिम), 10 मिलीग्राम hyaluronidase (1 मिलीग्राम / एमएल अंतिम) और 0.1 मिलीलीटर DNase मैं (1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं) ( 10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) 10 मिलीलीटर पीबीएस में।
  7. 9.9 मिलीलीटर पीबीएस के लिए 10 मिलीग्राम hyaluronidase (1 मिलीग्राम / एमएल अंतिम) और 0.1 मिलीलीटर DNase मैं समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) (10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) को जोड़कर एक hyaluronidase-DNase मैं समाधान तैयार है।
  8. समय पर Wistar चूहों आदेश में ऐसा है कि वे 19 दिनों के Sertoli सेल अलगाव के दिन पुराने हैं।
    नोट: वर्णित प्रोटोकॉल 10 चूहों के लिए बनाया गया है, लेकिन 5 का एक न्यूनतम और 20 चूहों की एक अधिकतम के लिए संशोधित किया जा सकता है।सभी समाधान की मात्रा के अनुसार समायोजित किया जाना है।
  9. 100 मिलीलीटर isopropanol में 0.35 छ तेल लाल हे भंग द्वारा तेल लाल हे शेयर समाधान तैयार है। हिलाओ हे / एन, अप करने के लिए एक वर्ष के लिए आरटी पर 0.2 माइक्रोन और दुकान के माध्यम से फिल्टर।
  10. 4 मिलीलीटर पानी के साथ 6 मिलीलीटर तेल लाल हे शेयर समाधान के मिश्रण से तेल लाल हे धुंधला समाधान तैयार (3: 2)। बाद 0.2 माइक्रोन के माध्यम से 10-20 मिनट फिल्टर। अगले 2 घंटा के भीतर का प्रयोग करें।
  11. एक 4% तैयार (w / v) जबकि धीरे सरगर्मी 1x पीबीएस के 80 मिलीलीटर के लिए 4 जी paraformaldehyde पाउडर (पीएफए) को जोड़कर एक हवादार हुड में formaldehyde समाधान। हीट करने के लिए ~ 60 डिग्री सेल्सियस, 1 एम NaOH के 1 मिलीलीटर जोड़ने और जब तक paraformaldehyde भंग कर रहा है सरगर्मी जारी है। समाधान आरटी को शांत, 1 एम एचसीएल के साथ 7.4 पीएच और 1x पीबीएस के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करने दें। समाधान (0.45 माइक्रोन) फिल्टर और कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में ताजा या दुकान का उपयोग करें।
    नोट: Polymerized formaldehyde (पीएफए) पानी में monomeric formaldehyde के लिए depolymerizes। यह प्रक्रिया हैमध्यम हीटिंग और एक थोड़ा alkaline पीएच द्वारा उत्प्रेरित। सभी एंजाइम समाधान हौसले से तैयार है और फिल्टर के उपयोग के दिन पर बाँझ (0.2 माइक्रोन) के लिए उन्हें। एक एंजाइम के लिए एक अलग निर्माता (सामग्री देख / उपकरण टेबल) यदि प्रयोग किया जाता है, ध्यान से अपनी एकाग्रता / गतिविधि को समायोजित।
    निम्नलिखित प्रोटोकॉल में एक "पिपेट" एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के लिए खड़ा है।

