Deacetylierung Assays zu entwirren, das Zusammenspiel zwischen Sirtuine (SIRT2) und spezifische Protein-Substrate

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

1. In - vitro - Deacetylierung Assay

  1. Reinigung von SIRT2
    1. Bereiten Sie eine 10 cm Kulturschale von HEK 293T - Zellen, die in 8 ml DMEM mit 10% FBS und Antibiotika , und in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur - Inkubator zu etwa 70% konfluent am nächsten Tag gezüchtet.
    2. Am nächsten Tag, Co-transfizieren 4 ug pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector in unserem Labor hergestellt), 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (Verpackung Vektor) und 0,5 ug pCMV-VSV-G (Umschlag Vektor) 18 unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) mit einem Verhältnis von 3 & mgr; l PEI / ug DNA.
    3. Ändern Medien nach 12 Stunden.
    4. Sammeln Überstand nach 36 bis 48 Stunden.
    5. Entfernen Trümmer durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
    6. Nach dem Filtrieren durch 0,22 um Filter, stellen Sie 1 ml Aliquots von Lentiviren SIRT2 und halten bei -80 ° C.
    7. Auftau SIRT2 Lentivirus auf Eis (ist es wichtig, den Virus bei -80 ° C zu speichern, wenn das Virus nicht verwendet wird,).
    8. Infect eine 6-Well-Platte von 80-90% konfluente HEK 293T-Zellen mit 1 ml von Lentivirus in Gegenwart von 8 ug / ml Polybren.
    9. Platzieren virusinfizierten Zellen in 37 ° C-Inkubator bis zum nächsten Tag (24 h).
    10. Ersetzen Medium nach 24 Stunden.
    11. 48 Stunden nach der Infektion, überprüfen Infektionseffizienz durch den Nachweis GFP-positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
    12. Wenn Infektionseffizienz gut ist (mindestens 40-50% infizierte Zellen), ersetzen Medium mit Kulturmedium 2 ug / ml Puromycin mit über exprimierenden Zellen für eine stabile SIRT2 auszuwählen.
      Anmerkung: Dies dauert etwa 2 Wochen, und das Medium alle 3-4 Tage gewechselt wird. Nicht infizierte Zellen sterben über diese Selektionsperiode und nur mit dem SIRT2 Lentiviren wachsen infizierten Zellen.
    13. Analysieren Expression von FLAG-markiertem SIRT2 durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) nach 40 Lauf ug Gesamtprotein auf einem 10% SDS-PAGE-Gel vor dem purif Ausgangsication Verfahren (empfohlen) 19,20.
    14. Zur Reinigung aktive SIRT2, geteilte Zellen in Verhältnis 1: 3 durch Trypsinierung, um ausreichend Geschirr von HEK 293T-Zellen zu haben, stabil überexprimieren Flag-SIRT2 (Zehn 10-cm-Schalen wird die Reinigung von ausreichend Protein für nachfolgende Experimente erlauben).
      1. Um die Zellen trypsinize, Kulturmedium zu entfernen und Rest Serum beseitigen, indem Zellen mit sterilem DPBS gespült wurde. Langsam 2,5 ml einer Lösung, die 0,25% Trypsin-EDTA fügen Sie die Zellschicht zu bedecken, bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Sekunden inkubiert. bei 37 ° C Nach der Trypsin-EDTA-Lösung zu entfernen, Inkubation, bis die Zellen zu lösen beginnen. Dann Kulturmedium hinzufügen und übertragen Zellen zu neuen Gerichten.
    15. Entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
    16. Lyse Zellpellet in 500 ul Lysepuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl 2, 20% Glycerol, 0,1% NP-40) für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation einer Protease-Inhibitoren-Cocktail und 1 uM TSA einschließlich.
    17. Zentrifuge bei 14.000 xg für 15 min bei 4 ° C und Überstand in ein neues Röhrchen.
    18. Führen Immunpräzipitation eines Anti-Flag-Antikörpers, konjugiert an Agarose beads wie unten beschrieben.
      1. In 200-300 ul Anti-Flag-Antikörper konjugiert Perlen an das Proteinlysat an Agarose (10-20 mg Gesamtprotein).
      2. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter konstantem Rühren.
      3. Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
      4. Waschen des Pellets 5 mal mit 10 ml Lyse-Puffer A bei 1000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen pelletieren und den Überstand mit Puffer A ersetzen
    19. Bereiten Sie 1x Flag-Peptid-Lösung (einschließlich einer Protease-Inhibitoren-Cocktail und 1 uM TSA in PBS).
    20. In 500 ul 1x Flag Peptid-e Lösung der Agarose-Kügelchen und 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation inkubiert.
    21. Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 2 min bei 4 ° C.
    22. Wiederholen Sie vorherigen zwei Schritten.
    23. Entfernen von Überstand Kügelchen unter Verwendung von Filterrohren und Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C.
    24. Konzentrat eluierten Probe, bis die endgültige Proteinkonzentration 1 & mgr; g / & mgr; l unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran.
