ضبط عمود مقطع التدفق الموازي وتمكين الكشف المضاعفة

1School of Science and Health, University of Western Sydney
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

أعمدة تكنولوجيا تدفق النشطة

تم تطوير تكنولوجيا تدفق النشطة (AFT) الأعمدة اللوني مؤخرا للتغلب على عدم الكفاءة في فصل المرتبطة تدفق التجانس 1-6، وكذلك لتمكين الكشف المضاعفة. في هذا بعينه نحن الاتصالات بالتفصيل عملية التشغيلية للبالتوازي مجزأة تدفق (PSF) عمود مع الكشف عن المضاعفة. المزايا الوظيفية الرئيسية للعمود PSF هي: (1) يتم عزل التدفق من المنطقة الوسطى شعاعي من السرير العمود من المنطقة الطرفية أو جدار التدفق، (2) حجم الطور المتحرك التي يجب معالجتها بواسطة الكشف يتم تقليل المصدر، ويمكن المضاعفة مصادر (3) كشف لتوسيع المعلومات عينة من دون غرس التأخير كشف عبر كل عملية الكشف، أو في وقت لاحق يستلزم تقسيم عمود آخر تيار تدفق 7،8. السمة الرئيسية في تصميم العمود PSF تمكن لdvantage الكشف المضاعفة هي منفذ التجمع المناسب وفريت رواية الشكل 1 هو صورة من العمود الخلف مقارنة العمود التقليدي. من المهم أن نفهم أن عملية تقسيم الحصول عليها باستخدام أعمدة تدفق مجزأة موازية ليست هي نفسها كما تدفق تيار عمود آخر تقسيم. في تيار تدفق عمود آخر تقسيم كامل الفرقة عينة من حافة الرائدة إلى الحدود القصوى من الذيل وعينات بالتساوي (أي محوريا)، وبالتالي، كل تيار تدفق يساوي فيما يتعلق الكفاءة وحساسية. حجم حساسية مما يجري مقسوما على عدد الانشقاقات. في قوات الأمن الفلسطينية، ومع ذلك، فإن العينات عملية تقسيم الفرقة شعاعيا، وليس محوريا. على هذا النحو، وعينات الساحلية بوسط ذروة قمة - المنطقة الأكثر تركيزا من الذروة. وهكذا، فإن حساسية هنا هي أعلى كما لا تضعف الذروة التي كتبها المنطقة منتشر المخلفات. عينة يبلغ حجمه من الموانئ الطرفية ليست فعالة كما هو الحال في سنترامنطقة لتر، ولكن، منذ يتم أخذ عينات الفرقة شعاعيا، وليس محوريا، عرض ذروة أضيق مما هو الحال بالنسبة لعملية أخذ العينات التي تقسم الذروة في الاتجاه المحوري، أي انشقاق العمود آخر. وبالتالي لا يتم تقليل حساسية مع كاشف تعتمد التركيز.

في العمود قوات الأمن الفلسطينية، ويشمل تركيب منفذ منافذ الخروج متعددة وعلى داخل هذه الغاية المناسب ويقع هناك فريت الحلقي. الجزء الداخلي من هذه القنوات فريت الحلقي تتدفق من عمود شعاعي عبر منفذ ميناء المركزي، في حين أن الجزء شعاعي الخارجي للقنوات منفذ فريت تتدفق من العمود عن طريق الموانئ تدفق منفذ الطرفية أو منطقة الجدار. يتم فصل الأجزاء الداخلية والخارجية للفريت منفذ بجدار كتيمة تمنع تدفق المتبادل بين هذه المناطق تدفق 2. ونتيجة لهذا التصميم يتم فصل التيار تدفق شعاعي المركزي من خلال السرير عمود من خصوصيات تدفق منطقة الجداربيئة تطوير متكاملة العمود. الجزء النسبي للتدفق من هاتين المنطقتين يمكن أن تختلف على أي نسبة المطلوبة تقريبا من خلال إدارة الضغط من أجل تحسين مختلف الجوانب الفنية للتكنولوجيا العمود، مثل كفاءة الانفصال أو حساسية الكشف. في جوهرها، وهذا التصميم وتحدد بشكل فعال ضمن أكبر العمود شكل عمود "الظاهري"، التي يبلغ قطرها الداخلي الضيق، وبالتالي وظائف العمود كعمود الجدار أقل صحيح، والتغلب على عمود التجانس السرير وآثار الجدار 9،10.