3. बीजदार नलिकाओं की तैयारी

  1. एक desiccator सीओ 2 का उपयोग और एक प्रवाह की दर प्रति मिनट चैम्बर मात्रा का कम से कम 20% विस्थापित में एक के बाद एक असंवेदनता 10 पुरुष Wistar चूहों। एक पैर पैड फैलाएंगे द्वारा सांस बंद हो जाता है जब तक, परीक्षण संज्ञाहरण रुको, और अगर वहाँ कोई प्रतिक्रिया ग्रीवा अव्यवस्था से प्रत्येक चूहे euthanize। पानी बहने के तहत गले नस और मन्या धमनी (योनि carotica) सेक्शनिंग द्वारा रक्त नाली। 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा पेट कीटाणुरहित।
  2. संदंश का प्रयोग पेट मुसलमानों से त्वचा उठाcles और एक अंडाकार आकार त्वचा पालि कि उरोस्थि (2A चित्रा) के लिए जघन सहवर्धन से विस्तार कर रहा है बाहर कटौती और इसे छाती पर ऊपर की तरफ प्रालंब। अगले, पेट की मांसपेशियों को हड़पने के लिए और उरोस्थि के लिए जघन सहवर्धन से एक औसत दर्जे का चीरा बनाते हैं।
    1. श्रोणि से अंगूठे के साथ पेट निचोड़ ऊपर की तरफ आदेश कम श्रोणि के बाहर वृषण को पुश करने में। आगे वृषण ऊपर खींच लिए संदंश के साथ अधिवृषणी वसा पैड (चित्रा 2 बी) उठाओ। वृषण रज्जु (चित्रा 2 बी) में कटौती, Tunica धवल बरकरार छोड़ रहा है, और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा -2) में 20 मिलीलीटर पीबीएस में सभी वृषण इकट्ठा।
  3. सभी वृषण इकट्ठा करने के बाद, उन्हें (w / v) इथेनॉल में आयोडीन 1% की एक समान मात्रा (20 एमएल) जोड़कर कीटाणुरहित। ट्यूब दो बार पलटना और तुरंत सतह पर तैरनेवाला छानना। जल्दी 25 मिलीलीटर पीबीएस प्रत्येक (चित्रा 2 डी) के साथ दो बार वृषण धो लें।
  4. एक पेट्री डिश के लिए वृषण स्थानांतरण शामिल15 मिलीलीटर आईएनजी पीबीएस (चित्रा 2 ई)। एक छोर पर संदंश द्वारा मजबूती से प्रत्येक वृषण समझ, विपरीत अंत में Tunica धवल में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए, और एक scraping उपकरण के रूप में बंद कैंची ब्लेड का उपयोग नलिकाओं बाहर निचोड़।
    नोट: नलिकाओं अभी भी केवल कुछ ही नलिकाओं आदेश सजातीय enzymatic पाचन (चित्रा 2 एफ) को सक्षम करने के समाधान में विस्तार के साथ एक कॉम्पैक्ट अंडकोष के आकार का बंडल फार्म चाहिए।
  5. एक 100 मिलीलीटर पेंच टोपी 10 मिलीलीटर trypsin-DNase मैं समाधान युक्त बोतल के लिए डी-capsulated वृषण स्थानांतरण। 32 डिग्री सेल्सियस (120 दोलनों / मिनट) पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में पाचन प्रदर्शन करना। 4 मिनट के बाद नलिकाओं के फैलाव के लिए नग्न आंखों के साथ नलिकाओं का मूल्यांकन। एक बार जब नलिकाओं समाधान में तितर-बितर करने के लिए शुरू, पाचन तुरंत बंद करो। यदि आवश्यक हो, अप करने के लिए 2 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी है।
  6. trypsin अवरोध समाधान ए के 5 मिलीलीटर जोड़कर 3-4 समय trypsin पाचन बंद करो अच्छी तरह से ऊपर pipetting द्वारा समाधान मिश्रण और नीचेएक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण है।
  7. ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद निरीक्षण नलिकाओं, इकाई गंभीरता से ध्यान से व्यवस्थित कदम 3.6 से 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके तैरनेवाला निकालें और व्यवस्था में पूरी तरह trypsin पाचन को रोकने के लिए trypsin अवरोध बी समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। नीचे 2-3 बार ऊपर pipetting और नलिकाओं Resuspend।
  8. दूषित हटाने के लिए आदेश में मध्य कोशिकाओं 25 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्रत्येक नलिकाओं 9 बार धो लें। एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक धोने में नलिकाओं Resuspend और उन्हें 10 मिनट के लिए इकाई गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। हमेशा पीबीएस, मेजबान और सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए एक ही pipetting 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें।

4. हटाने / Peritubular कोशिकाओं के अलगाव (पीटीसी)