    25. Überprüfen Reinigungsprozess durch Ausführen einer Elektrophorese unter Verwendung von 1 & mgr; g der eluierten Probe.
    26. Stain Gel mit einem handelsüblichen Färbelösung SIRT2 Reinigung zu bestätigen.
    27. Halten gereinigter SIRT2 bei -80 ° C.
  2. Reinigung von Acetylated Protein-Substrat
    1. Herstellung von 10 cm x 10 cm-Kulturschalen mit HEK 293T-Zellen etwa 70% konfluent am nächsten Tag.
    2. Am nächsten Tag, Co-transfizieren Zellen mit 5 ug einer Flagge markiert Plasmidvektor expressing die Protein-Substrat sowie 5 ug des spezifischen Acetyl-Transferase, die das Protein unter Verwendung von PEI mit einem Verhältnis von 3 & mgr; l PEI / ug DNA acetylieren kann.
      Hinweis: Wenn die spezifische Acetyl-Transferase ist nicht bekannt, Co-transfizieren mit einer Mischung aus bekannten Histon Acetyl-Transferase (HATs) wie p300, CBP, GCN5, Tip60 und PCAF.
    3. Ändern Medium nach 12 Stunden.
    4. Am Tag vor der Lyse der Zellen, Behandlung der Zellen mit 1 uM TSA und 2 mM Nicotinamid (NAM) über Nacht durch das Kulturmedium mit Medium ersetzt TSA / NAM enthält Acetylierung Konzentrationen des Proteins-Substrat zu maximieren, indem Deacetylasen gehemmt wird.
    5. 48 h nach der Transfektion entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
    6. Lyse Zellpellet in 500 ul Lysepuffer A pro Schale (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% Glycerin, 0,1% NP-40) mit einer Protease inhibitors Cocktail, 1 uM TSA und 2 mM NAM für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation.
    7. Zentrifuge bei 14.000 xg für 15 min bei 4 ° C und Überstand in ein neues Röhrchen.
    8. Führen Immunpräzipitation eines Anti-Flag-Antikörpers, konjugiert an Agarose beads wie unten beschrieben.
      1. In 200-300 ul Anti-Flag-Antikörper konjugiert Perlen an das Proteinlysat an Agarose (10-20 mg Gesamtprotein).
      2. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter konstantem Rühren.
      3. Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
      4. Waschen Sie das Pellet 2 mal mit 10 ml Lyse-Puffer A bei 1000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen Pellet und der Überstand mit Lysepuffer A. ersetzen
      5. Waschen Sie das Pellet 3 mal mit 10 ml Lysepuffer A ohne NAM bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen Pellet und der Überstand mit Lysepuffer A. ersetzen Es ist important kein NAM zur Deacetylierungsreaktion zu übertragen.
    9. Bereiten Sie 1x Flag-Peptid-Lösung (einschließlich Protease-Inhibitoren und 1 uM TSA in PBS).
    10. Hinzufügen 500 ul 1x Flag Peptidlösung an die Agarose-Kügelchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation.
    11. Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 2 min bei 4 ° C.
    12. Wiederholen Sie vorherigen zwei Schritten.
    13. Entfernen von Überstand Kügelchen unter Verwendung von Filterrohren und Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C.
    14. Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert eluierten Probe, bis die Proteinkonzentration 1 & mgr; g / ul ist.
    15. Führen Elektrophorese durch Ausführen von 1 & mgr; l der eluierten Probe auf einem 4-12% SDS-PAGE-Gel.
    16. Bestätigen Acetylierung von Protein-Substrat durch Western-Blotting Antikörper gegen Ac-K unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) und dem Protein-Substrat (Verdünnung hängt von der spezifischen Antikörper verwendet wird).
    17. Halten Sie purified acetyliertes Protein-Substrat bei -80 ° C.
  3. In - vitro - Deacetylierungsreaktion
    1. Bereiten Sie die Deacetylierung Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 0,5 uM TSA)
    2. Vorbereitung 3 verschiedene Reaktionen in unterschiedlichen Röhren in 20 ul Endvolumen (Tabelle 1).
    3. Fügen Sie zusätzliche Reaktionen Deacetylierung des Proteins-Substrat durch SIRT2 (optional) zu bestätigen. In 2 ug gereinigtes Deacetylierung Nullmutante SIRT2 (dies beschrieben durchgeführt werden kann in 1.1 unter Verwendung des Protokolls nach einem pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge lentivector verwenden) , um die Reaktion anstelle von Deacetylase aktiven SIRT2 oder fügen Sie 10 mM Nicotinamid (NAM ) zum Reaktions die Deacetylierung Aktivität von SIRT2 (Tabelle 1) zu hemmen.
    4. Inkubieren Reaktionen 3 Stunden bei 30 ° C unter konstantem Rühren.
    5. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 ul 2x Probenpuffer und kochen Sie die Proben foder 10 min bei 95 ° C.
    6. Führen Elektrophorese indem die Reaktionsmischung, die auf einem 4-12% SDS-PAGE - Gel und erfassen die Acetylierung Status des protein Substrat durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper (1: 1000 Verdünnung) 19,20.