الفوائد الرئيسية من الأعمدة PSF هي التحسينات في كفاءة العمود، والحد من تجهيز المذيبات لمصدر كشف (ق) وتمكين الكشف المضاعفة. ومع ذلك، ميزة إضافية هي أنه منذ تتم إزالة المخلفات والمناطق المواجه من أي فرقة من شطف العام ملف المذاب في شطف أو الكشف موجود في أعلى تركيز من لولاها ملاحظتها لنفس الصورةolute الحقن وتحميل تركيز على عمود التقليدية، اعتمادا على نسبة تجزئة المستخدمة. ونتيجة لذلك كثيرا ما لوحظ هناك مكاسب في كثافة إشارة للفصل أجريت على الأعمدة PSF 2. في الواقع، إذا تم تعديل نسبة تجزئة مثل أن 25٪ من مخارج تدفق من كل من منافذ خروج أربعة، وشدة إشارة إلى أن لوحظ استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) كشف وتبين عمليا بالضبط نفس كثافة إشارة تظهر بشكل واضح باستخدام التقليدية العمود حيث كامل (100٪) من الطور المتحرك ويتم تحليل 7. وعلاوة على ذلك، ضبط نسبة منفذ بين المناطق تدفق الوسطى والجدار يسمح كفاءة العمود على الوجه الأمثل. لاحظت مكاسب في الكفاءة العمود باستخدام أعمدة AFT لا يمكن القول أن قيمة واحدة، لأن هذه المكاسب الكفاءة هي وظيفة من ثلاثة عوامل هي: (1) معدل التدفق، (2) نسبة تجزئة، و (3) عامل الاحتفاظ المذاب . ومع ذلك، وتحقيق مكاسب في الكفاءة مقارنة التحويلويلاحظ دائما تقريبا الأعمدة entional، وأحيانا هذه المكاسب أكثر من 100٪ في عدد من لوحات النظرية 1،2. القدرة على ضبط نسبة تجزئة يسمح المحلل لتكييف فعال قطر عمود "الظاهري"، وهذا هو عامل مهم في ما يتعلق بعملية الكشف. على سبيل المثال، يتم تأسيس 2.1 مم القطر الداخلي (ID) عمود الظاهري من 4.6 ملم عمود معرف البدني عندما تكون نسبة تجزئة هي 21٪ من المرحلة المتنقلة يبلغ حجمه من شعاعي ميناء الخروج المركزي. في ظل هذه الظروف، ينفذ الظاهري 2.1 ملم عمود الهوية مع الكفاءة التي قد تكون أكبر أكثر من 70٪ من التقليدية 2.1 ملم عمود الهوية، اعتمادا على معدل التدفق، والمذاب الاحتفاظ عامل 10.

تصميم عمود PSF الحالي الذي يستخدم للكشف عن المضاعفة يشتمل على 4 منافذ منفذ المناسب، ولكن يمكن تركيبها على عمود مع 2-الميناء أيضا تركيب النهاية، ومع ذلك، وهذا يحد كشف رس اثنين فقط من كشف. العملية الأساسية من هذه الأعمدة، مع ذلك، في نفسه، إلا يمكن أن يقترن أن أربعة كشف في وقت واحد إلى 4 منافذ منفذ العمود PSF توسيع نطاق الكشف المضاعفة. وبصرف النظر عن عمود أنابيب الضام قبل وبعد، ومتطلبات إضافية الوحيدة التي تشغل عمود PSF غير الأنابيب التي يمكن توصيلها إلى الموانئ منفذ الطرفية، والوسائل التي يمكن قياس كمية الطور المتحرك مرورا كل أنبوب، عادة إما قياس كتلة أو القياس الحجمي. لسهولة ضبط، ويجب أن يكون القطر الداخلي لجميع أنابيب تدفق مخرج نفسه. ثم اختلفت نسبة التدفق بين موانئ الخروج المركزية الطرفية وشعاعي من خلال استخدام إدارة الضغط، وذلك ببساطة عن طريق تغيير طول الأنبوب الموجود على منفذ الطرفية المناسب، أو طول كاشف آخر الأنابيب على شعاعي الميناء منفذا المركزي.