  1. एक 100 मिलीलीटर की बोतल पेंच टोपी के लिए सभी नलिकाओं स्थानांतरण और कोलेजिनेस-hyaluronidase-DNase मैं समाधान (चित्रा 3 ए) जोड़ें। पाचन 32 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए प्रदर्शन (120 दोलनों / मिनट)।
  2. Pipet एक गिलास स्लाइड पर निलंबन की एक बूंद और जल्दी 100x बढ़ाई दिनचर्या सेल संस्कृति के लिए एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नलिकाओं की जाँच करें। अगर पाचन उन्नत नहीं है पर्याप्त अतिरिक्त 2 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी (समय अति सूक्ष्म जांच करने के लिए की जरूरत गिनती नहीं है)।
    नोट: इस चरण के दौरान सभी नलिकाओं की लंबाई और छोटी नली किनारों में संक्षिप्त कर किसी न किसी तरह हो जाना चाहिए (चित्रा 3 बी और सी)। किसी न किसी किनारों peritubular कोशिकाओं की रिहाई के लिए संकेत कर रहे हैं।
  3. कदम 3.8 से 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पचा नलिकाओं के साथ निलंबन स्थानांतरण। 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 100 मिलीलीटर की बोतल धो और शंक्वाकार ट्यूब में नलिकाओं में जोड़ें। पच नलिकाओं 10 मिनट के लिए इकाई गंभीरता से बसा है, और ध्यान से निकालना सतह पर तैरनेवाला की अनुमति दें, पीटीसी युक्त, 25 मिलीलीटर पिपेट फिर से उपयोग, और एक नया शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। पिछले कुछ मिलीलीटर की आकांक्षा के लिए orde में एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोगआर नलिकाओं के किसी भी ले पर रोकने के लिए।
  4. 20 मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक एकत्र छोटी नली supernatants को जोड़ें, ब्रेक का उपयोग किए बिना आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज।
  5. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना और pelleted पीटीसी 20 मिलीलीटर में RPMI पांच T75 16 मिलीलीटर मध्यम प्रत्येक युक्त बोतल पर 1,640 मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ पूरक और बीज 4 मिलीलीटर प्रत्येक resuspend। 5% सीओ 2 माहौल (चित्रा 4 ए) में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. संस्कृति के 3 दिन पीटीसी trypsinize और उन्हें 1 विभाजित: T75 16 मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ पूरक युक्त बोतल पर 2 प्रत्येक (पैदावार 10 बोतल कुल मिलाकर) (चित्रा 4 बी)। 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें।
  7. संस्कृति के 5 वें दिन फिर से पीटीसी trypsinize और प्रयोग के आधार पर 6 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर उन्हें थाली(प्लेट प्रति एक T75 कुप्पी)। प्रयोगों 6 दिन पर प्रदर्शन किया जा सकता है।