2. In - vivo - Deacetylierung Assay

  1. SIRT2 Überexpression in kultivierten Zellen
    1. Bereiten Sie 10 cm Kulturschalen mit HEK 293T - Zellen , die stabil pcdh-puro-GFP-leeren Vektor, pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag und pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge überexprimieren (wie in 1.1 beschrieben) werden etwa 70 % konfluent.
    2. Verwendung von 5 ug der genannten Vektoren oben unter Verwendung PEI in einem Verhältnis von 3 & mgr; l PEI / ug DNA Alternativ bereiten 10 cm-Kulturschalen mit Zellen etwa 70% konfluent und transiente Überexpression durchzuführen.
    3. Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti-Flag-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) Überexpression von Flag-t nachweisenagged SIRT2 19.
  2. RNA-Interferenz zu Sturz SIRT2 in kultivierten Zellen
    1. Bereiten Sie eine 10 cm Kulturschale von HEK 293T-Zellen etwa 70% konfluent am nächsten Tag zu sein.
    2. Am nächsten Tag, Co-transfizieren 4 ug pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (Verpackung Vektor) und 0,5 ug pCMV-VSV-G (Umschlag Vektor) 18 unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) bei einem Verhältnis von 3 & mgr; l PEI / ug DNA.
      Hinweis: Für SIRT2 Klopfen nach unten, wir einfache haarnadel shRNAs im pLKO.1 lentiviralen Vektor verwenden entworfen von RNAi Consortium (TRC).
    3. Folgen Sie dem Verfahren , wie in 1.1 beschrieben shSIRT2 Lentiviren zu produzieren und zu infizieren Zielzellen SIRT2 zu Knockdown.
    4. Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti SIRT2 Antikörper (1: 1000 Verdünnung) effizient SIRT2 Zuschlags zu demonstrieren , nachdem auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 40 & mgr; g Gesamtprotein ausgeführt wird .
    5. Alternative,10 cm Kulturschalen mit Zellen etwa 70% konfluent vorbereiten und transiente Knockdown von SIRT2 führen siRNAs folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
    6. Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti SIRT2 Antikörper (1: 1000 Verdünnung) effizient SIRT2 Zuschlags zu demonstrieren , nachdem auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 40 & mgr; g Gesamtprotein ausgeführt wird .
  3. Immunpräzipitation und Immunoblotting zum Nachweis von Acetylated Levels in kultivierten Zellen
    1. 12 Stunden vor der Zellpellets aus entweder Zellen sammeln SIRT2 überexprimieren (siehe 2.1) oder SIRT2 umgeworfen Zellen (siehe 2.2), 1 hinzufügen , um TSA in das Kulturmedium nicht Klasse - III - Histon - Deacetylasen zu hemmen.
    2. Entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
    3. 10 ml Lysepuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl 2, 20% Glycerol, 0,1% NP-40) mit einem Protease - Inhibitoren - Cocktail, 1 uM TSA und 2 mM NAM.
    4. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min unter konstanter Rotation.
    5. Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 20.000 xg für 15 Minuten bei 4 ° C.
    6. Berechnen Proteinkonzentration durch einen Bradford-Proteintest verwendet wird.
    7. Transfer 1 mg Gesamtprotein in neue Röhrchen in einem Endvolumen von 1 ml Lysepuffer A. Verwenden Tabelle 2 als Referenz unter Verwendung von Protein - Proben von Zellen entweder überexprimieren SIRT2 oder nach SIRT2 Zuschlags vorzubereiten.
    8. Durchführen einer Immunpräzipitation einen Antikörper gegen das spezifische Protein-Substrat unter Verwendung zusammen mit Protein A / G (40 & mgr; l Bead-Aufschlämmung wird empfohlen). Alternativ können Sie auch eine Anti Ac-K-Antikörper konjugiert Perlen an Agarose (20 & mgr; l Kügelchenaufschlämmung ist in der Regel genug), um alle acetylierte Proteine ​​Immunpräzipitation.
    9. Inkubieren Proben bei 4 ° C unter constant Rotation über Nacht.
    10. Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1000 × g für 2 min bei 4 ° C.
    11. Waschen Perlen 5 mal mit 1 ml Puffer A bei 1000 xg für 2 Minuten bei 4 ° C.
    12. Resuspendieren Perlen in 40 ul 2x Probenpuffer.
    13. Boil Proben für 10 min bei 95 ° C.
    14. Führen Elektrophorese durch die eluierten Proben ausgeführt wird (40 & mgr; l aus Schritt 2.3.12) auf einem 4-12% SDS-PAGE Gel ohne die Perlen zu stören, während die eluierten Proben übertragen.
    15. Erkennen acetylierten Ebenen des protein Substrat durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Ac-K-Antikörper (1: 1000 Verdünnung), wenn ein Protein-Substrat-spezifische Antikörper zur Immunpräzipitation verwendet wurde, oder ein spezifischer Antikörper gegen das Protein-Substrat (folgen Empfehlungen der spezifische Antikörper bezüglich Verdünnung), wenn anti Ac-K Perlen für die Immunpräzipitation verwendet wurden.

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Representative Results

Um für ein Protein als eine legitime Deacetylierung Ziel für jedes Enzym mit Deacetylierung Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo Assays Deacetylierung werden müssen , durchgeführt , um festzustellen , das Zusammenspiel zwischen der Deacetylase und ihr Substrat berücksichtigt werden. Für die in vitro - Deacetylase - Assay wird die Reinigung sowohl der Deacetylase und dem acetylierten Proteinsubstrat erforderlich ist , bevor der Assay durchgeführt werden kann. Hier nutzen wir die zytoplasmatische sirtuin SIRT2 als die spezifische Deacetylase sucht werden. SIRT2 ist ein Deacetylase-Enzym und die Verwendung einer Mutante, die das Deacetylase-Aktivität fehlt, ist hoch als negative Kontrolle für die Deacetylierung Assays empfohlen. Verwendung des Reinigungsverfahrens beschrieben in 1.1, sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y kann erfolgreich bei einer Endkonzentration von 1 ug / ul , gereinigt werden. Dies kann nach der gereinigten Proteine ​​auf einem Gel durch Färben, gefolgt Lauf bestätigt werden(1A, obere) sowie nach Western - Blotting unter Verwendung eines Anti-FLAG - Antikörper , da sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y markiert werden mit einem Flag - Peptid (2A, unten). Das gleiche Reinigungsverfahren können zur Reinigung des Proteinsubstrats mit einigen Modifikationen folgen. Das Protein muss acetyliert werden, bevor es für die Deacetylierung Assay verwendet werden, was bedeutet, dass es in Zellen gereinigt werden muss, die spezifische Acetyltransferase oder eine Mischung aus HATs der Lage, das Protein zu überexprimieren acetylieren. Verwendung des Reinigungsverfahrens in 1.2 beschrieben, kann das acetylierte Protein gereinigt werden (1B, oben). Um zu bestätigen , daß das Protein tatsächlich acetyliert ist und für die in vitro Deacetylierung Assay verwendet werden, Western Blotting eine anti Ac-K - Antikörpers erforderlich ist , erhöht acetyliert Niveaus des gereinigten Proteins in Zellen zu zeigen , die Acetyl-Transferasen (1B überexprimieren, lower).

Nach erfolgreicher Proteinreinigung kann die in vitro - Assay Deacetylierung durchgeführt werden. Sirtuine, einschließlich SIRT2, sind Klasse III Histon - Lysin - Deacetylasen , die aus anderen Deacetylasen verschieden sind , wie sie NAD + für ihre enzymatische Funktion benötigen. In Übereinstimmung damit kann kein Deacetylierung durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper in Abwesenheit von NAD +, unabhängig von der Anwesenheit von katalytisch aktiven SIRT2 (Figur 2, Spur 2 vs 1) detektiert werden. Im Gegenteil verringert acetylierten Ebenen des acetylierten Protein , wenn sowohl SIRT2 und NAD + in der Reaktion vorhanden sind , legen nahe , dass das Protein als ein Target für Deacetylierung SIRT2 betrachtet werden. Um können diese Ergebnisse, verschiedene negative Kontrollen zur Überprüfung verwendet werden. Zum Beispiel kann kein Unterschied in der Deacetylierung Niveaus des Proteins nachgewiesen werden , wenn eine Deacetylierung defizienten SIRT2 (H1 SIRT287Y) anstelle der katalytisch aktiven Wildtyp SIRT2 (Abbildung 2, Spur 5 vs 4). Ein ähnlicher Effekt kann, wenn impliziert eine gut etablierte sirtuin Inhibitor, NAM, hinzugefügt wird zu der Reaktionsmischung gesehen werden, daß die Abnahme in den acetylierten Niveaus des Proteins durch die Deacetylase-Aktivität der SIRT2 vermittelt wird.

Aberrant Deacetylierung wird in verschiedenen zellulären Prozessen und altersbedingten Krankheiten beteiligt. Somit ist ein entscheidender Schritt, um unser Wissen über das Zusammenspiel zwischen einem Deacetylase und ihr Substrat in die Vertiefung ist diese Verbindung in den Zellen zu schaffen, wo dieses Phänomen eine physiologische Wirkung haben kann. Darüber hinaus ermöglicht die Überprüfung Deacetylierung in Zellkultursystemen in vivo die Untersuchung der Deacetylierung Ereignisses in einer Zelle oder einem Gewebe spezifischen Kontext , die leichter zu einem bestimmten Phänotyp oder Ausgang verbunden werden kann. Dies schließt die Möglichkeit , dass die in vitro DEAC nachgewiesenetylation Aktivität ist künstlich aufgrund des Vorhandenseins sowohl der Deacetylase und seinem Substrat in dem Rohr zur gleichen Zeit, die unter normalen physiologischen Bedingungen in den Zellen kann nie passieren. Für die in vivo Deacetylierung Assay Zellen sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y sowie das Proteinsubstrat überexprimieren kann in 2.1 und 2.2 beschrieben nach den Verfahren verwendet werden. Zellextrakte aus diesen Zellen hergestellt wird, kann bestätigt werden SIRT2, SIRT2 H187Y und das Proteinsubstrat durch Western - Blotting unter Verwendung spezifischer Antikörper zu exprimieren. In dem Test hier beschrieben, alle exogen exprimierten Proteine ​​sind für eine einfache durchgeführten Experimente markiert (Abbildung 3, untere Platte HA-markierte SIRT2 / SIRT2 H187Y und Mitteltafel zu erkennen Flag-markierten Proteinsubstrat zu erkennen). Um zu bestimmen, ob das Zielprotein ein Deacetylierung Substrat von SIRT2 ist, Immunopräzipitation erfolgt mit Hilfe eines Anti-Flag-Antikörper unter Verwendung des Zielproteins f nach unten ziehenollowed durch Western-Blot eine Anti Ac-K-Antikörper verwendet wird. Abnahme der acetylierten Niveaus des Proteins in Zellen SIRT2 (Abbildung 3 obere Platte, Bahn 3 vs 2) und Versagen exprimierenden zu acetyliert Niveaus in Zellen, die Deacetylase defizienten SIRT2 Mutante (Figur 3 obere Platte, Bahn 4 vs 3) beeinflussen lassen vermuten , dass das acetylierte Protein kann eine Deacetylierung Ziel der spezifischen Deacetylase in vivo sein. Dies kann weiter bestätigt werden , wenn SIRT2-vermittelte Deacetylierung nach der Behandlung von Zellen mit NAM (Abbildung 3 obere Platte, Spur 5 vs 3) zur Messung der spezifischen Deacetylase-Substrat - Achse in den untersuchten Zellen gehemmt wird.

Abbildung 1
Abbildung 1: Reinigung von sowohl der Deacetylase und dem acetylierten Protein-Substrat für die in vitro Assay verwendet werden Deacetylierung. (A) 1 ug sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y (Deacetylierung defekte Mutante) auf einem Gel nach dem Reinigungsprotokoll ausgeführt wurden , wie in 1.1 beschrieben. Das Gel wurde mit einem handelsüblichen Färbelösung gefärbt und nach Entfärben sowohl gereinigter Proteine ​​(oberen) nachgewiesen werden. Proteine ​​können nach der Übertragung in eine PVDF-Membran detektiert und Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörper (niedriger). (B) 1 & mgr; g Proteinsubstrat und hyper acetyliert Proteinsubstrat (alpha-Enolase wurde als SIRT2 Substrat auf Basis von Massenspektrometrie unpublizierte Daten erzeugt in unserem Labor verwendet) wurden auf einem Gel nach dem Reinigungsprotokoll laufen , wie in 1.2 beschrieben. Das Gel wurde mit einem handelsüblichen Färbelösung gefärbt und nach der Entfärbung, die gereinigte Proteinsubstrat kann (oben) nachgewiesen werden. Acetylierung kann nach der Übertragung in PVDF-Membran und Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Ac-K-Antikörper (mittlere) nachgewiesen werden. Gesamt p roteins kann unter Verwendung eines Anti-Flag - Antikörper (untere) nachgewiesen werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig . 2: In vitro - Assay Deacetylierung Purified acetylierten Proteinsubstrat (alpha-Enolase) mit SIRT2 oder SIRT2 H187Y (Deacetylierung defekte Mutante) in Gegenwart von NAD + inkubiert (Spuren 4 und 5). Verminderte acetylierten Pegel werden durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper in Gegenwart von SIRT2 aber nicht in Gegenwart von SIRT2 H187Y (Spur 4 vs 5) detektiert. Keine Deacetylierung Aktivität beobachtet wird , wenn NAD + nicht in der Reaktionsmischung (Spur 2 vs 4) enthalten oder wenn NAM zu dem Reaktionsgemisch gegeben (Spur 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abb . 3: In - vivo - Deacetylierung Assay HEK293T Zellen , die stabil entweder SIRT2 oder SIRT2 H187Y überexprimierenden wurden kotransfiziert mit dem Proteinsubstrat (alpha-Enolase) und HATs die acetylierten Konzentrationen des Proteins zu erhöhen (Spur 2 vs 1). Deacetylierung wurde in vivo nach Immunpräzipitation mit einem Anti-Flag - Antikörper nach unten ziehen , das Proteinsubstrat und Western - Blot unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper geprüft. Die Acetylierung ist deutlich zurückgegangen in den SIRT2 überexprimierenden Zellen wie zum SIRT2 H187Y verglichen Zellen (Spur 3 vs 4) überexprimieren. Die SIRT2-vermittelte Deacetylierungdes Proteinsubstrat verhindert wird , wenn die Zellen mit NAM (Bahn 5 gegen 3) behandelt werden. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Reaktionen 1 2 3 4 (optional) 5 (optional)
gereinigtes acetyliertes Protein-Substrat (10 & mgr; g) + + + + +
Puffer B + + + + +
gereinigtes SIRT2 (2 ug) - + + - +
NAD + (1 mu) - - + + +
gereinigtes SIRT2 H187Y (2 ug) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tabelle 1: Reaktionsbestandteile.

Proben Überexpression niederschlagen
1 pcdh-puro-GFP-leeren Vektor pLKO1 leeren Vektor oder si ctr
2 pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flagge pLKO1 sh SIRT2 1 oder si SIRT2 1
3 pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge pLKO1 sh SIRT2 2 oder si SIRT2 2

Tabelle 2: Die Proteinproben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Das hier beschriebene Projekt wurde durch einen Zuschuss von NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) sowie von der Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center unterstützt - Die Lefkofsky Family Foundation / Liz und Eric Lefkofsky Innovation Research Award Wir auf AV möchten Mitglieder des Labors (Carol O'Callaghan und Elizabeth Anne Wayne) für das kritische Lesen und Bearbeiten dieses Manuskript zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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References

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