Deacetilazione saggi di svelare l'interazione tra sirtuine (SIRT2) e specifici Protein-substrati

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

1. In Vitro deacetilazione Assay

  1. Purificazione di SIRT2
    1. Preparare 10 cm coltura piatto di cellule HEK 293T coltivate in 8 ml DMEM con 10% FBS e antibiotici e coltivate a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore coltura tissutale a circa il 70% confluenti il giorno successivo.
    2. Il giorno successivo, il co-trasfezione 4 mg pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector realizzato nel nostro laboratorio), 4 mg pCMV- dR8.2 dvpr (imballaggio del vettore) e 0,5 mg pCMV-VSV-G (vettore busta) 18 con polietilenimmina (PEI) in un rapporto di 3 ml PEI DNA / mg.
    3. Cambiare media dopo 12 ore.
    4. Raccogliere il surnatante dopo 36-48 ore.
    5. Rimuovere i detriti per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    6. Dopo che filtra attraverso 0,22 micron filtri, fare 1 ml aliquote di SIRT2 lentivirus e conservare a -80 ° C.
    7. Scongelare lentivirus SIRT2 su ghiaccio (è importante conservare il virus a -80 ° C quando il virus non viene utilizzato).
    8. Infect una piastra da 6 pozzetti di cellule 293T confluenti HEK 80-90% di 1 ml di lentivirus in presenza di 8 mg / ml polibrene.
    9. Posizionare cellule infettate da virus a 37 ° C incubatore fino al giorno successivo (24 ore).
    10. Sostituire media dopo 24 ore.
    11. 48 ore dopo l'infezione, controllare l'efficienza infezione rilevando GFP cellule positive al microscopio a fluorescenza.
    12. Se l'efficienza di infezione è buono (almeno il 40-50% delle cellule infettate), sostituire media con terreno di coltura contenente 2 mg / ml puromicina per selezionare per SIRT2 stabile nel cellule che esprimono.
      Nota: Questo richiede circa 2 settimane, e il mezzo viene cambiato ogni 3-4 giorni. le cellule non infette muoiono in questo periodo di selezione e solo le cellule infettate con il lentivirus SIRT2 crescere.
    13. Analizzare espressione di SIRT2 Flag-tag mediante western blotting utilizzando un anticorpo anti-Flag (1: 1.000 diluizione) dopo l'esecuzione di 40 mg di proteine ​​totali su un gel SDS-PAGE 10% prima di avviare la purifprocesso icazione (consigliato) 19,20.
    14. Per purificare SIRT2 attiva, celle divise in 1: 3 il rapporto con tripsinizzazione in modo da avere abbastanza piatti di cellule HEK 293T stabilmente sovraesprimono Flag-SIRT2 (Ten 10 cm piatti permetteranno di purificazione di proteine ​​sufficiente per esperimenti successivi).
      1. Per trypsinize le cellule, togliere terreno di coltura ed eliminare il siero residuo risciacquando cellule con DPBS sterile. Aggiungere lentamente 2,5 ml di una soluzione di tripsina-EDTA 0,25% a coprire il monostrato cellulare, incubare a temperatura ambiente per 30-45 sec. Dopo la rimozione della soluzione di tripsina-EDTA, incubare a 37 ° C finché le cellule iniziano a staccarsi. Quindi aggiungere terreno di coltura e trasferire le cellule a nuovi piatti.
    15. Rimuovere terreno di coltura, lavare le cellule due volte in PBS e raccogliere cellule mediante tripsinizzazione seguita da centrifugazione a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    16. Pellet cellulare Lyse in 500 microlitri tampone di lisi A (20 mm HEPES pH 7.9, 18 mm KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mm MgCl 2, 20% glicerolo, 0,1% NP-40) includente un cocktail inibitori della proteasi e 1 pM TSA per 30 min a 4 ° C sotto costante rotazione.
    17. Centrifugare a 14.000 xg per 15 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
    18. Eseguire immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-Flag coniugato agarosio perline come descritto di seguito.
      1. Aggiungere 200-300 ml di anticorpo anti-Flag coniugato con agarosio perline al lisato proteico (10-20 mg proteine ​​totali).
      2. Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione costante.
      3. Raccogliere immunoprecipitati per centrifugazione a 1.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      4. Lavare il pellet 5 volte con 10 ml di tampone di lisi A a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Dopo ogni lavaggio, agglomerare le perline e sostituire il surnatante con tampone A.
    19. Preparare la soluzione Flag peptide 1x (tra cui un cocktail inibitori della proteasi e 1 micron TSA in PBS).
    20. Aggiungere 500 ml di 1x bandiera peptidee soluzione ai agarosio e incubare per 30 min a 4 ° C sotto costante rotazione.
    21. Raccogliere il surnatante per centrifugazione a 6.000 xg per 2 minuti a 4 ° C.
    22. Ripetere due passaggi precedenti.
    23. Rimuovere perline da surnatante utilizzando tubi filtranti e centrifugazione a 15.000 xg per 1 min a 4 ° C.
    24. Concentrato campione eluito finché la concentrazione proteica finale è 1 mg / mL usando una membrana di ultrafiltrazione.
    25. Controllare processo di purificazione da spettacolo elettroforesi utilizzando 1 mg del campione eluito.
    26. Gel macchia con una soluzione colorante disponibile in commercio per confermare la purificazione SIRT2.
    27. Mantenere SIRT2 purificata a -80 ° C.
  2. Purificazione di acetilato proteina-substrato
    1. Preparare 10 cm x 10 cm piatti della cultura con cellule HEK 293T essere di circa il 70% confluenti il ​​giorno successivo.
    2. Le cellule giorno dopo, co-trasfezione con 5 mg di una bandiera con tag vettore plasmidico expressing proteina-substrato e 5 ug del specifica acetil-transferasi che può acetylate la proteina utilizzando PEI in un rapporto di 3 ml PEI DNA / mg.
      Nota: Se la specifica acetil-transferasi non è noto, co-trasfezione con una miscela di nota istone acetil-transferasi (copricapo), come p300, CBP, GCN5, Tip60 e PCAF.
    3. Cambiare media dopo 12 ore.
    4. Il giorno prima la lisi delle cellule, trattare le cellule con 1 micron TSA e 2 mm nicotinamide (NAM) durante la notte, sostituendo il terreno di coltura con terreno contenente TSA / NAM per massimizzare i livelli di acetilazione della proteina-substrato inibendo deacetilasi.
    5. 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere terreno di coltura, lavare le cellule due volte in PBS e raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione seguita da centrifugazione a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    6. Lyse pellet di cellule in 500 microlitri tampone di lisi A per piatto (20 mM HEPES pH 7.9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glicerolo, 0,1% NP-40) includente una proteasi inhibitors cocktail, 1 pM TSA e 2 mM NAM per 30 minuti a 4 ° C sotto costante rotazione.
    7. Centrifugare a 14.000 xg per 15 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
    8. Eseguire immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-Flag coniugato agarosio perline come descritto di seguito.
      1. Aggiungere 200-300 ml di anticorpo anti-Flag coniugato con agarosio perline al lisato proteico (10-20 mg proteine ​​totali).
      2. Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione costante.
      3. Raccogliere immunoprecipitati per centrifugazione a 1.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      4. Lavare il pellet 2 volte con 10 ml di tampone di lisi A a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Dopo ogni lavaggio, agglomerare le perline e sostituire il surnatante con tampone di lisi A.
      5. Lavare il pellet 3 volte con 10 ml di tampone di lisi A senza NAM a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Dopo ogni lavaggio, agglomerare le perline e sostituire il surnatante con tampone di lisi A. E 'important non di riportare qualsiasi NAM alla reazione deacetilazione.
    9. Preparare la soluzione Flag peptide 1x (compresi gli inibitori della proteasi e 1 micron TSA in PBS).
    10. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di peptide 1x Flag alle perline di agarosio e incubare per 30 min a 4 ° C sotto costante rotazione.
    11. Raccogliere il surnatante per centrifugazione a 6.000 xg per 2 minuti a 4 ° C.
    12. Ripetere due passaggi precedenti.
    13. Rimuovere perline da surnatante utilizzando tubi filtranti e centrifugazione a 15.000 xg per 1 min a 4 ° C.
    14. Utilizzando una membrana di ultrafiltrazione, concentrare campione eluito finché la concentrazione proteica è 1 mg / ul.
    15. Eseguire elettroforesi eseguendo 1 ml di campione eluito su un gel SDS-PAGE 4-12%.
    16. Conferma acetilazione della proteina-substrato mediante western blotting utilizzando anticorpi contro Ac-K (1: 1.000 diluizione) e la proteina-substrato (diluizione dipende l'anticorpo specifico utilizzato).
    17. mantenere puricato acetilato proteina-substrato a -80 ° C.
  3. In Vitro deacetilazione Reazione
    1. Preparare il tampone di deacetilazione B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 0,5 mM TSA)
    2. Preparare 3 reazioni diverse nei diversi tubi in 20 ml di volume finale (Tabella 1).
    3. Includi reazioni supplementari per confermare deacetylation della proteina-substrato da SIRT2 (opzionale). Aggiungere 2 microgrammi di purificato deacetilazione nulla SIRT2 mutante (questo può essere fatto utilizzando il protocollo descritto al punto 1.1 dopo aver usato un lentivector pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) per la reazione, invece di deacetilasi SIRT2 attivo o aggiungere 10 mM nicotinamide (NAM ) per la reazione di inibire l'attività di deacetilazione SIRT2 (Tabella 1).
    4. Incubare le reazioni per 3 ore a 30 ° C sotto costante agitazione.
    5. Arrestare la reazione aggiungendo 20 l di tampone campione 2x e far bollire i campioni Fo 10 min a 95 ° C.
    6. Eseguire elettroforesi eseguendo la miscela di reazione su un gel SDS-PAGE 4-12% e rilevare lo stato acetilazione della proteina-substrato mediante western blotting utilizzando un anticorpo anti Ac-K (1: 1.000 diluizione) 19,20.

2. In Vivo deacetilazione Assay

  1. SIRT2 sovraespressione in cellule in coltura
    1. Preparare 10 piatti cm di coltura con cellule HEK 293T stabilmente sovraesprimono pCDH-puro-GFP-vettore vuoto, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag e pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (come descritto in 1.1) da circa 70 % confluenti.
    2. In alternativa, preparare 10 cm piastre di coltura con cellule circa il 70% confluenti ed eseguire sovraespressione transiente con 5 ug di vettori di cui sopra utilizzando PEI in un rapporto di 3 ml PEI DNA / mg.
    3. Eseguire Western Blotting di estratti cellulari totali utilizzando un anticorpo anti-Flag (1: 1.000 diluizione) per dimostrare l'iperespressione di Flag-tagged SIRT2 19.
  2. RNA interferenza di Knockdown SIRT2 in cellule in coltura
    1. Preparare un 10 centimetri cultura piatto di cellule 293T HEK essere di circa il 70% confluenti il ​​giorno successivo.
    2. Il giorno successivo, il co-trasfezione 4 mg pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 mg pCMV- dR8.2 dvpr (imballaggio del vettore) e 0,5 mg pCMV-VSV-G (vettore busta) 18 utilizzando polietilenimmina (PEI) con un rapporto di 3 ml PEI DNA / mg.
      Nota: Per abbattere SIRT2, usiamo semplici shRNAs tornante nel vettore lentivirale pLKO.1 progettato dal consorzio RNAi (TRC).
    3. Seguire la procedura descritta al punto 1.1 per la produzione di lentivirus shSIRT2 e infettare le cellule bersaglio per atterramento SIRT2.
    4. Eseguire Western Blotting di estratti cellulari totali utilizzando un anticorpo anti-SIRT2 (1: 1.000 diluizione) per dimostrare efficiente atterramento SIRT2 dopo l'esecuzione di 40 mg di proteine ​​totali su un gel SDS-PAGE 10%.
    5. Alternativamente,preparare 10 cm piatti della cultura con cellule circa il 70% confluenti ed eseguire atterramento transitoria di SIRT2 utilizzando siRNA seguenti istruzioni del produttore.
    6. Eseguire Western Blotting di estratti cellulari totali utilizzando un anticorpo anti-SIRT2 (1: 1.000 diluizione) per dimostrare efficiente atterramento SIRT2 dopo l'esecuzione di 40 mg di proteine ​​totali su un gel SDS-PAGE 10%.
  3. Immunoprecipitazione e immunoblotting per rilevare i livelli ACETILATO in cellule in coltura
    1. 12 ore prima di raccogliere pellet cellulari sia da cellule overexpressing SIRT2 (vedi 2.1 sopra) o SIRT2 abbattuto cellule (vedi 2.2), aggiungere 1 micron TSA al mezzo di coltura per inibire la classe III deacetilasi degli istoni non.
    2. Rimuovere terreno di coltura, lavare le cellule due volte in PBS e raccogliere cellule mediante tripsinizzazione seguita da centrifugazione a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    3. Aggiungere 10 ml di tampone di lisi A (20 mm HEPES pH 7.9, 18 mm KCl, 0,2 mM EGTA, 1.5mM MgCl 2, 20% glicerolo, 0,1% NP-40) includente un cocktail inibitori della proteasi, 1 pM TSA e 2 mM NAM.
    4. Incubare a 4 ° C per 30 min sotto rotazione costante.
    5. Raccogliere surnatanti di centrifugazione a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
    6. Calcolare la concentrazione di proteine ​​utilizzando un Metodo di Bradford.
    7. Trasferire 1 mg di proteine ​​totali di nuovi tubi in un volume finale di 1 ml con tampone di lisi A. Uso Tabella 2 come riferimento per preparare campioni di proteine ​​da cellule sia sovraespressione SIRT2 o dopo SIRT2 knockdown.