5. Sertoli कोशिकाओं के अलगाव (एससी)

  1. एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके 4.3 चरण पीबीएस के 25 मिलीलीटर में अच्छी तरह से बसे नलिकाओं Resuspend और उन्हें 12 मिनट के लिए इकाई गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। pipetting पीबीएस, नलिकाओं और supernatants के हटाने के मेजबान के लिए एक ही 25 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग करें। धोने दोहराएँ 3 बार (कुल 4 washes)।
  2. पेंच टोपी hyaluronidase-DNase मैं समाधान युक्त बोतल के बाद पिछले धोने के एक और 100 मिलीलीटर के लिए पचा नलिकाओं हस्तांतरण। 32 डिग्री सेल्सियस (120 दोलनों / मिनट) पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में पाचन प्रदर्शन करना।
  3. 5 मिनट के बाद 4.2 कदम के रूप में वर्णित प्रकाश सूक्ष्म निरीक्षण 100X बढ़ाई द्वारा फिर से नलिकाओं की जाँच करें।
    नोट: लघु नलिकाओं, ट्यूबलर समुच्चय और जारी की कोशिकाओं को दिखाई जानी चाहिए (चित्रा 3 डी)।
    1. ट्यूबलर समुच्चय 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें, और सतह पर तैरनेवाला aspirate हमेंएक 25 मिलीलीटर पिपेट हैैं। धो 25 मिलीलीटर पीबीएस और प्रत्येक धोने कदम (चित्रा 3E) के लिए 10 मिनट की एक अवसादन समय का उपयोग कर 4 बार समुच्चय।
  4. 1640 RPMI माध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें और निलंबन एक 18 जी सुई एक 20 मिलीलीटर सिरिंज पर घुड़सवार के माध्यम से 10 बार गुजरती हैं। हवा के बुलबुले से बचें।
    नोट: अंदर और बाहर के माध्यम से सुई एक पास के रूप में माना जाता है निलंबन पुलिंग। hydrodynamic कर्तन द्वारा व्यवधान और कोशिकाओं के homogenization कोशिकाओं है कि कुल के लिए करते की तैयारी में एक मानक तकनीक है। छोटे भीतरी व्यास का एक चमड़े के नीचे सुई के माध्यम से कोशिकाओं के निधन 25। चित्रा 5C और डी संस्कृति के 4 दिन पर शुद्ध Sertoli कोशिकाओं के सामान्य फैटी से पता चलता है उनके कार्यात्मक संपत्तियों पर प्रभाव पड़ता है की संभावना नहीं है।
    1. Pipet 10X बढ़ाई Agg पर अगर दिनचर्या सेल संस्कृति के लिए एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नलिकाओं की जांच एक गिलास स्लाइड पर और जल्दी से निलंबन की एक बूंदregates सभी बिखरे हैं (चित्रा 3F)। आदेश छानना में एक शुद्ध एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर।
  5. ब्रेक का उपयोग किए बिना आरटी पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर कदम 5.4 से छानना अपकेंद्रित्र। ध्यान से 40 में एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला aspirate, और Sertoli कोशिकाओं resuspend मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम (सीरम मुक्त)।
  6. Trypan ब्लू दाग की 100 μl के साथ 100 μl सेल निलंबन मिलाएं और एक Neubauer बेहतर चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गिनती। मतगणना परिणाम के अनुसार 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल एकाग्रता समायोजित करें। बीज 6 अच्छी तरह से थाली (= दिन 1) पर अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर। एक में एक कवर पर्ची डाल या Sertoli कोशिकाओं बोने से पहले कुछ कुओं एक तेल लाल हे धुंधला (चरण 6) की योजना बनाई है।
    नोट: निलंबन में Sertoli कोशिकाओं जल्दी से व्यवस्थित इतना है कि ट्यूब संक्षेप में एक सेल विभाज्य विंदुक के साथ लिया जाता है से पहले हर बार हिल जाना चाहिए। 4 वे मजबूती से एटीटी दिन तकबुनियाद को आक।
  7. 4 दिन पर तैर या पक्षपाती जनन कोशिकाओं को दूर करने के क्रम में (चित्रा 4C) 6 अच्छी तरह से अलग-थलग Sertoli कोशिकाओं पीबीएस (चित्रा 4D) के साथ (कदम 5.6) चढ़ाना के लिए इस्तेमाल प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें। मध्यम Aspirate, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और एक मेज पर सख्ती लेकिन पीबीएस spilling बिना क्षैतिज 6 अच्छी तरह प्लेटें हिला। धोने दोहराएँ 3 बार और दिन में 5 और 6 (चित्रा 4E) पर एक ही कपड़े धोने की प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: 4 दिन Sertoli कोशिकाओं मजबूती से जुड़ा है और उल्टे पर प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 4C) के तहत पैटर्न की तरह एक पत्थर दिखा। प्रयोगों के बाद दिन 7 से किया जा सकता है।
    1. (कदम 5.7 के लिए वैकल्पिक) फ्लोटिंग और पक्षपाती जनन कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर बोने के बाद एक hypotonic सदमे 3 दिन प्रदर्शन को हटाने के लिए। मध्यम निकालें और 20 मिमी Tris पीएच 7.5 से 1 मिलीलीटर सीधे फ्रिज से बाहर ले जाया जोड़ें। 90 120 सेकंड के लिए नहीं बल्कि बाद Tris बफर Aspirateबाद में। कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और 1640 RPMI मध्यम (सीरम मुक्त) के 2 मिलीलीटर जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, अगले दिन प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: अब hypotonic सदमे की अवधि अधिक जर्म कोशिकाओं से हटाया जा सकता है, लेकिन अधिक Sertoli कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से खो जाते हैं। पहले पीबीएस धोने के क्रम में किसी भी Sertoli कोशिकाओं को विस्थापित करने के लिए नहीं है, लेकिन जल्दी से देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। बाद सीधे विभिन्न आकार के hypotonic उपचार कई रिक्तिकाएं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिका द्रव्य में मनाया जा सकता है। रिक्तिकाएं hypotonic उपचार के बाद कुछ ही घंटों के भीतर गायब।