كشف المضاعفة عن طريق أعمدة PSF

ميزة هامة من الأعمدة PSF هي أن كل من منافذ الخروج منفذ يمكن ان تكون مرتبطة مباشرة إلى المصدر الكشف، وبالتالي تمكين الكشف المضاعفة. في نظام الكشف مصممة تصميما جيدا لتحليل واحد مع الكشف عن المضاعفة يمكن أن توفر معلومات كبيرة في ما يخص طبيعة المكونات داخل العينة. الأهم من ذلك، يمكن إجراء الاختبارات المدمرة وغير المدمرة في نفس الوقت بالضبط، دون تأخير الكشف. وهذا يسمح للاحالة المطلق، على سبيل المثال، المواد المضادة للتأكسد باستخدام DPPH كاشف، مع مكونات احظت أن أزل مع الأشعة فوق البنفسجية و / أو قياس الطيف الكتلي (MS) ردود الكشف عن 7،11. ولذلك، يمكن تشغيل أربعة أجهزة كشف مستقلة في وقت واحد مع الأجزاء المناسبة من تدفق الموجهة إلى كل كاشف عن طريق أي من منافذ مأخذ الأربعة. منذ تدفق من خلال هذه المنافذ يمكن تعديلها بسهولة كمية من المذاب الوصول إلى أي من أجهزة الكشف يمكن تعديلها لتناسبحساسية مصدر كاشف معين. وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن الهجرة المذاب الأكثر فعالية لوحظ من خلال شعاعي الميناء منفذا المركزي. كل من الموانئ الطرفية تقديم كفاءة الفصل ما يعادلها، والتي عند تعيينها إلى 25٪ من خلال كل ميناء، ليست سوى أقل قليلا كفاءة من عمود التقليدي. على هذا النحو، فمن المهم أن يتم تعيين كاشف الكمي لتحليل عينة من شعاعي ميناء الخروج المركزي.

عند إعداد عمود PSF لغرض الكشف عن الإرسال المتعدد هناك عدد من الاعتبارات التي يجب القيام بها لتحقيق نتائج فعالة وعالية الجودة؛ هذا هو أبعاد أنبوب لكل منفذ، واختيار أي منفذ لنوع من كشف وضبط التدفق.

الأبعاد أنبوب لكل منفذ

في اللوني طول عمود آخر أنابيب يلعب دورا حاسما في كفاءة وأداء الانفصال. وكالة مكافحة المخدرات كبيرةود الحجم نتيجة طويلة أو واسعة أنابيب معرف من منفذ عامود لكشف يؤدي إلى فقدان الكفاءة والقرار، وحساسية. وبالتالي، يجب أن تستخدم أبعاد أنابيب المناسبة عند إعداد العمود PSF لتحقيق أقصى قدر من إمكانات في توفير الفصل كفاءة وفي الوقت ذاته توفير فوائد مضاعفة.

الميناء لالكاشف

الرقم 2 هو التوضيح لإعداد سبيل المثال الكشف المضاعفة (البنفسجية المرئية (U فيس)، مطياف الكتلة (MS) و2،2-ثنائي-1-picrylhydrazyl (DPPH •) كشف). ويبين الرسم التوضيحي يتم إرفاق ميناء المركزي للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، في حين DPPH و• ويتم إرفاق كشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس إلى الموانئ الطرفية. منذ MS هو كاشف الأكثر حساسية من الثلاثة، وتدفق للكشف عن هذا كان موجها من ميناء منفذ المركزي. كما DPPH الكشف غير انتقائية لpresencوجهت ه من المواد المضادة للاكسدة، وأقل حساسية والأكثر تسامحا لفرقة توسيع، تتدفق إلى هذا كاشف من ميناء الطرفية. كان للأشعة فوق البنفسجية فيس كاشف 'عام' الثانوية، حتى تتدفق إلى هذا كاشف كان موجها من ميناء الطرفية الثاني.

ضبط تدفق

مرة واحدة وقد تم إرفاق الأنبوب المناسب من ميناء إلى كشف، وتدفق الخروج من كل من كشف يمكن تعديلها لالمبلغ المطلوب. وهناك طريقة بسيطة لقياس كمية تدفق الخروج من كل كاشف هو لوزن كمية من المرحلة المتنقلة التي elutes من خلال كل ميناء على مدى فترة معينة من الزمن. وهكذا يمكن تحديد تدفق مئوية، ونسب التدفق يمكن تعديلها من قبل أي تقصير أو إطالة الأنابيب التي تعلق على خط منفذ على كشف وفقا لذلك لتتناسب مع متطلبات كشف في الاختيار. كشف المختلفة لها متطلبات مختلفة من التدفق، على سبيل المثال، الخلية تدفقكاشف مضان (FLD) لا تتدفق نسبة محدودة، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب الضغط الزائد للخلايا التدفق. وبالتالي السيطرة على تدفق من خلال FLD عادة ما يتحقق عن طريق ضبط هبوط الضغط عبر أجهزة الكشف الأخرى وما تبقى من تدفق ثم يمر عبر الكبد الدهني. وكشف عن أن تراعي كمية تدفق التي يتم تسليمها هو MS. عموما، يمكن الطيف الحالية كتلة الراقية معالجة بسهولة في جميع أنحاء 1-1،5 مل / دقيقة من الطور المتحرك المائية باعتدال. فوق هذا معدل التدفق والفيضانات من مصدر قد جعل MS غير صالحة للعمل. ومع ذلك، استفاد حساسية الكشف في معظم الطيف الجماهيري باستخدام انخفاض معدلات تدفق؛ وبالتالي قدرات تقسيم تدفق PSF مفيدة للغاية للتطبيقات التي تنطوي على كشف MS. ويمكن استخدام عمود ارتفاع معدلات التدفق الحجمي، ولكن مع الأحمال انخفاض حجم نقلها إلى كشف MS. ضبط تدفق للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ولكن يجب أن يتم عن طريق ضبط هبوط الضغط مسبق للكشف MS، MS بدلا من آخر. هنا، واستخدام أنابيب ضيق تجويف (0.1 ملم معرف) مفيد جدا، حيث أن الضغط يمكن تعديلها بسهولة دون إضافة حجم القتلى غير مناسب.

اعتمادا على نوع من كاشف تعديل نسبة التقسيم يمكن أن يتم إما قبل أو بعد كشف. إذا كاشف غير المدمرة، مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس، سيتم قياس نسبة تدفق وضبطها للكشف عن آخر. إذا تم استخدام جهاز كشف المدمرة واحد في متعدد إعداد يتم تحديد نسبة التدفق عن طريق حساب الوراء فيما يتعلق أخرى نسب تدفق الميناء. إذا تم استخدام جهاز الكشف عن أساس كاشف مثل DPPH •، يتم قياس نسبة تدفق للكشف عن آخر دون إضافة كاشف. وإذا تم استخدام اثنين أو أكثر تدميرا للكشف عن، ثم يتم قياس نسبة تدفق ما قبل كاشف. الأنظمة التي قد تتطلب أجهزة إضافية، مثل DPPH الكشف، وسوف يكون نظام الضغط الإضافي الذي قد يغير تدفقنسبة تعلق مرة واحدة لنظام الكشف. ولذلك، ينبغي إيلاء دراسة متأنية لضغوط النظام من كشف مدمرة، عند ضبط نسبة تدفق ما قبل كاشف. بغض النظر عن نسبة تدفق التي تم تعيينها من خلال أي من المنافذ، يجب الحصول على معلومات كمية عن طريق توحيد المناسب. مرة واحدة يتم تعيين نسب التدفق، ومع ذلك، فهي قوية، وأنها لا تتغير حتى في ظل ظروف شطف التدرج

ويهدف البروتوكول فيديو مفصل يرافق هذه المخطوطة لإظهار كيفية استخدام وتوليف أداء العمود PSF في وضع المضاعفة من الكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول يحتوي على إرشادات حول كيفية استخدام عمود PSF على نظام HPLC إلى جانب كشف متعددة للكشف عن المضاعفة. لقد كتب البروتوكول على افتراض أن القارئ لديه المعرفة الأساسية والخبرة في اللوني ومختلف طرق الكشف HPLC.

تنبيه: يرجى الرجوع إلى ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد والكواشف قبل الاستخدام (أي، MSDS للميثانول). ضمان استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) شاطف. ضمان الاستخدام الملائم للضوابط هندسية من HPLC والتوازن وكشف تحليلي الأجهزة، وضمان استخدام معدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية، والقفازات، معطف المختبر، وطول السراويل الكاملة، وأحذية مغلقة اصبع القدم).

1. إعداد صك من HPLC

  1. إعداد الصك HPLC مع الماء عالى النقاء (على سبيل المثال، 100٪ ملي-Q الماء) للينه A و 100٪ الميثانول لخط B كما الطور المتحرك وتطهير المضخات وفقا لمتطلبات الشركة المصنعة. إذا كان أحد أجهزة الكشف المستخدمة غير MS، كما هو الحال هنا، إضافة حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ لمرحلتي النقالة A و B.
  2. إعداد HPLC مكونات وأجهزة الكشف عن دور فعال كما هو موضح في الشكل (2). وهذا يتطلب وضع مناسب للكشف عن النسبية إلى العمود وذلك لتقليل حجم القتلى بين كشف والعمود. المرونة في تكوين النظام HPLC أمر مرغوب فيه.

2. الإعداد للأشعة فوق البنفسجية فيس وكشف MS

  1. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس على الطول الموجي المطلوب تعتمد على عينة من الفائدة (على سبيل المثال، 280 نانومتر).
  2. تعيين كاشف MS في وضع إيجابي لإجمالي عدد ايون (TIC) التحليل باستخدام مسح كامل طريقة الكشف. أيضا ضبط المعلمات MS التالية بناء على ذلك: درجة الحرارة المرذاذ 500 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الشعرية 350 ° C، الغاز غمد تعيين بمعدل 60 وحدة، وتدفق الغاز المساعد40 واكتساح تدفق الغاز في 5 وحدات، ورذاذ الجهد 3،5 كيلو فولت. ويمكن تعديل هذه الإعدادات في وقت لاحق لمتطلبات المستخدم محددة تعتمد على العينة التي تم تحليلها.

3. إعداد 2،2-ثنائي الفينيل-1-picrylhydrazyl الراديكالي (DPPH •) الكاشف الإعداد من DPPH للكشف عن نظام

  1. تزن 25 ملغ من DPPH وتذوب في 250 مل من الميثانول في قارورة حجمية.
  2. إضافة 250 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى DPPH كاشف. تغطية قارورة في احباط لمنع التعرض للضوء.
  3. يصوتن القارورة التي تحتوي على DPPH كاشف لمدة 10 دقيقة.
  4. تطهير DPPH مضخة مع استعداد DPPH كاشف وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
  5. إعداد نظام DPPH وفقا لشكل 2 عن طريق ربط خط ضخ إلى مدخل لT-قطعة.
  6. إرفاق 100 ميكرولتر فائف رد الفعل إلى thمنفذ (ه) من T-قطعة ونعلق على الطرف الآخر من لفائف رد فعل على كاشف.
  7. غلف لفائف التفاعل في سخان العمود وضبط درجة الحرارة سخان عمود إلى 60 درجة مئوية.
  8. تعيين DPPH الأشعة فوق البنفسجية فيس كاشف إلى 520 نانومتر.

4. الإعداد لPSF العمود

  1. ربط مدخل العمود PSF في الصك HPLC.
  2. ربط ميناء المركزي للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، وذلك باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
  3. الاتصال منفذ الطرفية للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
  4. ربط ميناء هامشية أخرى إلى T-قطعة من نظام الكشف DPPH استخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
  5. منع ميناء الطرفية غير المستخدمة باستخدام سدادة العمود.
  6. جعل معدل تدفق مضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة -1 في 100٪ خط B -٪ الميثانول 100 (حمض الفورميك 0.1٪).
  7. تتوازن العمود مع الميثانول بنسبة 100٪ المحمول فتاهبورصة عمان لمدة 20 دقيقة للحصول على 4.6 ملم × 250 ملم معرف طول العمود. يتم تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى يمكن للمستخدم توظيف.

5. ضبط العمود PSF لكشف المضاعفة

  1. قياس كتلة اثنين على الأقل من السفن جمع فارغة (واحد للمنفذ توصيل للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس واحد للDPPH كاشف) باستخدام الميزان التحليلي.
  2. جمع الطور المتحرك من الأشعة فوق البنفسجية فيس وDPPH الموانئ إلى سفينتين منفصلة، ​​وزنه قبل جمع (5،1). تسجيل فترة من الزمن لجمع. جمع ما لا يقل عن 500 ملغ من المذيبات في كل سفينة.
  3. تزن الأوعية جمع وتحديد كتلة الطور المتحرك. ونظرا لكثافة الميثانول هو 0.791 ز مل -1، وتحديد حجم الطور المتحرك التي تم جمعها من كل منفذ.
  4. من قبل الفرق، وهذا هو، مضخة الاسمية مجموعة معدل تدفق ناقص معدل التدفق من خلال DPPH و• والأشعة فوق البنفسجية فيس كاشفالموانئ تدفق ص، وتحديد معدل التدفق للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. التعبير عن كل نسبة تدفق كنسبة مئوية من إجمالي التدفق.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، ونسب التدفق هي: إلى MS هو 18٪ من معدل التدفق الكلي، إلى الأشعة فوق البنفسجية فيس 22٪، إلى DPPH كشف 60٪.
  5. إن لم يكن، وضبط نسب التدفق من خلال تغيير الضغط مرة أخرى على كشف الأشعة فوق البنفسجية فيس. على سبيل المثال، إذا كان تدفق للأشعة فوق البنفسجية فيس مرتفع جدا، وانخفاض نسبة بإضافة إضافة المادة 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى منفذ للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس. ثم كرر الخطوات 5،1-5،5.

6. شروط الإعداد النهائية

  1. ضبط معدل تدفق DPPH مضخة كاشف لنفس معدل تدفق الخروج من الميناء منفذا متصلا DPPH كاشف.
    ملاحظة: العمود PSF المضاعفة مع UV-فيس، DPPH وMS هو الآن على استعداد لتحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأجري تحليل HPLC المضاعفة خارج باستخدام عمود الخلف في وضع PSF (الشكل 1)، وإعداد كما هو موضح في الشكل (2). يسمح هذا النوع من الإعداد عينة القهوة ليتم تحليلها في وقت واحد باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس، DPPH وMS في إجمالي عدد ايون (TIC) واسطة. المركبات من العينة القهوة التي ردت على DPPH يمكن أن يتم مطابقتها بسهولة حتى أشعة فوق البنفسجية فيس وMS - الردود TIC على أساس المواءمة بين الوقت الاحتفاظ كما هو موضح في الشكل (3)، حيث تم تسجيلها في الاستشرابية في وقت واحد. حيث شوهد ردا إيجابيا من كشف MS-TIC، وسجلت الكتلة الجزيئية للقمة الجدول 1 قوائم الأوقات الإبقاء على DPPH قمم، واستجابة لهذه القمم في الأشعة فوق البنفسجية فيس و / أو MS كشف، والتي بالتالي قدمت الكتلة الجزيئية. سهولة في مطابقة القمم بين عمليات الكشف مختلفة يسمح للبالعربيةشكل AST وأكثر كفاءة الفحص وتوصيف لعينة المعقدة، مثل القهوة.

الشكل 1
الشكل 1. صورة من العمود تقنية التدفق النشط مقارنة العمود التقليدي. يتم تركيب العمود الخلف مع منفذ تركيب أربعة المنفذ الذي يضم فريت الحلقي تمكين الذروة أخذ العينات عبر مقطع عرضي شعاعي من الفرقة العينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. وهناك مثال مثال على الترتيب HPLC المضاعفة، وذلك باستخدام عمود PSF مع DPPH والأشعة فوق البنفسجية فيس وكشف MS. كل كاشف ويرد ص بمنفذ مخرج منفصل. في هذه الحالة يتم استخدام MS للالكمي، ومن المتوقع أن جمع عينة من شعاعي الميناء منفذا المركزي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الاستشرابية من عينة القهوة تحليلها عن طريق نظام HPLC المضاعفة، وذلك باستخدام عمود PSF مع DPPH والأشعة فوق البنفسجية فيس وكشف MS: (أ) DPPH 520 نانومتر، (ب) للأشعة فوق البنفسجية فيس 280 نانومتر، ) MS - TIC. كل كشف عن أثر هو تتزامن تماما في الوقت المناسب، لذلك لا يلزم تعديل تعويض من أجل تعويض الوقت الميت بين كل كاشف.arget = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

">
القهوة DPPH الاستجابة الذروة والكتلة
DPPH الذروة الاحتفاظ الوقت DPPH UV-فيس MS - رد TIC كتلة
(دقيقة) استجابة استجابة
1 6.74 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 123.84
2 </ td> 7.54 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 125.83
3 8.94 نعم فعلا لا لا -
4 10.05 نعم فعلا لا نعم فعلا 135.83
5 13.15 نعم فعلا لا لا -
6 16.22 نعم فعلا لا لا -
7 18.14 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 126.82
8 19.4 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.81
9 20.46 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 187.89
10 24.71 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.81
11 26.27 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.8
12 26.97 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 194.87
13 31.84 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.8
14 32.02 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.78
15 32.56 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 176.82
16 33.94 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 176.83
17 41.26 نعم فعلا نعم فعلا لا -
18 42.72 نعم فعلا لا نعم فعلا 284.93
19 46.07 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 190.83
20 49.21 نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا 162.75

الجدول 1. الكشف عن DPPH قمم استجابة للأشعة فوق البنفسجية فيس وMS - TIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتنطوي هذه الدراسة توصيف والتنميط من القهوة باستخدام HPLC مع الكشف عن المضاعفة توظف تدفق مجزأة (PSF) العمود المتوازي. المضاعفة HPLC باستخدام أعمدة PSF تمكن من توصيف وتحديد الكيانات الكيميائية الأساسية عن طريق الحد من تعقيد البيانات من عينة حين الحصول على قدر أكبر من المعلومات جزيء محددة داخل جزء من الوقت الذي يستغرقه باستخدام عمليات متعددة الكشف التقليدية. العمود PSF يسمح ليس فقط منبرا للكشف المضاعفة، ولكن أيضا على مزيج من الاثنين معا للكشف عن مدمرة وغير مدمرة، دون حجم القتلى إضافية والأنابيب. تم المضاعفة DPPH والأشعة فوق البنفسجية فيس وMS (TIC) لتحليل قهوة اسبريسو.

تم استخدام عمود PSF 4 منافذ لتحليل المضاعفة من القهوة باستخدام كاشفات الثلاثة المختلفة. كان متصلا ميناء المركزي للمخرج العمود PSF للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد واثنين من ثلاث،تم توصيل البريد الموانئ الطرفية إما إلى نظام الكشف DPPH أو كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس. كان ثالث ميناء المحيطية المتوفرة لا تستخدم، وبالتالي منعت مع سدادة العمود، ولكن هذا كان يمكن استخدامها لجمع العينة، أو لكشف آخر. وكانت عملية ضبط هذه المجموعة المضاعفة يصل محددة لكاشف، حيث قياس تدفق تجزئة حدث بعد كشف لDPPH أنظمة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس و. منذ MS هو كاشف المدمرة، تم تحديد نسبة التدفق عن طريق الفرق (مجموع تدفق الاسمي ناقص تدفق من الموانئ منفذ أخرى).

في هذه الدراسة، وأسفر التحليل القهوة مع DPPH كاشف في 20 قمم حلها جيدا، 13 منها أظهرت أيضا استجابة في الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس وMS الشكل 3 يقارن الاستشرابية التي حصل عليها كل كاشف. هناك أربع مناطق التي لديها نفس التشكيل الجانبي الكروماتوغرافي داخل كلاللوني، التي أشار إليها مربعات حمراء. في هذه الصناديق، حيث أظهرت أشعة فوق البنفسجية فيس وMS استجابة تذكر لهذه المركبات، وكان هناك رد فعل قوي من DPPH كاشف. أربعة عناصر التي ردت على DPPH كاشف لم يتم الكشف إما عن طريق أجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس أو MS وثلاثة من المكونات التي ردت على DPPH كاشف يتلق أي رد أشعة فوق البنفسجية فيس أو MS على الإطلاق. وسجلت الكتلة الجزيئية من المكونات التي استجابت لMS في الجدول 1. وكان المكون الذي مزال في 10 دقيقة لDPPH استجابة قوية، مع عدم وجود استجابة من كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس وإلا استجابة ضئيلة جدا من كشف MS .

أعطى اقتران عمود الخلف في وضع PSF الفرصة لتشغيل أجهزة الكشف متعددة في وضع المضاعفة، حيث تم تشغيل جميع أجهزة كشف بغض النظر عن متطلبات HPLC كاشف في وقت واحد في حقنة واحدة وفصل هذا عصيدة معقدةجنيه. ومتعدد الميناء تنتهي التصميم المناسب من العمود AFT يوفر فائدة إضافية تتمثل في توفير فرص للعمليات الكشف المتنوعة، مما أسفر عن معلومات مفصلة عينة والموثوقية المطلقة في تعيين المكونات بين كل طريقة الكشف. كشف المضاعفة مع الأعمدة PSF توفير كمية كبيرة من المعلومات العينة، وثلاثة للكشف عن تشغيلها في وقت واحد في وقت التشغيل المطلوبة لكشف واحد. وكانت المباراة بالضبط من الوقت الإبقاء على قمم داخل كل طريقة الكشف الممكنة. وكان اثنان من أجهزة الكشف عن استخدام أجهزة كشف المدمرة.

قدرات مضاعفة من عمود PSF هو، مهما كانت محدودة من قبل عناصر مفيدة HPLC المتاحة والكشف عن الأجهزة. تقنية تتطلب أساليب متعددة كشف وما يلزم من إضافات لكل وضع معين للكشف، أي مضخات، لفائف رد فعل، وسخانات الخ الفائدة الأساسية من كشف الإرسال المتعدد باستخدام عمود PSF هي reductioن في الوقت المناسب تحليل بنسبة تصل إلى أربعة أضعاف (إذا تم استخدام 4 أجهزة كشف)، مما يقلل التباين بين عينة تحليلات لكل وضع واحد من الكشف. وعلاوة على ذلك، تعيين العلاقات المكونة ضمن العينة الكشف عن كشف واحدة إلى أخرى هو أبسط بكثير، وعرضة للخطأ أقل مما لو تم توظيف كل كشف على حدة. هذا يتجنب عدم تطابق في تعيينات المكونات، التي غالبا ما تكون مشكلة في تحليل عينات معقدة.

من المهم أن نكرر أنه ينبغي بذل الكمي على أساس كشف تقع على شعاعي الميناء منفذا المركزي منذ كفاءة الفصل هنا هو أعلى، وبالتالي، آثار المخلفات الذروة هي الحد الأدنى وتقدير وبالتالي أكثر دقة. وقد تبين تجزئة تدفق أن تكون قوية من خلال التحليلات، ولكن على الرغم من ذلك، فمن الممارسة المخبرية الجيدة للحفاظ على توحيد منتظم. وبالتالي في أي عمل الكمي من المهم لتشغيل معايير حسب الاقتضاء. إذا تم استخدام كاشف نقيةلاي كوسيلة لفهم تعقيد عينة من خلال التصوير المرئي للمكونات عينة، قد لا تكون هناك حاجة الكمي، كما هو الحال هنا للحصول على مضادات الأكسدة بروتوكول الكشف عن الاستجابة.

لقد أثبتنا هنا مثال على الكشف الثلاثي، UV، MS وكشف تستجيب المضادة للأكسدة. أنظمة الكشف المضاعفة باستخدام أعمدة AFT يمكن استخدامها في أي حالة تقريبا حيث يتطلب المحللين المعلومات عينة متعددة الأبعاد وهذا ينطوي على بروتوكولات كشف متعددة. استخدام أعمدة AFT سوف تبسيط كبير وتسريع عملية توصيف العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136, (24), 5127-5130 (2011).
  2. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
  3. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35, (3), 410-415 (2012).
  4. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
  5. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
  6. Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
  7. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
  8. Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
  9. Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
  10. Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
  11. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics