Deacetylation Assays sirtuins के बीच परस्पर क्रिया (SIRT2) और विशिष्ट प्रोटीन-substrates को जानने के लिए

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

1. इन विट्रो Deacetylation परख में

  1. SIRT2 की शुद्धि
    1. 10% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 8 मिलीलीटर DMEM में सुसंस्कृत और के बारे में 70% मिला हुआ अगले दिन होने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में उगाया HEK 293T कोशिकाओं के एक 10 सेमी संस्कृति पकवान तैयार करें।
    2. अगले दिन, सह transfect 4 माइक्रोग्राम pCDH-Puro-GFP-SIRT2-झंडा (हमारी प्रयोगशाला में किए गए lentivector), 4 माइक्रोग्राम pCMV- dR8.2 dvpr (पैकेजिंग वेक्टर) और 0.5 माइक्रोग्राम pCMV-VSV जी (लिफाफा वेक्टर) 18 पॉलीएथिलएमीन का उपयोग कर (पी) 3 μl पी / माइक्रोग्राम डीएनए के अनुपात में।
    3. 12 घंटे के बाद मीडिया को बदलें।
    4. 36-48 घंटे के बाद सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    5. मलबे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा निकालें।
    6. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करने के बाद, SIRT2 lentivirus के 1 मिलीलीटर aliquots बनाने के लिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    7. बर्फ पर पिघलना SIRT2 lentivirus (यह -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस स्टोर करने के लिए महत्वपूर्ण है, जब वायरस इस्तेमाल नहीं किया है)।
    8. 8 माइक्रोग्राम / एमएल polybrene की उपस्थिति में lentivirus के 1 मिलीलीटर के साथ 80-90% मिला हुआ HEK 293T कोशिकाओं का एक 6 अच्छी तरह से थाली को संक्रमित।
    9. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वायरस से संक्रमित कोशिकाओं अगले दिन (24 घंटे) तक रखें।
    10. 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें।
    11. संक्रमण के बाद 48 घंटा, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे GFP सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने के द्वारा संक्रमण दक्षता की जाँच करें।
    12. यदि संक्रमण दक्षता अच्छा है (कम से कम 40-50% संक्रमित कोशिकाओं), संस्कृति के माध्यम से 2 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin युक्त कोशिकाओं को व्यक्त करने पर स्थिर SIRT2 के लिए चयन करने के साथ मध्यम जगह।
      नोट: यह लगभग 2 सप्ताह लग जाते हैं, और मध्यम हर 3-4 दिनों बदल गया है। गैर संक्रमित कोशिकाओं को इस चयन की अवधि और SIRT2 lentivirus बढ़ने के साथ ही संक्रमित कोशिकाओं पर मर जाते हैं।
    13. एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा झंडा टैग SIRT2 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण: एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल पर कुल प्रोटीन के 40 माइक्रोग्राम चलाने के बाद (1 1,000 कमजोर पड़ने) purif शुरू करने से पहलेication प्रक्रिया (अनुशंसित) 19,20।
    14. 1 में सक्रिय SIRT2, विभाजन कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए: आदेश HEK 293T कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक overexpressing ध्वज-SIRT2 के लिए पर्याप्त व्यंजन है करने के लिए trypsinization द्वारा 3 अनुपात (दस 10 सेमी व्यंजन बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त प्रोटीन की शुद्धि के लिए अनुमति देगा)।
      1. कोशिकाओं trypsinize, संस्कृति मध्यम हटाने और बाँझ DPBS के साथ कोशिकाओं rinsing द्वारा अवशिष्ट सीरम खत्म करने के लिए। धीरे धीरे, सेल monolayer कवर 30-45 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेते एक 0.25% trypsin EDTA के समाधान के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। Trypsin-EDTA समाधान हटाने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू करते हैं। फिर संस्कृति के माध्यम से जोड़ने के लिए और नए व्यंजन कोशिकाओं हस्तांतरण।
    15. संस्कृति के माध्यम से निकालें, कोशिकाओं को दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर पीबीएस में धोने और centrifugation द्वारा पीछा trypsinization द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
    16. 500 μl lysis बफर ए (20 मिमी HEPES पीएच 7.9, 18 मिमी KCl, 0.2 मिमी EGTA, 1.5 मिमी 2 MgCl में Lyse सेल गोली20% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40) एक प्रोटीज अवरोधकों कॉकटेल और 1 माइक्रोन निरंतर रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए टीएसए भी शामिल है।
    17. एक नया ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट और हस्तांतरण सतह पर तैरनेवाला के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    18. एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी के रूप में नीचे वर्णित मोती agarose संयुग्मित का उपयोग कर immunoprecipitation प्रदर्शन करना।
      1. विरोधी झंडा एंटीबॉडी प्रोटीन lysate (10-20 मिलीग्राम कुल प्रोटीन) के लिए मोती agarose संयुग्मित के 200-300 μl जोड़ें।
      2. लगातार आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा immunoprecipitates लीजिए।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर गोली धो 10 मिलीलीटर lysis बफर एक साथ 5 बार। प्रत्येक धोने के बाद, मोती गोली और बफर ए के साथ सतह पर तैरनेवाला की जगह
    19. 1x करें पेप्टाइड समाधान (एक प्रोटीज अवरोधकों कॉकटेल और 1 पीबीएस में सुक्ष्ममापी टीएसए सहित) तैयार करें।
    20. 1x करें peptid के 500 μl जोड़ेagarose मोती के लिए ई समाधान और निरंतर रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    21. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    22. पिछले दो चरणों को दोहराएँ।
    23. सतह पर तैरनेवाला से मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 15,000 XG पर फिल्टर ट्यूब और centrifugation का उपयोग करके निकालें।
    24. eluted नमूना ध्यान लगाओ जब तक अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 1 माइक्रोग्राम है / एक ultrafiltration झिल्ली का उपयोग कर μl।
    25. eluted नमूने के 1 ग्राम का उपयोग कर प्रदर्शन कर वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्धिकरण की प्रक्रिया की जाँच करें।
    26. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धुंधला समाधान के साथ दाग जेल SIRT2 शुद्धि पुष्टि करने के लिए।
    27. -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध SIRT2 रखें।
  2. Acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट की शुद्धि
    1. के बारे में 70% मिला हुआ अगले दिन होने HEK 293T कोशिकाओं के साथ 10 सेमी x 10 सेमी संस्कृति व्यंजन तैयार करें।
    2. एक ध्वज के 5 ग्राम के साथ अगले दिन, सह transfect कोशिकाओं टैग की प्लाज्मिड वेक्टर Expressinजी प्रोटीन सब्सट्रेट के रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट एसिटाइल-ट्रांसफेरेज़ जो 3 μl पी / माइक्रोग्राम डीएनए के अनुपात में प्रोटीन पी का उपयोग कर सकते हैं acetylate के 5 माइक्रोग्राम।
      नोट: विशिष्ट एसिटाइल-ट्रांसफेरेज़ ज्ञात नहीं है, तो भी जाना जाता है हिस्टोन एसिटाइल-transferases ऐसे P300, सीबीपी, GCN5, Tip60 और PCAF के रूप में (टोपी) का एक मिश्रण के साथ सह-transfect।
    3. 12 घंटे के बाद मध्यम बदलें।
    4. दिन कोशिकाओं lysing से पहले, टीएसए / गुटनिरपेक्ष आंदोलन युक्त deacetylases बाधा प्रोटीन सब्सट्रेट के एसिटिलीकरण स्तर को अधिकतम करने के लिए माध्यम के साथ संस्कृति के माध्यम से जगह से 1 माइक्रोन टीएसए और 2 मिमी निकोटिनामाइड (एनएएम) रातोंरात के साथ कोशिकाओं का इलाज।
    5. अभिकर्मक के बाद 48 घंटा, संस्कृति के माध्यम से हटाने की कोशिकाओं को दो बार पीबीएस में centrifugation द्वारा पीछा trypsinization द्वारा 1,000 XG पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धोने और कोशिकाओं को इकट्ठा।
    6. डिश प्रति 500 ​​μl lysis बफर ए में Lyse सेल गोली (20 मिमी HEPES पीएच 7.9, 18 मिमी KCl, 0.2 मिमी EGTA, 1.5 मिमी MgCl2, 20% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40) एक प्रोटीज मैं भी शामिलnhibitors कॉकटेल, 1 माइक्रोन टीएसए और 2 मिमी निरंतर रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गुटनिरपेक्ष आंदोलन।
    7. एक नया ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट और हस्तांतरण सतह पर तैरनेवाला के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    8. एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी के रूप में नीचे वर्णित मोती agarose संयुग्मित का उपयोग कर immunoprecipitation प्रदर्शन करना।
      1. विरोधी झंडा एंटीबॉडी प्रोटीन lysate (10-20 मिलीग्राम कुल प्रोटीन) के लिए मोती agarose संयुग्मित के 200-300 μl जोड़ें।
      2. लगातार आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा immunoprecipitates लीजिए।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर गोली धो 10 मिलीलीटर lysis बफर एक साथ 2 बार। प्रत्येक धोने के बाद, मोती गोली और lysis बफर ए के साथ सतह पर तैरनेवाला की जगह
      5. गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर गुटनिरपेक्ष आंदोलन के बिना धो 10 मिलीलीटर lysis बफर एक साथ 3 बार। प्रत्येक धोने के बाद, मोती गोली और lysis बफर ए के साथ सतह पर तैरनेवाला की जगह यह importa हैNT deacetylation प्रतिक्रिया के लिए किसी भी गुट निरपेक्ष आंदोलन के ऊपर ले जाने के लिए नहीं।
    9. 1x करें पेप्टाइड समाधान (प्रोटीज अवरोधकों और पीबीएस में 1 माइक्रोन टीएसए सहित) तैयार करें।
    10. agarose मोती के लिए 1x करें पेप्टाइड समाधान के 500 μl जोड़ें और निरंतर रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    12. पिछले दो चरणों को दोहराएँ।
    13. सतह पर तैरनेवाला से मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 15,000 XG पर फिल्टर ट्यूब और centrifugation का उपयोग करके निकालें।
    14. एक ultrafiltration झिल्ली का प्रयोग, eluted नमूना ध्यान केंद्रित जब तक प्रोटीन एकाग्रता 1 माइक्रोग्राम / उल है।
    15. एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर eluted नमूने के 1 μl चलाने के द्वारा वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना।
    16. (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) और प्रोटीन सब्सट्रेट (कमजोर पड़ने विशिष्ट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है) पश्चिमी सोख्ता एसी-कश्मीर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन सब्सट्रेट के एसिटिलीकरण की पुष्टि करें।
    17. पुरी रखेंfied -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन सब्सट्रेट acetylated।
  3. इन विट्रो Deacetylation प्रतिक्रिया में
    1. Deacetylation बफर बी तैयार (50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 MgCl 0.5 माइक्रोन के टीएसए)
    2. 20 μl अंतिम मात्रा (तालिका 1) में अलग अलग ट्यूबों में 3 अलग प्रतिक्रियाओं तैयार करें।
    3. SIRT2 (वैकल्पिक) द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट के deacetylation पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं शामिल हैं। शुद्ध deacetylation अशक्त उत्परिवर्ती SIRT2 के 2 माइक्रोग्राम deacetylase सक्रिय SIRT2 के बजाय प्रतिक्रिया करने के लिए (इस प्रोटोकॉल 1.1 में वर्णित का उपयोग किया जा सकता है कि एक pCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag lentivector उपयोग करने के बाद) जोड़ें या 10 मिमी निकोटिनामाइड जोड़ने (एनएएम ) प्रतिक्रिया SIRT2 की deacetylation गतिविधि को बाधित करने के लिए (1 टेबल)।
    4. लगातार आंदोलन के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
    5. 2x नमूना बफर के 20 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और नमूने फोड़ा चया 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
    6. एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर प्रतिक्रिया मिश्रण चलाने के द्वारा वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन और एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने) का उपयोग प्रोटीन सब्सट्रेट पश्चिमी सोख्ता द्वारा की एसिटिलीकरण स्थिति का पता लगा 19,20।

2. विवो Deacetylation परख में

  1. संवर्धित कोशिकाओं में SIRT2 overexpression
    1. स्थिरतापूर्वक pCDH-Puro-GFP-खाली वेक्टर overexpressing HEK 293T कोशिकाओं के साथ 10 सेमी संस्कृति व्यंजन तैयार, pCDH-Puro-GFP-SIRT2-ध्वज और pCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (1.1 में वर्णित के रूप में) के बारे में 70 होना करने के लिए % मिला हुआ।
    2. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं के बारे में 70% मिला हुआ साथ 10 सेमी संस्कृति व्यंजन तैयार करने और वैक्टर 3 μl पी / माइक्रोग्राम डीएनए के अनुपात में पी का उपयोग कर उपर्युक्त 5 माइक्रोग्राम का उपयोग कर क्षणिक overexpression प्रदर्शन करते हैं।
    3. ध्वज-टी की overexpression प्रदर्शित करने के लिए: (1,000 कमजोर पड़ने 1) एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग कर कुल सेलुलर अर्क के पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करनाSIRT2 19 agged।
  2. संवर्धित कोशिकाओं में पछाड़ना SIRT2 को शाही सेना के हस्तक्षेप
    1. के बारे में 70% मिला हुआ अगले दिन होने HEK 293T कोशिकाओं के एक 10 सेमी संस्कृति पकवान तैयार करें।
    2. अगले दिन, सह transfect 4 माइक्रोग्राम pLKO1-Puro श SIRT2 (lentivector) 19, 4 माइक्रोग्राम pCMV- dR8.2 dvpr (पैकेजिंग वेक्टर) और 0.5 माइक्रोग्राम pCMV-VSV जी (लिफाफा वेक्टर) 18 पॉलीएथिलएमीन का उपयोग कर (पी) 3 μl पी / माइक्रोग्राम डीएनए के अनुपात में।
      नोट: SIRT2 नीचे दस्तक के लिए, हम pLKO.1 lentiviral आरएनएआई कंसोर्टियम (टीआरसी) द्वारा डिजाइन वेक्टर में सरल बाल के लिये कांटा shRNAs का उपयोग करें।
    3. 1.1 में वर्णित के रूप में shSIRT2 lentivirus उत्पादन और SIRT2 पछाड़ना लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने की प्रक्रिया का पालन करें।
    4. एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल पर कुल प्रोटीन के 40 माइक्रोग्राम चलाने के बाद कुशल SIRT2 पछाड़ना प्रदर्शित करने के लिए: (1,000 कमजोर पड़ने 1) एक विरोधी SIRT2 एंटीबॉडी का उपयोग कर कुल सेलुलर अर्क के पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करना।
    5. वैकल्पिक रूप से,कोशिकाओं के बारे में 70% मिला हुआ साथ 10 सेमी संस्कृति व्यंजन तैयार करने और निर्माता के निर्देशों का पालन siRNAs का उपयोग कर SIRT2 के क्षणिक पछाड़ना प्रदर्शन करते हैं।
    6. एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल पर कुल प्रोटीन के 40 माइक्रोग्राम चलाने के बाद कुशल SIRT2 पछाड़ना प्रदर्शित करने के लिए: (1,000 कमजोर पड़ने 1) एक विरोधी SIRT2 एंटीबॉडी का उपयोग कर कुल सेलुलर अर्क के पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करना।
  3. Immunoprecipitation और immunoblotting संवर्धित कोशिकाओं में Acetylated स्तर का पता लगाने के लिए
    1. या तो कोशिकाओं SIRT2 overexpressing से सेल छर्रों इकट्ठा करने से पहले 12 घंटा (2.1 ऊपर देखें) या SIRT2 कोशिकाओं (2.2 ऊपर देखें) नीचे गिरा दिया, गैर तीसरी कक्षा हिस्टोन deacetylases को बाधित करने के लिए संस्कृति के माध्यम से 1 माइक्रोन टीएसए जोड़ें।
    2. संस्कृति के माध्यम से निकालें, कोशिकाओं को दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर पीबीएस में धोने और centrifugation द्वारा पीछा trypsinization द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
    3. 10 मिलीलीटर lysis बफर ए (20 मिमी HEPES पीएच 7.9, 18 मिमी KCl, 0.2 मिमी EGTA, 1.5 जोड़ेमिमी 2 MgCl, 20% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40) एक प्रोटीज अवरोधकों कॉकटेल, 1 माइक्रोन टीएसए और 2 मिमी गुटनिरपेक्ष आंदोलन भी शामिल है।
    4. निरंतर रोटेशन के तहत 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा supernatants लीजिए।
    6. एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना।
    7. एक संदर्भ के रूप में उपयोग करते हुए lysis बफर ए का प्रयोग तालिका 2 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में स्थानांतरण नए ट्यूबों के लिए कुल प्रोटीन की 1 मिलीग्राम कोशिकाओं या तो overexpressing SIRT2 या SIRT2 पछाड़ना के बाद से प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए।
    8. एक immunoprecipitation एक साथ विशिष्ट प्रोटीन सब्सट्रेट के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन ए / जी के साथ प्रदर्शन (40 μl मनका घोल सिफारिश की है)। वैकल्पिक रूप से, सभी acetylated प्रोटीन immunoprecipitate करने के लिए एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी मोती agarose संयुग्मित (20 μl मनका घोल आमतौर पर पर्याप्त है) का उपयोग करें।
    9. consta के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेतेNT रोटेशन रात भर।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा immunoprecipitates लीजिए।
    11. मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर 1 मिलीलीटर बफर के साथ 5 बार धोएं।
    12. 2x नमूना बफर के 40 μl में Resuspend मोती।
    13. 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उबाल लें नमूने हैं।
    14. मोती को परेशान करते हुए eluted नमूने के हस्तांतरण के बिना एक 4-12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर eluted नमूने (2.3.12 कदम से 40 μl) चलाकर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना।
    15. एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट के Acetylated स्तर का पता लगाने (1: 1,000 कमजोर पड़ने) यदि एक प्रोटीन सब्सट्रेट विशिष्ट एंटीबॉडी immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया गया था, या प्रोटीन सब्सट्रेट के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी (के लिए सिफारिशों का पालन करें विशिष्ट एंटीबॉडी के बारे में कमजोर पड़ने) यदि विरोधी एसी-कश्मीर मोती immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया गया।

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Representative Results

एक प्रोटीन के लिए आदेश में दोनों इन विट्रो और इन विवो deacetylation assays में, deacetylation गतिविधि के साथ किसी भी एंजाइम के लिए एक वैध deacetylation लक्ष्य के रूप में विचार किया जाना deacetylase और उसके सब्सट्रेट के बीच परस्पर क्रिया स्थापित करने के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता। इन विट्रो deacetylase परख के लिए, दोनों deacetylase और Acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट की शुद्धि परख किया जा सकता से पहले आवश्यक है। यहाँ हम cytoplasmic sirtuin SIRT2 के रूप में विशिष्ट deacetylase अध्ययन किया जाना का उपयोग करें। SIRT2 एक deacetylase एंजाइम और एक उत्परिवर्ती जो deacetylase गतिविधि का अभाव का उपयोग अत्यधिक deacetylation परख के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सिफारिश की है। शोधन प्रक्रिया 1.1 में वर्णित का उपयोग करना, दोनों SIRT2 और SIRT2 H187Y सफलतापूर्वक 1 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता में शुद्ध किया जा सकता है। यह एक जेल धुंधला द्वारा पीछा पर शुद्ध प्रोटीन चलाने के बाद इस बात की पुष्टि की जा सकती है(चित्रा 1 ए, ऊपरी) के साथ ही पश्चिमी सोख्ता के बाद एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग कर के बाद से दोनों SIRT2 और SIRT2 H187Y एक झंडा पेप्टाइड (2A चित्रा, कम) के साथ टैग कर रहे हैं। एक ही शोधन प्रक्रिया कुछ संशोधनों के साथ प्रोटीन सब्सट्रेट की शुद्धि के लिए पीछा किया जा सकता। प्रोटीन से पहले यह deacetylation परख जिसका मतलब है कि यह विशिष्ट एसिटाइल ट्रांसफेरेज़ या प्रोटीन acetylate करने में सक्षम टोपी के एक मिश्रण overexpressing कोशिकाओं में शुद्ध किए जाने की जरूरत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता acetylated की जरूरत है। शोधन प्रक्रिया 1.2 में वर्णित का उपयोग करना, Acetylated प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1 बी, ऊपरी)। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि प्रोटीन वास्तव में acetylated है और इन विट्रो deacetylation परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता एसिटाइल-transferases (चित्रा 1 बी overexpressing कोशिकाओं में शुद्ध प्रोटीन की वृद्धि की acetylated स्तरों को दिखाने के लिए आवश्यक है, लोवआर)।

सफल प्रोटीन शुद्धि के बाद, इन विट्रो deacetylation परख प्रदर्शन किया जा सकता है। SIRT2 सहित sirtuins, तीसरी श्रेणी हिस्टोन लाइसिन deacetylases जो अन्य deacetylases से अलग कर रहे हैं क्योंकि वे अपनी एंजाइमी समारोह के लिए NAD + की आवश्यकता है। इस के साथ संगत, कोई deacetylation, NAD + के अभाव में एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता से पता लगाया जा सकता है catalytically सक्रिय SIRT2 की मौजूदगी की परवाह किए बिना (चित्रा 2, 2 लेन बनाम 1)। इसके विपरीत, Acetylated प्रोटीन की Acetylated स्तरों जब दोनों SIRT2 और NAD + प्रतिक्रिया में मौजूद हैं सुझाव है कि प्रोटीन SIRT2 के लिए एक deacetylation लक्ष्य के रूप में माना जा सकता है की कमी हुई। आदेश में इन परिणामों की पुष्टि करने के लिए, अलग-अलग नकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए प्रोटीन की deacetylation के स्तर में कोई अंतर का पता लगाया जा सकता है जब एक deacetylation कमी SIRT2 (एच 1 SIRT287Y)) बनाम 4 catalytically सक्रिय जंगली प्रकार SIRT2 (चित्रा 2, 5 लेन के बजाय प्रयोग किया जाता है। जब एक अच्छी तरह से स्थापित sirtuin अवरोध, गुटनिरपेक्ष आंदोलन, प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है, जिसका अर्थ है कि प्रोटीन के स्तर में कमी Acetylated SIRT2 की deacetylase गतिविधि के द्वारा मध्यस्थता है समान प्रभाव देखा जा सकता है।

न्यायपालिका deacetylation कई सेलुलर प्रक्रियाओं और उम्र से संबंधित बीमारियों में शामिल है। इस प्रकार, एक deacetylase और उसके सब्सट्रेट के बीच परस्पर क्रिया के बारे में हमारे ज्ञान को मजबूत बनाने में एक महत्वपूर्ण कदम है, जहां इस घटना एक शारीरिक प्रभाव हो सकता है कोशिकाओं में इस दूसरे का संबंध स्थापित करने के लिए है। इसके अलावा, विवो में सेल संस्कृति प्रणालियों में deacetylation जाँच के लिए एक सेल या ऊतक विशिष्ट संदर्भ में जो अधिक आसानी से एक विशिष्ट phenotype या परिणाम से जुड़ा जा सकता है में deacetylation घटना के अध्ययन की अनुमति देता है। इस बात की संभावना है कि इन विट्रो Deac में पता चला शामिल नहींetylation गतिविधि दोनों deacetylase और एक ही समय में ट्यूब में अपने सब्सट्रेट, की उपस्थिति जो कोशिकाओं में सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत कभी नहीं हो सकता के कारण कृत्रिम है। इन विवो deacetylation परख के लिए, दोनों SIRT2 और SIRT2 H187Y के साथ ही प्रोटीन सब्सट्रेट overexpressing कोशिकाओं प्रक्रियाओं 2.1 और 2.2 में वर्णित के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल इन कोशिकाओं से तैयार अर्क SIRT2, SIRT2 H187Y व्यक्त करने के लिए बात की पुष्टि की जा सकती है, और पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग। परख यहाँ वर्णित है, में सभी exogenously व्यक्त प्रोटीन प्रदर्शन प्रयोगों की आसानी (चित्रा 3, कम पैनल हा टैग SIRT2 / SIRT2 H187Y और मध्यम पैनल ध्वज टैग प्रोटीन सब्सट्रेट पता लगाने के लिए पता लगाने के लिए) के लिए टैग कर रहे हैं। चाहे वह लक्ष्य प्रोटीन SIRT2 की एक deacetylation सब्सट्रेट है निर्धारित करने के लिए, immunoprecipitation लक्ष्य प्रोटीन एफ नीचे खींचने के लिए एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता हैएक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा ollowed। SIRT2 व्यक्त कोशिकाओं में प्रोटीन की Acetylated स्तर में कमी (चित्रा 3 ऊपरी पैनल, 3 लेन बनाम 2) और deacetylase कमी SIRT2 उत्परिवर्ती व्यक्त कोशिकाओं में acetylated के स्तर को प्रभावित करने के लिए विफलता (चित्रा 3 ऊपरी पैनल, 4 लेन बनाम 3) का सुझाव है कि Acetylated प्रोटीन विवो में विशिष्ट deacetylase की एक deacetylation लक्ष्य हो सकता है। यह आगे की पुष्टि की जा सकती है जब SIRT2 की मध्यस्थता deacetylation अध्ययन कक्षों में (चित्रा 3 ऊपरी पैनल, 5 लेन बनाम 3) गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ कोशिकाओं के इलाज विशिष्ट deacetylase सब्सट्रेट अक्ष की स्थापना के बाद हिचकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: दोनों deacetylase और Acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट की शुद्धि के लिए इन विट्रो deacetylation परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा(ए) दोनों SIRT2 और SIRT2 H187Y (deacetylation दोषपूर्ण उत्परिवर्ती) के 1 माइक्रोग्राम 1.1 में वर्णित के रूप में शुद्धि प्रोटोकॉल के बाद एक जेल पर चलाए जा रहे थे। जेल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धुंधला समाधान के साथ और destaining के बाद सना हुआ था, दोनों शुद्ध प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है (ऊपरी)। प्रोटीन PVDF झिल्ली और पश्चिमी सोख्ता में स्थानांतरित करने के लिए एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी (कम) उपयोग करने के बाद पता लगाया जा सकता है। (बी) प्रोटीन सब्सट्रेट और हाइपर acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट के 1 माइक्रोग्राम 1.2 में वर्णित के रूप में शुद्धि प्रोटोकॉल के बाद एक जेल पर चलाए जा रहे थे (अल्फा-enolase एक SIRT2 मास स्पेक्ट्रोमेट्री अप्रकाशित हमारी प्रयोगशाला में उत्पन्न डेटा के आधार पर सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था)। जेल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धुंधला समाधान के साथ सना हुआ था और destaining के बाद, शुद्ध प्रोटीन सब्सट्रेट का पता लगाया जा सकता है (ऊपरी)। एसिटिलीकरण PVDF झिल्ली और पश्चिमी सोख्ता में स्थानांतरित करने के लिए एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी (मध्य) उपयोग करने के बाद पता लगाया जा सकता है। कुल पृ roteins एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी (कम) का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विट्रो deacetylation परख में शुद्ध Acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट (अल्फा-enolase) NAD + की उपस्थिति में SIRT2 या SIRT2 H187Y (deacetylation दोषपूर्ण उत्परिवर्ती) के साथ incubated है (गलियों 4 और 5)। Acetylated में कमी का स्तर SIRT2 की उपस्थिति में लेकिन SIRT2 H187Y की उपस्थिति (4 लेन बनाम 5) में नहीं एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता से पता चला रहे हैं। जब NAD + प्रतिक्रिया मिश्रण में शामिल नहीं है कोई deacetylation गतिविधि मनाया जाता है (2 लेन बनाम 4) या (4 लेन 6 बनाम) जब गुटनिरपेक्ष आंदोलन प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है।: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। विवो deacetylation परख HEK293T कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक या तो SIRT2 या SIRT2 H187Y overexpressing में प्रोटीन सब्सट्रेट (अल्फा-enolase) और टोपी के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे प्रोटीन (2 लेन बनाम 1) के Acetylated का स्तर बढ़ाने के लिए। Deacetylation प्रोटीन सब्सट्रेट और पश्चिमी सोख्ता एक विरोधी एसी-कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग कर नीचे खींचने के लिए एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitation के बाद विवो में जाँच की थी। एसिटिलीकरण काफी कोशिकाओं overexpressing SIRT2 H187Y की तुलना में SIRT2 overexpressing कोशिकाओं में कमी आई है (3 लेन बनाम 4)। SIRT2 की मध्यस्थता deacetylationप्रोटीन सब्सट्रेट की जब कोशिकाओं गुटनिरपेक्ष आंदोलन (5 लेन बनाम 3)। साथ व्यवहार कर रहे हिचकते क्लिक करें यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

प्रतिक्रियाओं 1 2 3 4 (वैकल्पिक) 5 (वैकल्पिक)
शुद्ध Acetylated प्रोटीन सब्सट्रेट (10 माइक्रोग्राम) + + + + +
बफर बी + + + + +
शुद्ध SIRT2 (2 माइक्रोग्राम) - + + - +
NAD + (1 mΜ) - - + + +
शुद्ध SIRT2 H187Y (2 माइक्रोग्राम) - - - + -
गुटनिरपेक्ष आंदोलन (10 मिमी) - - - - +

तालिका 1: रिएक्शन सामग्री।

नमूने overexpression मार गिराना
1 pCDH-Puro-GFP-खाली वेक्टर pLKO1 खाली वेक्टर या एसआई सीटीआर
2 pCDH-Puro-GFP-SIRT2 झंडा pLKO1 श SIRT2 1 या सी SIRT2 1
3 pCDH-Puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 श SIRT2 2 या 2 सी SIRT2

तालिका 2: प्रोटीन के नमूने।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

परियोजना यहाँ वर्णित एनआईएच / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) से अनुदान के रूप में अच्छी तरह से रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था - Lefkofsky परिवार फाउंडेशन / लिज़ और एरिक Lefkofsky अभिनव अनुसंधान पुरस्कार ए वी के लिए हम चाहते हैं महत्वपूर्ण पढ़ने और इस पांडुलिपि संपादन के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों (कैरल O'Callaghan और एलिजाबेथ ऐनी वेन) का शुक्रिया अदा करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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References

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