6. तेल लाल हे धुंधला

  1. आरटी पर सभी चरणों का प्रदर्शन। दिन में 7 धोने Sertoli कोशिकाओं में दो बार एक कवर पर्ची (कदम 5.6) पीबीएस के साथ पर हो और पीबीएस में 10% formalin के साथ उन्हें ठीक। 10 मिनट के बाद नए सिरे से समाधान के साथ formalin जगह है, और एक और 60 मिनट के लिए निर्धारण जारी है।
    नोट: सभी अच्छी तरह से समाधान (एस) एक कवर पर्ची के साथ करने के लिए जोड़ा गया है और अगले कदम से पहले aspirated रहे हैं। महाप्राण formalin, पानी के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने और 60% isopropanol जोड़ें। 5 मिनट के बाद कुछ मिनट के लिए शुष्क हवा कोशिकाओं अनुमति देते हैं।
  2. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर तेल लाल हे धुंधला समाधान जोड़ें और 10 मिनट के लिए सेते हैं। समाधान Aspirate, और पानी के साथ कोशिकाओं को तुरंत 4 बार धोने और माउंट कवर ग्लिसरॉल-पीबीएस में निकल जाता है (9: 1)। एक नियमित प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 4F) के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों ले लो।

7. Immunofluorescence धुंधला

  1. या (5.5 कदम से) Sertoli कोशिकाओं दो बार पीबीएस के साथ एक कवर पर्ची पर हो (4.5 कदम से) पीटीसी धो और आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ उन्हें ठीक।
  2. आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% BSA के साथ सेते हैं। बीएसए पीबीएस समाधान त्यागें और ताजा बीएसए पीबीएस actin (चिकनी मांसपेशियों) युक्त (पीटीसी के लिए) या (Sertoli कोशिकाओं के लिए) समाधान vimentin प्राथमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1: 100 दोनों एंटीबॉडी के लिए) जोड़ने और 4 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
    नोट: बीएसए ब्लॉकों गैर विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन के साथ ऊष्मायन।
  3. धो कवर पीबीएस 0.1% बीच 20 में 5 मिनट के लिए 3 बार निकल जाता है और हरे-फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1: 1,000) के साथ सेते अंधेरे में 1 घंटे के लिए आरटी पर।
  4. धो कवर पीबीएस 0.1% बीच 20 में 5 मिनट के लिए 3 बार फिसल जाता है और उन्हें DAPI बढ़ते मध्यम में माउंट।

8. Ultrastructural विश्लेषण

  1. (5.6 कदम से) धो Sertoli कोशिकाओं पीबीएस के साथ एक 6 सेमी सेल संस्कृति की थाली पर हो गई है और 67 मिमी cacodylate बफर में 2.5% glutaraldehyde, 2.5% और 0.05% paraformaldehyde रंगाई एसिड का एक मिश्रण में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए उन्हें ठीक ( 7.4 पीएच) आईटीओ और Karnovsky 26 के अनुसार।
  2. 1% आज़मियम tetroxide 0.3% uranyl एसीटेट में एक हे / एन ऊष्मायन 50 मिमी maleate बफर (5 पीएच) में भंग के द्वारा पीछा में पोस्ट-निर्धारण प्रदर्शन करना। मानक प्रक्रियाओं के अनुसार मीडिया embedding में एम्बेड नमूने हैं। पतली वर्गों में कटौती, उन्हें नेतृत्व साइट्रेट के साथ इसके विपरीत और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच करते हैं।

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Representative Results

वर्णित प्रक्रिया 10 चूहे वृषण से लगभग 12 x 10 7 Sertoli कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया जाता है तो यह है कि छह से सात 6 अच्छी तरह प्लेटें 7. दिन पर प्रयोगों के लिए उपलब्ध हैं ट्रिप्सिन-DNase मैं पाचन Sertoli सेल अलगाव के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम है। इस बिंदु पर पाचन बहुत दूर आगे बढ़ रहा है, तो जनन कोशिकाओं का अनुपात / Sertoli कोशिकाओं disproportionally को समाप्त करने में वृद्धि होगी। संस्कृति के 3-6 दिन के दौरान यह ध्यान से संभव के रूप में दूर के रूप में कई गैर-पालन या शिथिल संलग्न जनन कोशिकाओं को धोने के लिए महत्वपूर्ण है। 4 दिनों में व्यापक धोने के लिए एक विकल्प के रूप में जर्म कोशिकाओं दिन 3 27 पर hypotonic उपचार द्वारा हटाया जा सकता है। इस पद्धति का एक लाभ यह है कि Sertoli सेल संस्कृति के समय कम से कम रखा जाता है, ताकि Sertoli सेल विशिष्ट कार्यों के संभावित बेहतर हो रहा है संस्कृति की एक लम्बी अवधि के बाद से बनाए रखा।

(चित्रा 5 ब) के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है> 95% है। क्योंकि peritubular कोशिकाओं एक मजबूत proliferative क्षमता है, Sertoli सेल संस्कृति सीरम के अभाव में प्रदर्शन किया जा रहा है। 10% की उपस्थिति में सीरम पीटीसी संस्कृति के 6 दिन बाद सभी कोशिकाओं के लगभग 20% का गठन जबकि उसके अंश सीरम 7 के अभाव में 1% से नीचे होने की उम्मीद की जा सकती जाएगा। (नहीं दिखाया गया है) के रूप में Trypan नीले धुंधला द्वारा न्याय लगभग सभी अलग-थलग Sertoli कोशिकाओं व्यवहार्य हैं। संस्कृति के 7 दिन के आसपास अलग Sertoli कोशिकाओं से कम, जर्म कोशिकाओं और peritubular कोशिकाओं (चित्रा 4) के साथ दूषित कर रहे हैं ताकि प्रयोगों यदि संभव हो तो इस दिन के आसपास किया जाना चाहिए। अच्छा reproducibility के लिए यह प्रयोग को दोहराने के लिए महत्वपूर्ण हैसंस्कृति के एक ही दिन में हमेशा से रहा है। transfections की योजना बनाई रहे हैं, तो वे दिन 4 या 5 पर किया जाना चाहिए, और सेल के अर्क दिन 5 या 6 पर बनाया जाना चाहिए।

सीरम मुक्त शर्तों Sertoli कोशिकाओं में कम से कम दो सप्ताह से अधिक एफएसएच के लिए उत्तरदायी होते हैं और अधिक एण्ड्रोजन बाध्यकारी प्रोटीन, plasminogen उत्प्रेरक और transferrin एफएसएच उपचार पर उत्पादन। अब संस्कृति के लिए peritubular कोशिकाओं या सीरम के एक फीडर परत की आवश्यकता है। चार सप्ताह के बाद संस्कृतियों बिगड़ना, और कोशिकाओं बुनियाद 7 से अलग।

संस्कृति सबसे Sertoli कोशिकाओं के 6 दिन लिपिड बूंदों हासिल कर ली है। कोशिकाओं के बहुमत में एक बड़ी रिक्तिका का गठन किया है (चित्रा 5C और 5 डी)। तटस्थ लिपिड सामग्री को आसानी से तेल लाल हे धुंधला (चित्रा 4F) द्वारा देखे जा सकते हैं।

Sertoli सेल के अलावा रास हटा पीटीसी के रूप में अच्छी तरह से संवर्धित किया जा सकता है (चित्रा -4 ए और 4 बी)। 10 वृषण से पीटीसी पांच T75 बोतल है कि संस्कृति के 2 दिनों के बाद मिला हुआ परत के रूप में उम्मीद की जा सकती निकलेगा। पृथक Sertoli कोशिकाओं की तरह हौसले से अलग पीटीसी रोगाणु कोशिकाओं है कि काफी हद तक passaging द्वारा हटाया जा सकता द्वारा दूषित कर रहे हैं। मानक trypsinization द्वारा 2 इतना है कि 10 बोतल अलगाव के बाद 5 दिन पर मिला हुआ होना होगा: बोतल 1 विभाजित कर रहे हैं। पृथक पीटीसी की पवित्रता> 95% है और α चिकनी पेशी actin immunolabeling (चित्रा 5 ए) का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है। इस दिन के बाद से पीटीसी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक फ्लास्क लगभग एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है, और कुओं अगले दिन मिला हुआ होना चाहिए। प्रकोष्ठों कई बार passaged किया जा सकता है, लेकिन प्रयोगों आदेश में यकीन है कि कोशिकाओं को एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से व्यवहार बनाने के लिए एक ही मार्ग पर हमेशा किया जाना चाहिए।

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चित्रा 1. वृषण और प्रक्रिया के कार्यप्रवाह की आकृति विज्ञान। (ए) से सटे मध्य ऊतक के साथ एक बीजदार छोटी नली के एक क्षेत्र रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है। बीजदार नलिकाओं एक बेसल झिल्ली (बीएम) और myoid peritubular कोशिकाओं (पीटीसी) की एक परिधीय परत से घिरा रहे हैं। कीटाणु उपकला बेसल झिल्ली की luminal ओर स्थित है। Sertoli कोशिकाओं (अनुसूचित जाति), पूरे कीटाणु उपकला फैले जोरदार बी.एम. से जुड़ी है और basolateral तैनात occluding खून-वृषण बाधा (बीटीबी) का प्रतिनिधित्व जंक्शनों के माध्यम से जुड़े रहते हैं। उनके अनियमित नाभिक (एन) के एक या एक से अधिक विदर की तरह indentations पता चलता है और एक न्यूक्लियस होता है। जर्म कोशिकाओं (जीसी) उनके विकास के सभी चरणों में अनुसूचित जाति के साथ घनिष्ठ संपर्क में हैं। नलिकाओं के बीच मध्य डिब्बे में इस तरह के मैक्रोफेज (MΦ) के रूप में Leydig कोशिकाओं (नियंत्रण रेखा) और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ ही रक्त वाहिकाओं (बीवी) शामिल हैं। आकृतिFijak और Meinhardt 28 से अनुकूलित। (बी) प्रक्रिया के कार्यप्रवाह; (ए)। में की तरह रंग कोडिंग है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Wistar चूहों से वृषण excised और decapsulated रहे हैं। (ए) पेरिटोनियल गुहा पाठ में वर्णित के रूप में एक अनुदैर्ध्य चीरा के माध्यम से खोला जाता है। तारांकित (*) epidydimal वसा पैड इंगित करता है। (बी) वृषण वृषण रज्जु और (सी) एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 20 मिलीलीटर पीबीएस युक्त ट्यूब में एकत्र काटने से हटा रहे हैं। जब सभी वृषण एकत्र किया गया है कि वे 1% (w / v) इथेनॉल में आयोडीन की 20 मिलीलीटर में कीटाणुरहित कर रहे हैं। आयोडीन के हटाने के लिए वे जल्दी से 25 मिलीलीटर के साथ दो बार धो रहे हैंपीबीएस प्रत्येक। (डी) पहले पीबीएस धोने के बाद वृषण। (ई) वृषण एक पेट्री डिश (दाईं ओर) को स्थानांतरित कर रहे हैं, और बीजदार नलिकाओं (बाईं ओर) बंद कैंची ब्लेड के माध्यम से खोला Tunica धवल से बाहर निचोड़ा हैं पाठ में वर्णित है। (एफ) Decapsulated वृषण अभी भी एकल नलिकाओं फैला हुआ के साथ एक कॉम्पैक्ट अंडकोष के आकार का बड़े पैमाने के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Sertoli कोशिकाओं के अलगाव। (ए) पीबीएस नलिकाओं के साथ trypsin-DNase मैं पाचन और वाशिंग 9x द्वारा मध्य कोशिकाओं को हटाने के बाद जुटाए बनने के लिए और साफ लग रही है। (बी) सेल peritubular कोलैजिनेज़-hyaluronidase-DNase मैं उपचार के दौरानबाहरी परत और रोगाणु कोशिकाओं से रों जारी कर रहे हैं। नलिकाओं छोटा और किसी न किसी शक्ल में प्राप्त हो जाते हैं। (सी) पीबीएस के साथ 4x धोने के बाद ट्यूबलर टुकड़े। (डी) hyaluronidase-DNase मैं उपचार विज्ञप्ति अवशिष्ट peritubular कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से रोगाणु कोशिकाओं। नलिकाओं आगे छोटा हो, और ट्यूबलर समुच्चय के रूप में। (ई) ट्यूबलर पीबीएस के साथ 4x धोने के बाद समुच्चय। (एफ) एकल Sertoli कोशिकाओं एक 18G सुई के माध्यम से समुच्चय 10x गुजर द्वारा उत्पादित कर रहे हैं। में (एई) स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन, (च) = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Peritubular कोशिकाओं की चित्रा 4. संस्कृति (एबी) और Sertoli कोशिकाओं (सीएफ) और contaminat को हटाने के आईएनजी रोगाणु कोशिकाओं। (ए) 4.5 कदम से resuspended पीटीसी तुरंत वरीयता प्राप्त और अगले दिन फोटो खींच रहे थे। (बी) पर रोगाणु कोशिकाओं के साथ दिन में 3 संदूषण बंटवारे के बाद कम हो जाता है। (सी) 4 दिन Sertoli कोशिकाओं पर एक ठेठ पत्थर की तरह पैटर्न दिखा। फ्लोटिंग और पालन जनन कोशिकाओं पीबीएस के साथ धोने से पहले दिखाई दे रहे हैं। (डी) एक ही अच्छी तरह से पीबीएस के साथ 3x धोने के बाद। दूषित रोगाणु कोशिकाओं की संख्या कम है। पीबीएस के साथ तीन बार धुलाई दिवस 6 संस्कृति के लगभग सभी रोगाणु कोशिकाओं को हटा दिया गया है पर दिन 5 और 6 (ई) पर दोहराया है। Sertoli कोशिकाओं को एक अनूठी लग सेल परत का गठन किया है, और सबसे कोशिकाओं एक बड़ी रिक्तिका हासिल कर ली है। (एफ) तेल लाल हे धुंधला से पता चलता है कि इन रिक्तिकाएं लिपिड काफी हद तक तटस्थ लिपिड युक्त बूंदों हैं। (ई) = 200 माइक्रोन, में (ई) = 50 माइक्रोन में और में (एफ) स्केल सलाखों = 25 माइक्रोन।.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Actin (चिकनी मांसपेशी) एंटीबॉडी (ए) के साथ शुद्ध प्राथमिक peritubular कोशिकाओं की चित्रा 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। धुंधला और vimentin एंटीबॉडी (बी) के साथ Sertoli की कोशिकाओं। कोई दूषित कोशिकाओं को देखने के दोनों क्षेत्रों में दिखाई दे रहे हैं। (ए) और (बी) में स्केल बार 10 माइक्रोन =। (सी) और संस्कृति में 4 दिनों के बाद Sertoli कोशिकाओं (डी) इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म तस्वीरें। (सी) नोट आसन्न कोशिकाओं (तीर) के रूप में है कि चित्रा 4C में देखा पत्थर की तरह पैटर्न की ओर जाता है के निकट संपर्क। एक एकल लिपिड छोटी बूंद (एल) प्रत्येक कोशिका के कोशिका द्रव्य में मनाया जाता है। (डी) सबसे प्रचुर मात्रा में अंगों माइटोकांड्रिया (एम) और Golgi उपकरण (G) कर रहे हैं।नाभिक (एन) के एक न्यूक्लियस (नेकां) में शामिल है और ठेठ विदर की तरह खरोज पता चलता है। (सी) = 1 माइक्रोन में स्केल बार और (घ) = 0.25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों गुइडो वर्होएवन और लूडो Deboel, लोवेन, जो Giessen में Meinhardt प्रयोगशाला में प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं के अलगाव स्थापित करने में बेहद मददगार थे शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। मोनिका Fijak, Giessen, चित्रा 1 ए और सलाह के साथ उसकी मदद के लिए स्वीकार किया है। अध्ययन अनुदान बिहार 93 / 1-1 (एसबी) और अंतरराष्ट्रीय अनुसंधान स्नातकोत्तर महाविद्यालय JLU Gießen (जर्मनी) / मोनाश विश्वविद्यालय (मेलबोर्न, ऑस्ट्रेलिया) GRK 1,871 (एसबी) के धन के माध्यम से ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित थे। समर्थन भी कार्यक्रम 'लैंडेस आक्रामक सूर Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz "(LOEWE)" Männliche Infertilität bei Infektion और Entzündung "(MIBIE) नामक भीतर हेसन के राज्य का अनुदान से प्राप्त हुई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized
Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 
Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)
Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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