Vand i olie Emulsioner: Et nyt system til samling Vandopløselige klorofyl-bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter

Chemistry
 

Summary

Dette håndskrift beskriver en enkel og høj-throughput fremgangsmåde til samling vandopløselige proteiner med hydrofobe pigmenter, der er baseret på vand-i-olie emulsioner. Vi viser effektiviteten af fremgangsmåden til samling af native chlorophyller med fire varianter af rekombinant vandopløseligt-klorofyl proteiner (WSCPs) af Brassica planter udtrykt i E. coli.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chlorophyll (Chl'er) og bakteriochlorophyler (Bchl'er) er de primære cofaktorer, der udfører fotosyntetiske lys høst og elektron transport. Deres funktionalitet kritisk afhænger af deres specifikke organisation inden for store og kunstfærdige multisubunit transmembrane protein komplekser. For at forstå på molekylært niveau, hvordan disse komplekser lette solenergi konvertering, er det vigtigt at forstå protein-pigment, og pigment-pigment-interaktioner, og deres virkning på ophidset dynamik. En måde at få en sådan forståelse er ved at konstruere og studere komplekser af Chl'er med enkle vandopløselige rekombinante proteiner. Imidlertid omfatter de lipofile Chl'er og Bchl'er til vandopløselige proteiner er vanskelig. Desuden er der ingen generel fremgangsmåde, der kan anvendes til samling af vandopløselige proteiner med hydrofobe pigmenter. Her udviser vi en enkel og højt gennemløb baseret på vand-i-olie emulsioner, som muliggør røvembly af vandopløselige proteiner med hydrofobe Chl'er. Den nye metode blev valideret ved samling af rekombinante versioner af den vandopløselige klorofyl bindingsprotein af Brassicaceae planter (WSCP) med Chl a. Vi viser den vellykkede samling af Chl en bruger rå lysater af WSCP udtrykker E. coli-celle, som kan bruges til at udvikle en genetisk screen system til hidtil ukendte vandopløselige Chl-bindende proteiner, og til undersøgelser af Chl-protein interaktioner og samleprocesser.

Introduction

Hydrofobe pigmenter såsom chlorophyller (Chl'er), bakteriochlorophyler (Bchl'er) og carotenoider er de primære cofaktorer i fotosyntetiske reaktion centre og lette høst proteiner, der udfører elektron transport, og lysenergi opsamling og overførsel. Reaktionsbetingelserne centre og de fleste af de Chl-bindende lette høst komplekser er transmembrane proteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein af ikke-oxy- fotosyntetiske grønne svovlbakterier 1,2, og peridinin-Chl protein (PCP) af dinoflagellater 3 er ekstraordinære eksempler på vandopløselige lys høst proteiner. De vandopløselige klorofyl bindende proteiner (WSCPs) af Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae og Amaranthaceae planter 4, 5 er en anden enestående eksempel, men i modsætning til FMO og PCP, disse er hverken involveret i lys høst eller i nogen af de primære fotosyntetiske reaktion og deres præcise grafisiological funktioner er endnu uklart 5-8. Deres høje Chl-bindende affinitet har ført til en foreslået funktion som forbigående bærere af Chl'er og Chl derivater 9,10. Alternativt blev det hypotese, at WSCP spiller en rolle i indfangning Chl'er i beskadigede celler og beskytter mod Chl-induceret photooxidative skade 7,11-13. For nylig blev det foreslået, WSCP fungerer som en proteaseinhibitor og spiller en rolle under planteæder resistens samt regulerer celledød under blomst udvikling 14. WSCPs er opdelt i to hovedklasser efter deres fotofysiske egenskaber. Den første klasse (klasse I, f.eks. Fra Chenopodium album) kan undergå fotokonvertering på belysning. Klasse II WSCPs fra Brassica planter, der ikke undergår fotokonvertering 5,10, er yderligere opdelt i klasse IIa (f.eks. Fra Brassica oleracea, Raphanus sativus) og IIb (f.eks. Fra Lepidium virginicum Lepidium virginicum blev løst ved røntgenkrystallografi på 2,0 Å opløsning 8. Det afslører en symmetrisk homotetramer hvor proteinet underenheder danner en hydrofob kerne. Hver underenhed binder et enkelt Chl som resulterer i en stram arrangement af fire tæt pakkede Chl'er inden for de core.This simpel alle Chl arrangement gør WSCPs et potentielt nyttigt modelsystem til undersøgelse binding og samling af Chl-protein-komplekser, og virkningerne af tilstødende Chl'er og protein miljøer på de spektrale og elektroniske egenskaber af individuelle Chl'er. Endvidere kan det give skabeloner til konstruktion af kunstige Chl-bindende proteiner, der kan anvendes til let høst moduler i kunstige fotosyntetiske enheder.