    8. Eseguire un immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo contro la proteina specifica-substrato insieme con proteina A / G (si consiglia 40 ml tallone liquami). In alternativa, utilizzare un anticorpo anti Ac-K coniugato con agarosio perline (20 ml tallone liquami di solito è sufficiente) per immunoprecipitare tutte le proteine ​​acetilati.
    9. Incubare i campioni a 4 ° C sotto constant rotazione durante la notte.
    10. Raccogliere immunoprecipitati per centrifugazione a 1.000 xg per 2 minuti a 4 ° C.
    11. Lavare perline 5 volte con 1 ml di tampone A a 1.000 xg per 2 minuti a 4 ° C.
    12. perline Risospendere in 40 ml di tampone 2x campione.
    13. campioni bollire per 10 minuti a 95 ° C.
    14. Eseguire l'elettroforesi eseguendo i campioni eluiti (40 microlitri dal punto 2.3.12) su un gel SDS-PAGE 4-12% senza disturbare le perline durante il trasferimento dei campioni eluiti.
    15. Rilevare livelli acetilati della proteina-substrato mediante Western blotting utilizzando un anticorpo anti-Ac-K (1: 1.000 diluizione) se un anticorpo specifico proteina-substrato è stato utilizzato per immunoprecipitazione, o un anticorpo specifico contro la proteina-substrato (seguire consigli l'anticorpo specifico riguardante diluizione) se anti-perline Ac-K sono stati utilizzati per l'immunoprecipitazione.

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Representative Results

Affinché una proteina per essere considerato come un bersaglio deacetilazione legittimo per qualsiasi enzima con attività di deacetilazione, sia in vitro e in vivo deacetilazione devono essere eseguiti per stabilire l'interazione tra la deacetilasi e il suo substrato. Per il saggio deacetilasi in vitro, la purificazione sia della deacetilasi e il substrato proteico acetilato è richiesto prima del dosaggio può essere fatto. Qui usiamo il SIRT2 sirtuin citoplasmatica come deacetilasi specifica da studiare. SIRT2 è un enzima deacetilasi e l'uso di un mutante che manca dell'attività deacetilasi è altamente raccomandato come controllo negativo per il saggio deacetilazione. Utilizzando la procedura di purificazione descritto in 1.1, sia SIRT2 e SIRT2 H187Y possono essere purificati con successo ad una concentrazione finale di 1 mg / mL. Ciò può essere confermato dopo aver eseguito le proteine ​​purificate su gel seguita da colorazione(Figura 1A, superiore) così come dopo western blotting utilizzando un anticorpo anti-Flag poiché sia SIRT2 e SIRT2 H187Y sono contrassegnati da un peptide Flag (Figura 2A, inferiore). La stessa procedura di purificazione può essere seguito per la purificazione della proteina substrato con alcune modifiche. La proteina deve essere acetilato prima di poter essere utilizzato per il saggio deacetilazione che significa che deve essere purificato in cellule che sovraesprimono specifico acetil transferasi o una miscela di HATs grado di acetylate proteina. Utilizzando la procedura di purificazione descritto in 1.2, la proteina acetilato può essere purificata (Figura 1B, superiore). Per verificare che la proteina è infatti acetilato e può essere utilizzato per il saggio deacetilazione in vitro, western blotting utilizzando un anticorpo anti Ac-K è necessario mostrare livelli aumentati acetilati della proteina purificata in cellule che sovraesprimono la acetil-transferasi (Figura 1B, Lower).

Dopo la purificazione della proteina di successo, il saggio deacetilazione in vitro può essere eseguita. Sirtuine, tra cui SIRT2, sono di classe III istone deacetilasi di lisina, che sono distinti da altre deacetilasi in quanto richiedono NAD + per la loro funzione enzimatica. Coerentemente, nessun deacetilazione può essere rilevato mediante western blotting utilizzando un anticorpo anti-Ac K in assenza di NAD +, indipendentemente dalla presenza di SIRT2 cataliticamente attiva (figura 2, corsia 2 vs 1). Al contrario, diminuzione dei livelli acetilati della proteina acetilato quando entrambi SIRT2 e NAD + presenti nella reazione suggeriscono che la proteina può essere considerato come un bersaglio per deacetilazione SIRT2. Per verificare questi risultati, diversi controlli negativi possono essere utilizzati. Per esempio differenza nei livelli deacetilazione della proteina può essere rilevata quando un deacetilazione SIRT2 carente (SIRT2 H187Y) è utilizzata al posto della wild-type cataliticamente attivo SIRT2 (Figura 2, corsia 5 4 vs). effetto simile può essere visto quando un inibitore sirtuin consolidata, NAM, viene aggiunto alla miscela di reazione, il che implica che la diminuzione dei livelli acetilati della proteina è mediata dall'attività deacetilasi di SIRT2.

deacetilazione Aberrant è coinvolta in diversi processi cellulari e le malattie legate all'età. Così, un passo cruciale nella approfondire la nostra conoscenza per quanto riguarda l'interazione tra un deacetilasi e il suo substrato è di stabilire questa interconnessione in cellule in cui questo fenomeno può avere un impatto fisiologico. Inoltre, controllando deacetilazione in sistemi di coltura di cellule in vivo permette lo studio dell'evento deacetilazione in un contesto specifico cellula o tessuto che può essere facilmente collegata ad un fenotipo o risultato specifico. Ciò esclude la possibilità che il rilevato in vitro Deacattività etylation è artificiale dovuta alla presenza sia del deacetilasi e il suo substrato nel tubo, allo stesso tempo, che non può mai accadere in condizioni fisiologiche normali in cellule. Per il saggio deacetilazione in vivo, le cellule che sovraesprimono sia SIRT2 e SIRT2 H187Y nonche la proteina substrato possono essere utilizzati seguendo le procedure descritte in 2.1 e 2.2. Estratti cellulari preparati da queste cellule possono essere confermati per esprimere SIRT2, SIRT2 H187Y, e il substrato delle proteine ​​mediante Western blotting utilizzando anticorpi specifici. Nel saggio qui descritto, le proteine ​​espresse tutto esogeno sono contrassegnati per la facilità degli esperimenti eseguiti (Figura 3, pannello inferiore per rilevare SIRT2 HA-tagged / SIRT2 H187Y e pannello centrale per rilevare substrato proteina Flag-tag). Per determinare se la proteina bersaglio è un substrato deacetilazione di SIRT2, immunoprecipitazione viene eseguita utilizzando un anticorpo anti-Flag di abbattere la proteina bersaglio fsusseguiti mediante Western blotting utilizzando un anticorpo anti Ac-K. Diminuzione dei livelli acetilati della proteina nelle cellule che esprimono SIRT2 (Figura 3 pannello superiore, corsia 3 vs 2) e il fallimento di influenzare i livelli acetilati nelle cellule che esprimono la deacetilasi carente mutante SIRT2 (Figura 3 pannello superiore, corsia 4 vs 3) suggeriscono che la proteina acetilato può essere un obiettivo deacetilazione della deacetilasi specifica in vivo. Questo può essere confermato ulteriormente quando deacetilazione SIRT2-mediata è inibita dopo aver trattato le cellule con NAM (Figura 3 pannello superiore, corsia 5 vs 3) che stabilisce l'asse deacetilasi-substrato specifico nelle cellule studiate.

Figura 1
Figura 1: Purificazione sia della deacetilasi e la proteina-substrato acetilata da utilizzare per il saggio in vitro deacetilazione. (A) 1 pg di entrambi SIRT2 e SIRT2 H187Y (deacetilazione mutante difettivo) sono stati eseguiti su un gel seguendo il protocollo di purificazione come descritto al punto 1.1. Il gel è stato colorato con una soluzione colorante disponibile in commercio e dopo decolorazione, sia proteine ​​purificate può essere rilevato (superiore). Le proteine ​​possono essere rilevati dopo il trasferimento in PVDF membrana e western blotting utilizzando un anticorpo anti-Flag (inferiore). (B) 1 mg di proteina substrato e proteina substrato acetilato iper (alfa-enolasi è stato usato come substrato SIRT2 basato su spettrometria di massa dati non pubblicati generati nel nostro laboratorio) sono stati analizzati su un gel seguendo il protocollo di purificazione come descritto al punto 1.2. Il gel è stato colorato con una soluzione colorante disponibile in commercio e dopo decolorazione, il substrato proteina purificata può essere rilevata (superiore). L'acetilazione può essere rilevata dopo il trasferimento in PVDF membrana e western blotting utilizzando un anticorpo anti-Ac-K (centro). p totale roteins possono essere rilevati mediante un anticorpo anti-Flag (inferiore). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Saggio in vitro deacetilazione substrato proteina purificata acetilata (alfa-enolasi) viene incubato con SIRT2 o SIRT2 H187Y (deacetilazione mutante difettosa) in presenza di NAD + (corsie 4 e 5). Diminuzione livelli acetilato vengono rilevati mediante Western blotting utilizzando un anticorpo anti-Ac K in presenza di SIRT2 ma non in presenza di SIRT2 H187Y (corsia 4 vs 5). Nessuna attività deacetilazione si osserva quando NAD + non è compreso nella miscela di reazione (corsia 2 vs 4) o quando NAM viene aggiunto alla miscela di reazione (corsia 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. In vivo le cellule HEK293T deacetylation dosaggio stabile overexpressing sia SIRT2 o SIRT2 H187Y sono stati co-trasfettate con il substrato di proteine ​​(alfa-enolasi) e cappelli per aumentare i livelli della proteina acetilati (corsia 2 vs 1). Deacetilazione è stata controllata in vivo dopo immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-Flag di abbattere il substrato proteine ​​e western blotting utilizzando un anticorpo anti Ac-K. Acetilazione è notevolmente diminuita nelle cellule overexpressing SIRT2 rispetto al SIRT2 H187Y iperespressione di cellule (corsia 3 vs 4). La deacetilazione SIRT2-mediatadel substrato proteina è inibita quando le cellule vengono trattate con NAM (corsia 5 vs 3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

reazioni 1 2 3 4 (opzionale) 5 (opzionale)
purificato acetilata proteina-substrato (10 mg) + + + + +
tampone B + + + + +
SIRT2 purificato (2 mg) - + + - +
NAD + (1 mΜ) - - + + +
purificato SIRT2 H187Y (2 mg) - - - + -
NAM (10 mm) - - - - +

Tabella 1: ingredienti di reazione.

campioni sovraespressione stendere
1 pCDH-puro-GFP-vettore vuoto pLKO1 vettore vuoto o si ctr
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 sh SIRT2 1 o si SIRT2 1
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 sh SIRT2 2 o si SIRT2 2

Tabella 2: Proteine ​​campioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il progetto qui descritto è stato sostenuto da una sovvenzione da NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), così come dal Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - Il Lefkofsky Family Foundation / Liz e Research Award Eric Lefkofsky innovazione su AV Vorremmo per ringraziare i membri del laboratorio (Carol O'Callaghan ed Elizabeth Anne Wayne) per la lettura critica e la modifica di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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References

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