Grundige undersøgelser af native WSCPs ikke er mulig, fordi komplekserne oprenset fra planter altid indeholde en heterogen blanding af tetramerer med forskellige kombinationer af Chl aog Chl B 9. Således kræves der en fremgangsmåde til samling rekombinant udtrykt WSCPs med Chl'er in vitro. Dette udfordres af den ubetydelige vandopløselighed Chl'er hvilket gør det umuligt at samle komplekset in vitro ved simpelthen at blande de vandopløselige apoproteiner med pigmenter i vandige opløsninger. In vitro samling ved blanding af apoproteiner med thylakoid membraner 15 blev påvist, men denne fremgangsmåde er begrænset til det native Chl'er stede i thylakoider. Schmidt et al. rapporteret om at samle flere Chl- og BChl derivater med WSCP fra blomkål (CaWSCP) ved rekombinant udtrykker et histidin-mærket protein i E. coli immobilisere det på en Ni-affinitetssøjle og indføre Chl- derivater solubiliseret i vaskemidler 11. Succesfuld rekonstitution af rekombinante WSCPs fra A. thaliana 6, og rosenkål (BoWSCP), japansk kiddike (RshWSCP) etd Virginia pepperweed (LvWSCP) ved en lignende metode blev også rapporteret.

Her præsenteres en roman, generelt enkel metode til samling Chl'er med WSCP, der ikke kræver tagging eller immobilisere proteinerne. Den er afhængig af at forberede emulsioner fra deres vandige opløsninger af de vandopløselige apoproteiner i mineralolie. Proteinerne er således indkapslet i vand-i-olie (W / O) mikrodråber med meget højt overfladeareal til volumenforhold 16. De hydrofobe cofaktorer derefter opløst i olien og kan let indføres i de små dråber fra oliefasen. Vi rapporterer om anvendelse af metoden til samling af flere varianter af WSCP apoproteiner rekombinant udtrykt i E. coli med Chl a. Vi viser samlingen fra råt lysat af WSCP overudtrykker bakterier, som kan anvendes som en screening system for udvikling af hidtil ukendte Chl- bindende proteiner.

Protocol

1. Forberedelse Chl a Stock Solutions

  1. Kritiske trin: Udfør alle trinnene klorofyl præparat i en kemisk hætte, under grønt lys (520 nm) eller i mørke for at minimere lysbeskadigelse. Altid tilføje nitrogen eller argon før frysning pigmenter til opbevaring. Sørg for, at alle opløsningsmidler er analytisk kvalitet.
  2. Afvej ca. 5 mg lyofiliserede Spirulina platensis celler eller andre cyanobakterien celler indeholdende kun Chl a i thylakoid membraner og knuse den med en morter og støder.
  3. Indlæse knuste celler på en glaskolonne og vask med ca. 50-100 ml 100% acetone for at fjerne carotenoider. Kassér den eluerede orange / grøn fraktion.
    Bemærk: Hvis den orange fraktion ikke elueres med 100 ml acetone fortsætter vaske cellerne med acetone indtil grøn fraktion begynder at eluere.
  4. Exchange acetone med 100% methanol og indsamle den grønne fraktion, der indeholder Chl a. Volumenet af elueret FRACTion kan variere mellem 50-100 ml. I begyndelsen, den eluerede fraktion har en mørkegrøn farve, som ændrer sig til lysegrønne i slutningen af ​​eluering. Når farven af ​​elueret fraktion bliver til lysegrønne stoppe elueringen.
  5. Inddamp methanol under anvendelse af en rotationsfordamper, indtil ekstrakten er helt tørt. Må ikke anvendes varme til opløsningen; sikre, at fordamperens vandbad temperaturen ikke overstiger 30 ° C.
    Bemærk: Tidspunktet for fordampning afhænger af mængden af ​​methanol fraktion bliver fordampet og kan variere mellem 10-60 min. Det er vigtigt at tørre ekstrakten fuldstændigt.
  6. Opløs pigmenterne fra den tørrede ekstrakt i et lille volumen diethylether (ca. 5-10 ml) og filtreres gennem vat. Sørg for, at pigmenter er fuldstændig opløst i ether før filtrering.
  7. Inddamp diethylether, indtil pigmenterne er helt tørre (10-30 min).
    Bemærk: De tørre pigmenter kan renses med og holdes under nitrogen eller argon ved -20 ° C, i mørke, indtil yderligere bearbejdning.
  8. Opløs de tørre pigmenter i den mindst mulige af 100% methanol (ca. 1 ml) volumen, selv om ikke alt er fuldstændigt suspenderet. Tilsæt 4 ml acetone til opløsningen, og bladre glasset forsigtigt for at opløse pigmenterne.
  9. Ved hjælp af en Pasteur-pipette, indlæse prøven forsigtigt på en søjle af DEAE Sepharose bragt i ligevægt i 100% acetone.
  10. Eluer carotenoider (en orange-gul band) med 100% acetone. Derefter elueres Chl a (grønt bånd) med 3: 1 volumen / volumen acetone / methanolblanding.
    Bemærk: Mængden af ​​acetone og acetone / methanolblanding er omtrent ækvivalent med volumenet af DEAE Sepharose sat på søjlen.
  11. Verificere Chl en renhed ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af en 68: 25: 5: 2 dichlormethan / n-hexan / isopropanol / methanol (v / v) blanding som eluent 17.
  12. Opløsningsmidlet afdampes på en rotationsfordamper, indtil Chl a er helt tørt (10-60 min).
    Bemærk: Det tørre Chl a kan renses med nitrogen eller argon og opbevaret under argonatmosfære ved -20 ° C i mørke.
  13. Forbered Chl en stamopløsning ved genopløsning af det tørre Chl a i 2-4 ml 100% ethanol.
    Bemærk: Ekstinktionskoefficienten af Chl a ved 663 nm er 74,400 cm-1 M-1 (83,3 cm-1 (mg / ml) -1) i ethanol. En typisk stamopløsning bør have en OD på 1.860 svarende til en koncentration på 25 mM (23 mg / ml). Tilsætning af 20 pi af denne bestand til en emulsion indeholdende 5 ml af organisk fase, og 1 mg WSCP i 1 ml resultater vandig fase i en blanding med 10 gange molært overskud af Chl a vs. WSCP.

2. Forberedelse organiske fase af emulsionen

Bemærk: Den organiske fase af emulsionen er sammensat af mineralolie indeholdende 4,5% (v / v) Span 80 og 0,4% (v / v) Tween 80.

  1. Afvej i et 50 ml rør 0,2 g tween 80, 1,8 g Span 80, og 38 g mineralolie. Bland godt alle komponenter og køle ned på is.
    Bemærk: Den organiske fase kan opbevares i 4 ° C op til en uge.

3. Forberedelse af vandige fase af emulsion

Bemærk: Den vandige fase af emulsionen kan sammensættes af enten oprenset WSCP, eller rå ekstrakt af bakterier overudtrykker WSCP.

  1. Fremstilling af en vandig fase indeholdende oprenset WSCP.
    1. Grow E.coli BL21 bakterier indeholdende WSCP plasmid 12 i 1 liter LB-medium ved 37 ° C indtil OD på 0,3-0,6.
    2. Inducerer proteinekspression ved tilsætning af 1 mM IPTG. Efter induktion vokse bakterier ved 30 ° C i 12-16 timer.
    3. Harvest bakterier ved centrifugering ved 5000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
    4. Pellet opløses i bindingsbuffer og soniker på is (30 sek på, 15 sek off, fem gange). Brug 10 ml buffer til pelleten opnået fra centrifugering af 250 mlLB-medium med celler, der overudtrykker protein.
      Bemærk: Afhængig af rensningsmetode kan bindingspuffer være sammensat af 100 mM phosphatbuffer, pH 7,2 eller 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
    5. Spin ned cellelysatet ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
    6. Oprens WSCP ved affinitetskromatografi. Afhængigt tagget fusioneret til WSCP, oprense rekombinante proteiner ved anvendelse af passende kommercielt tilgængelige affinitetschromatografisystem til proteinoprensning efter producentens instruktioner.
    7. For emulsion fremstilling, brug oprenset WSCP i 50 mM phosphatbuffer, pH 7,8. Sørg for, at det endelige protein mængde, der anvendes til rekonstitution er 0,5-1,0 mg pr 1 ml buffer.
  2. Fremstilling af en vandig fase indeholdende råt bakterielysat med WSCP.
    1. Grow E.coli BL21-celler indeholdende plasmid-udtrykkende WSCP i 250 ml LB-medium ved 37 ° C indtil OD 0,3-0,6.
    2. Inducere proteinekspression med1 mM IPTG og vokse bakterier natten over ved 30 ° C.
    3. Harvest bakterieceller ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
    4. Pellet opløses i 1-2 ml 50 mM natriumphosphatpuffer pH 7,8, lydbehandles (30 sec på, 15 sec off, tre gange) og centrifugeres ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
    5. Forbered vandige fase af emulsionen ved blanding 0,125 ml supernatant med 0,875 ml 50 mM natriumphosphatpuffer pH 7,8.

4. Montering af WSCP med Chl en i Emulsion

  1. Transfer 5 ml olie-overfladeaktivt blandingen i en glasbeholder og afkøles på is. Før pipettering, kontrollere, at alle komponenter i den organiske fase blandes grundigt, og der er ingen faseadskillelse mellem overfladeaktive stoffer og mineralsk olie.
  2. Tilsæt 1 ml iskold vandige fase forberedt som i afsnit 3 til 5 ml organiske fase.
  3. Bland begge faser ved anvendelse af en vævshomogenisator i 2 minutter ved 9.500 rpm på is.
  4. KRITISK STEP: Fra denne fase på, udføre alle yderligere skridt under grønt lys (520 nm) for at minimere solskader. Tilsæt 20 pi 25 mM Chl en stamopløsning (se afsnit 1.13) til emulsionen. Disperse ved at svirpe og vende hætteglasset. Sørg for, at Chl jævnt fordelt i emulsionen.
  5. Inkubér emulsionen i 1-2 timer på is i mørke.
  6. For at nedbryde emulsionen og separate vanddråber fra den organiske fase overføre emulsionen til 1,5 ml plastrør og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: Hvis samlingen er en succes, skal den nedre vandige fase har en grøn farve.
  7. Bortskaffe den øvre oliefase og tilsættes 1 ml mineralolie. Bland godt mineralolien med det pelleterede emulsionen ved vortex eller ved at vende røret grundigt. Spin ned prøven ved 14.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag dette trin, indtil en klar menisk adskille vandige og minearbejderal oliefaser uden mellemtrin emulsion er opnået.
  8. Udfør dette trin i en kemisk hætte. Efter de vandige og mineralolie faserne er klart adskilt, fjerne mineralolie og tilsæt 1 ml vandmættet diethylether. Vortex og spin ned prøven ved 14.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag dette trin to gange.
  9. Efter den anden centrifugering, fjerne diethylether og lade rørene åbne for 5-20 minutter i hætten.
  10. Endelig indlæse den vandige fase, der indeholder WSCP / Chl et kompleks på en afsaltningskolonne og der elueres med puffer egnet til yderligere eksperimenter.
    Bemærk: Proteinet er stabilt i fosfat- og Tris buffere i en bred vifte af pH (6,0-7,5). Prøven kan opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys op til en måned.

Representative Results

Rekombinante WSCP apoproteiner blev samlet med Chl a i W / O-emulsioner ifølge protokollen beskrevet i det tidligere afsnit. Protokollen blev implementeret under anvendelse af vandige faser indeholdende enten rene WSCPs eller lysater E. coli-celler, der overudtrykker WSCP (figur 1). Protokollen er enkel, hurtig og ikke kræver særligt udstyr undtagen en vævshomogenisator.

Absorbansen og CD spektre af Chl a komplekser af fire rekombinante WSCP varianter, nemlig RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP og LvWSCP er vist i figur 2. Disse svarer i band form og placering til tidligere rapporterede spektre af de respektive native komplekser 10,18, 19. Disse resultater viser klart, at WSCP / Chl komplekser rekonstitueret i W / O-emulsion systemet ligner de native komplekser.

E. coli-celler, der udtrykker WSCPs anvendes som den vandige fase af emulsionen. Lysater af bakterier, som ikke udtrykte WSCPs blev anvendt som negativ kontrol. Positive samling af WSCP med Chl a let observeret af den grønne farve af den vandige fase, men kun i lysater af WSCP udtrykkende celler (figur 3). Dråber indeholder disse lysater har særskilte Chl en fluorescens i konfokalt mikroskop billeder. Dette indebærer, at en vellykket samling af WSCP / Chl komplekser kan detekteres direkte i vanddråberne, som kan danne grundlag for W / O-emulsion-baserede screening-systemer.

figur 1
Figur 1: Montering af WSCP med Chl'er i W / O-Emulsioner (A. E. coli-cellelysater udtrykker WSCP. Når emulsionen er klar, er Chl'er tilsættes til emulsionen. Efter rekonstitution er vanddråber separeres fra organiske fase ved centrifugering. (B) W / O-emulsion system kan anvendes til hurtig og high throughput screening for positive rekonstitution af WSCPs med Chl'er. Kan påvises fluorescensen af WSCP / Chl-komplekset direkte fra vandet mikrodråberne ved en konfokal mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Absorbans og CD spektre af WSCP / Chl a Komplekser apoproteiner på fire.WSCP varianter blev rekonstitueret med 10-fold molært overskud af Chl a. Absorbansen spektre (a) blev normaliseret til 1 ved 673nm for BoWSCP (sort), CaWSCP (grøn), og RshWSCP (blå) og 663nm til LvWSCP (rød). De samme normaliseringsfaktorer blev påført på CD'en (b). Gengivet med tilladelse fra 16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Scanning Fluorescence Microscopy og Visual Screening af WSCP / Chl Complex Assembly (A) SDS-PAGE af E.. coli BL21 cellelysater før og efter rekonstitution med Chl en i W / O-emulsioner. Bane 1: BL21 celler uden WSCP plasmid, bane 2: BL21 celler med WSCP plaSmid uden induktion ved IPTG, bane 3: BL21 celler med WSCP plasmid induceret med IPTG. Bane 4, 5 og 6 er de samme prøver som bane 1, 2 og 3, henholdsvis, men efter udskillelse af vand-fase fra den organiske fase af emulsionen. Små portioner af hver prøve blev kørt på en SDS-proteingel. Lane M: protein størrelse markør. Billeder af prøverne før og efter faseadskillelse er vist på toppen af ​​hver bane. (B) konfokalt mikroskop billeder af W / O dråber fremstillet med Chl a i olie-fase. Dråberne på venstre billede ikke indeholder protein mens dem på det rigtige billede indeholdt WSCP protein. Fluorescens blev overvåget ved 682 nm. Gengivet med tilladelse fra 16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vores mål var at udvikle et nyt generelt system til samling af vandopløselige klorofyl-bindende proteiner med hydrofobe pigmenter. Her er det vist, at det nye rekonstituering baseret på W / O-emulsion er en generel indstilling vist sig at arbejde til samling af WSCP apoproteiner fra rosenkål, blomkål, japansk peberrod og Virginia pepperweed rekombinant udtrykt i E. coli. Her er præsenteret fra rekonstituering af 1 mg WSCP med 10-fold molært overskud af Chl a. Men det er også muligt at anvende lavere koncentrationer af WSCP for rekonstitutioner og forskellige Chl- / protein molforhold. Den mindste mængde af protein, som vi var i stand til at samle i W / O-emulsioner var 100 ug, mens pigmentet til protein-forholdet kunne variere fra 5: 1 og op til 20: 1. Også kunne vandigt rumfang sænkes ned til 50 pi. I dette arbejde samlingen af WSCP med Chl en præsenteres. Det er dog også muligt at samleWSCP med andre hydrofobe Chl'er, Bchl'er og deres derivater. I øjeblikket er vi tester vores system med andre vandopløselige pigment-bindende proteiner såsom FMO og PCP.

Selv om vores metode er hurtig og enkel der er nogle kritiske trin, der skal overvejes i løbet af W / O forberedelse og rekonstituering af WSCP med Chl. De hætteglas, der anvendes til emulsion forberedelse, skal være rene og fri for detergent. Selv små spor af detergenter i hætteglas vil påvirke emulsionen forberedelse og resultere i lav kvalitet af emulsion. Desuden bør hætteglassene være helt tørt. Andre afgørende skridt, som kan påvirke rekonstitueringseffektiviteten, er grundigt spredning af Chl i organiske fase emulsion. Derfor er det vigtigt fuldt blande en lille mængde af Chl i 5 ml emulsion. Det er også vigtigt at gøre så mange trin som nødvendigt for at nedbryde emulsionen og helt fjerne mineralolie fra vandfasen. Eventuelle spor af mineralolie i vand phase kunne påvirke yderligere forsøg.

W / O-emulsion er en alternativ fremgangsmåde til den metode fastlagt af Schmidt et al. 11, som var baseret på immobilisering His-mærket WSCP på kromatografisøjle affinitet og inkubering med Chl'er. Selv om fremgangsmåden ifølge Schmidt et al., Viste sig at arbejde for forskellige WSCPs, kræver det His-mærkede proteiner, og kan resultere i ikke-specifik binding af Chl'er ved ligering til histidiner af tagget. Endvidere immobilisering af proteiner på en fast overflade kan påvirke proteinstruktur, hvilket påvirker samleprocessen med pigmenter. Desuden blev Chl, som blev anvendt til samling af WSCPs i dette system opløst enten i buffer indeholdende detergenter eller 40% methanol 11,12. Sådanne opløsningsmidler kan medføre pigment aggregering og / eller uspecifik Chl binding til WSCP. Vores nye rekonstituering system baseret på W / O-emulsion ikke stole på immobilisering af proteinerne til fast underlag. therefore, er ingen oprensning tag fusioneret til WSCPs påkrævet, og rekombinante proteiner med nativ sekvens kan samles. En anden vigtig fordel ved W / O metoden er at minimere pigmenter aggregering, der kan påvirke rekonstitueringseffektivitet, oligomerisering og pigment / protein støkiometri. Dette skyldes de hydrofobe pigmenter opløses i oliefasen og deres anbringelse W / O smådråber er aktiveret af højt overfladeareal til volumen-forholdet af sidstnævnte. Endvidere uspecifik binding af Chl'er efter WSCP omgås eftersom hydrofobe pigmenter ikke kan diffundere mellem organiske og vandige faser af emulsionen. Kun pigmenter, som aktivt samlet af WSCP ved rekonstituering kan træde i vandet mikrodråberne i emulsionen.

Fremgangsmåden til samling af WSCP med pigmenter ved blanding WSCP med isolerede thylakoider 10 svarer til W / O-emulsion systemet præsenteres her. Det kræver detergenter eller organiske opløsningsmidler til solubilizing de Chl'er, eller tagging proteinerne. Imidlertid kan W / O metoden bruges med alle pigmenter, der er opløselig i oliefasen mens den tidligere fremgangsmåde er begrænset til Chl'er som er indbygget stede i thylakoid membraner. Således er det muligt forsamling med ren Chl a eller Chl d fra, fordi disse er tilgængelige fra cyanobakterielle thylakoider på f.eks. Synechocystis PCC 6803 eller Acaryochloris marina, hhv. Imidlertid er det ikke muligt at rekonstruere WSCP med Chl B Siden dette pigment altid ledsages af Chl a i thylakoider. Derimod kan WSCP forsamling i W / O-emulsion testes med fysiske eller kunstige Chl, BChl eller porphyrinderivater. Det kræver ikke at bruge fotosyntetiske membraner, og det er dermed fri for indblanding af ekstra-membran komponenter såsom fykobilisom, der kan knyttes til cyanobakterielle membraner. W / O metoden er kun begrænset af opløseligheden af ​​pigmenter i oliefasen etnd derfor velegnet til WSCP forsamling med fysiske eller kunstige Chl, BChl eller porphyrinderivater.

Sammenfattende vi præsenteres her en generel fremgangsmåde til samling vandopløselige proteiner med hydrofobe pigmenter. Dens fordele af blev påvist ved den vellykkede samling af Chl en med forskellige rekombinante WSCPs fra Brassica planter tydeligt angivet ved spektroskopiske og biokemiske resultater. Desuden har vi vist, hvordan den W / O-enhed protokol kan bruges til hurtig screening af WSCP / Chl kompleks samling ved hjælp af E. coli-cellelysater overudtrykker rekombinante WSCPs og rå Chl- ekstrakter. På denne måde kan vi springe tidskrævende protein oprensningstrin og behovet for at bryde emulsioner for at adskille vanddråberne fra den organiske fase kan også undgås ved hjælp af fluorescensmikroskopi for direkte at visualisere konstruktionen i vanddråber. Den generelle anvendelighed af den nye metode gør det en brugful værktøj til at studere co-faktor binding og montering, samt energi- og elektron overførsel mekanismer i transmembrane protein-cofaktor komplekser ved at designe og konstruere deres forenklede kunstige vandopløselige protein-analoger.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

DN anerkender støtte fra EU FP7-projekter PEPDIODE (GA 256.672) og REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), og en personlig forskningsbevilling (nr 268/10) fra Israel Science Foundation. Vi takker Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering og Applied Sciences, Harvard University, Cambridge MA, USA for at træffe de konfokale mikroskopi billeder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
  2. Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
  3. Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
  4. Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
  5. Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
  6. Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
  7. Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
  8. Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
  9. Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
  10. Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
  11. Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
  12. Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
  13. Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
  14. Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
  15. Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
  16. Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
  17. Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
  18. Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
  19. Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics