脱乙酰测定解开蛋白特异底物乙酰化酶之间的Interplay(SIRT2)和

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

1. 在体外试验脱乙酰

  1. SIRT2纯化
    1. 准备在8ml含10%FBS和抗生素的培养,并在37℃,5%CO 2的组织培养箱中生长至约70%汇合,第二天的HEK 293T细胞的10cm的培养皿。
    2. 第二天,共转染4微克PCDH-普罗-GFP-SIRT2-标志(在我们的实验室制成慢病毒),4微克pCMV- dR8.2 DVPR(包装载体)和0.5微克的pCMV-VSV-G(包络线矢量) 18使用聚乙烯亚胺(PEI)在3微升的PEI /微克DNA的一比值。
    3. 经过12小时更换介质。
    4. 后36-48小时收集上清。
    5. 离心1000 XG 5分钟,4℃清除杂物。
    6. 通过0.22微米的过滤器过滤后,使SIRT2慢病毒的1ml等份,并保持在-80℃。
    7. 在冰上解冻SIRT2慢病毒(对病毒储存在-80℃下是很重要的,当不使用病毒)。
    8. 感染80-90%汇合的HEK 293T细胞的6孔平板,在8微克/毫升聚凝胺的具有1毫升的慢病毒。
    9. 放置在37℃培养箱中病毒感染的细胞,直到第二天(24小时)。
    10. 24小时后更换培养基。
    11. 感染后48小时,通过在荧光显微镜下检测GFP阳性细胞检查感染效率。
    12. 如果感染效率是好的(至少40-50%感染的细胞),含有2微克/毫升嘌呤霉素的培养基中过表达的细胞,选择稳定SIRT2更换介质。
      注意:这大约需要2周,并且将培养基每3-4天更换一次。非感染细胞的死亡在这个选择期间,只感染细胞的慢病毒SIRT2增长。
    13. 在10%SDS-PAGE凝胶上运行40微克总蛋白后:(1,000稀释1)在开始PURIF之前通过Western印迹使用抗Flag抗体分析Flag标记SIRT2的表达ication过程(推荐)19,20。
    14. 净化活性SIRT2,分裂细胞以1:3的比例通过胰蛋白酶消化,以便有HEK 293T细胞稳定过表达的Flag-SIRT2的足够菜(十10厘米菜将使随后的实验够蛋白的纯化)。
      1. 到trypsinize的细胞,除去培养基,并通过漂洗细胞,用无菌DPBS消除残余的血清。慢慢加入2.5 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液中,以覆盖细胞单层,在室温下孵育30-45秒。除去胰蛋白酶-EDTA溶液后,孵育在37℃,直至细胞开始分离。再加入培养液和细胞转移到新菜。
    15. 除去培养基,在4℃下以1000 xg离心在PBS洗涤细胞两次,并收集通过胰蛋白酶的细胞,然后离心10分钟。
    16. 于500μl裂解缓冲液A(20mM的HEPES pH值7.9,18毫米氯化钾,0.2mM的EGTA,1.5mM的MgCl 2的裂解细胞沉淀,20%甘油,0.1%NP-40),其包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒和下恒定旋转1μM的TSA的30分钟,在4℃。
    17. 离心机在14000 xg离心在4℃下15分钟,并转移上清液至新管。
    18. 使用缀合,如下所述琼脂糖珠粒的抗Flag抗体进行免疫沉淀。
      1. 添加200-300微升偶联至琼脂糖珠的蛋白质裂解物(10-20毫克总蛋白)抗Flag抗体的。
      2. 在4℃下以恒定的搅拌温育过夜。
      3. 收集离心免疫沉淀在1000 xg离心在4℃下5分钟。
      4. 洗涤沉淀5次,用10ml裂解缓冲液A以1000 xg离心在4℃下5分钟。每次洗涤后,沉淀珠子和替换用缓冲液A将上清液
    19. 制备1×FLAG肽溶液(包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1μM的TSA在PBS中)。
    20. 加入500μl1X标志肽类的Ë溶液到琼脂糖珠,并在4℃下恒定旋转温育30分钟。
    21. 收集离心上清在6000 xg离心在4℃下2分钟。
    22. 重复前两个步骤。
    23. 通过使用过滤管和离心15,000 XG 1分钟,4℃卸下上清珠。
    24. 浓缩洗脱样品,直到最终蛋白质浓度为1微克/微升使用超滤膜。
    25. 通过使用洗脱样品的1微克进行电泳检查纯化过程。
    26. 用市售的染色液染色凝胶来确认SIRT2纯化。
    27. 保持纯净SIRT2在-80℃。
  2. 乙酰化的蛋白质 - 底物的纯化
    1. 准备好10厘米×10厘米的培养皿与HEK 293T细胞为约70%汇合的第二天。
    2. 第二天,共转染细胞与标记的5微克标记质粒载体expressin克蛋白质 - 底物以及5微克特定乙酰转移可在3微升的PEI /微克DNA的一比率乙酰使用的PEI的蛋白质。
      注意:如果特定乙酰转移是未知的,共转染与已知的组蛋白乙酰基转移酶(帽)如P300,CBP,GCN5,Tip60的和PCAF的混合物。
    3. 经过12小时更换培养基。
    4. 当天裂解细胞前,治疗用1μMTSA和2mM烟酰胺(NAM)过夜的细胞通过更换用含TSA / NAM通过抑制脱乙酰酶最大化蛋白质 - 底物的乙酰化水平的介质的培养基中。
    5. 转染后48小时,去除培养基,在PBS中通过胰蛋白酶消化,随后离心以1000 xg离心在4℃下洗涤细胞两次,并收集细胞10分钟。
    6. 在每皿加入500μl裂解缓冲液A裂解细胞沉淀液(20mM HEPES pH值7.9,18毫米氯化钾,0.2mM的EGTA,1.5mM的氯化镁,20%甘油,0.1%NP-40),其包括蛋白酶Inhibitors鸡尾酒,1μM的TSA和在4℃下恒定旋转2mM的NAM 30分钟。
    7. 离心机在14000 xg离心在4℃下15分钟,并转移上清液至新管。
    8. 使用缀合,如下所述琼脂糖珠粒的抗Flag抗体进行免疫沉淀。
      1. 添加200-300微升偶联至琼脂糖珠的蛋白质裂解物(10-20毫克总蛋白)抗Flag抗体的。
      2. 在4℃下以恒定的搅拌温育过夜。
      3. 收集离心免疫沉淀在1000 xg离心在4℃下5分钟。
      4. 洗涤沉淀2次,用10ml裂解缓冲液A以1000 xg离心在4℃下5分钟。每次洗涤后,沉淀珠子和替换用裂解缓冲液A中的上清
      5. 洗涤沉淀,用10ml裂解缓冲液A 3次无NAM在1000×g离心5分钟,4℃。每次洗涤后,沉淀珠子和替换用裂解缓冲液A.上清液它性重要NT不携带在任何不结盟运动的脱乙酰反应。
    9. 制备1×FLAG肽溶液(包括蛋白酶抑制剂和1μM的TSA在PBS中)。
    10. 加入500微升1×FLAG肽溶液至琼脂糖珠孵育下恒定旋转,在4℃,30分钟。
    11. 收集离心上清在6000 xg离心在4℃下2分钟。
    12. 重复前两个步骤。
    13. 通过使用过滤管和离心15,000 XG 1分钟,4℃卸下上清珠。
    14. 使用超滤膜,浓缩洗脱样品,直至蛋白质浓度为1微克/微升。
    15. 通过在4-12%SDS-PAGE凝胶上运行1微升洗脱的样品进行电泳。
    16. (:1000稀释1)和蛋白质底物(稀释取决于所用的特异性抗体)使用针对交流-K抗体western印迹确认蛋白 - 底物的乙酰化。
    17. 保持普里田间在-80℃下的乙酰化蛋白 - 底物。
  3. 体外脱乙酰反应
    1. 制备脱乙酰缓冲液B(50mM的Tris-盐酸,pH为7.5,150 mM氯化钠,1mM的MgCl 2的0.5微米,TSA)
    2. 准备在不同管3不同的反应在20μl的最终体积( 见表1)。
    3. 包括额外的反应由SIRT2(可选)确认蛋白底物脱乙酰化。添加纯化的脱乙酰无效突变SIRT2 2微克到反应,而不是脱乙酰活性SIRT2(这可以使用在1.1中描述的协议来完成使用PCDH-普罗-GFP-SIRT2 H187Y -flag慢病毒后),或添加的10mM烟酰胺(NAM )反应以抑制SIRT2的脱乙酰酶活性( 表1)。
    4. 孵育反应为在30℃下持续搅拌3小时。
    5. 通过加入20微升2×样品缓冲液终止反应,煮沸样品F或在95℃下10分钟。
    6. 通过运行在4-12%SDS-PAGE凝胶的反应混合物进行电泳和使用抗AC-κ ​​抗体(1:1000稀释)检测由印迹蛋白质-底物的乙酰化状态19,20。

2. 在体内脱乙酰含量

  1. SIRT2表达在培养的细胞
    1. 准备与HEK 293T细胞10厘米培养皿稳定过表达PCDH-普罗-GFP-空载体,PCDH-普罗-GFP-SIRT2-旗及PCDH-普罗-GFP-SIRT2 H187Y -flag(如在1.1中描述)为约70 %汇合。
    2. 另外,准备10厘米培养皿与细胞约70%汇合,并使用上述在3微升PEI /微克DNA比使用PEI提到的载体的5微克执行瞬时表达。
    3. 执行使用抗Flag抗体总细胞提取物的蛋白质印迹(1:1000稀释)来演示的标示 - 叔过表达agged SIRT2 19。
  2. RNA干扰拦截SIRT2在培养的细胞
    1. 制备的HEK 293T细胞的10cm的培养皿为约70%汇合的第二天。
    2. 第二天,共转染4微克pLKO1-普罗-SH SIRT2(慢病毒载体)19,4微克pCMV- dR8.2 DVPR(包装载体)和0.5微克的pCMV-VSV-G(包络线矢量)18使用聚乙烯亚胺(PEI)在3微升的PEI /微克DNA的一比值。
      注意:对于撞倒SIRT2,我们用简单的发夹的shRNA由RNAi协会(TRC)设计了pLKO.1慢病毒载体。
    3. 操作与1.1中描述的生产shSIRT2慢病毒并感染靶细胞拦截SIRT2。
    4. (:1000稀释1)在10%SDS-PAGE凝胶上运行总蛋白的40微克后表现出有效的SIRT2敲低使用抗SIRT2抗体进行总细胞提取物的Western印迹。
    5. 此外,与细胞约70%汇合准备10厘米培养皿和使用以下制造商的说明的siRNA进行SIRT2短暂击倒。
    6. (:1000稀释1)在10%SDS-PAGE凝胶上运行总蛋白的40微克后表现出有效的SIRT2敲低使用抗SIRT2抗体进行总细胞提取物的Western印迹。
  3. 免疫沉淀和免疫印迹检测培养细胞乙酰化水平
    1. 从任一细胞过度SIRT2收集细胞沉淀之前12小时(见2.1以上)或SIRT2撞倒的细胞(见上文2.2),添加1微米的TSA到培养基中,以抑制非III类组蛋白脱乙酰。
    2. 除去培养基,在4℃下以1000 xg离心在PBS洗涤细胞两次,并收集通过胰蛋白酶的细胞,然后离心10分钟。
    3. 加入10 mL裂解液A(20毫米的HEPES pH值7.9,18毫米氯化钾,0.2毫米EGTA,1.5毫MgCl 2的,20%甘油,0.1%NP-40),其包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒,1μM的TSA和2mM NAM。
    4. 孵育在4℃下恒定旋转30分钟。
    5. 离心收集上清在20000 XG在4°C 15分钟。
    6. 通过使用Bradford蛋白测定计算蛋白质浓度。
    7. 转印1mg总蛋白质的新管中的使用裂解缓冲液A.使用表2作为参考1ml的最终体积,以从细胞中任一过表达SIRT2SIRT2击倒后制备蛋白质样品
    8. 执行使用针对特定的蛋白质 - 底物的抗体与蛋白A / G一起免疫沉淀(建议将40μl珠浆料)。或者,使用偶联到琼脂糖珠防AC-κ抗体(20μL珠浆通常是不够的)免疫沉淀所有的蛋白质乙酰化。
    9. 在根据CONSTA 4℃孵育样本NT旋转过夜。
    10. 收集离心免疫沉淀在1000 xg离心在4℃下2分钟。
    11. 在4℃下洗珠5次用1毫升缓冲液A以1000 xg离心2分钟。
    12. 珠悬浮在40μl的2X样品缓冲液。
    13. 煮沸样品在95℃下10分钟。
    14. 通过运行在4-12%SDS-PAGE凝胶洗脱的样品(从步骤2.3.12 40微升),而不会干扰珠粒在传送洗脱的样品进行电泳。
    15. 使用抗AC-κ抗体通过Western印迹法检测蛋白质 - 底物的乙酰化水平(1:1,000稀释度),如果是用于免疫沉淀的蛋白质 - 底物特异性抗体,或针对该蛋白 - 底物的特异性抗体(遵循建议特异性抗体对稀释)如果被用于免疫沉淀的抗徒-K珠。

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Representative Results

为了使蛋白质被认为是用于与脱乙酰酶活性的任何酶合法脱乙酰目标,无论是体外体内脱乙酰测定需要执行以建立脱乙酰酶和其底物之间的相互作用。 用于体外脱乙酰酶测定中,可以进行该测定之前,需要的脱乙酰酶和乙酰化蛋白底物两者的纯化。在这里,我们使用作为要研究的特定脱乙酰酶细胞质沉默调节蛋白SIRT2。 SIRT2是强烈建议作为用于脱乙酰测定的阴性对照一个脱乙酰酶和使用它缺乏脱乙酰酶活性的突变体的。使用在1.1中描述的纯化过程,既SIRT2和SIRT2 H187Y可以成功地在1微克/微升的最终浓度进行纯化。这可以在一个凝胶随后染色运行纯化的蛋白质后的确认( 图1A,上图),以及使用抗Flag抗体Western印迹后因为两者SIRT2和SIRT2 H187Y的标签带标示的肽( 图2A,下)。相同的纯化步骤可以遵循为具有一些修改的蛋白底物的纯化。蛋白质需要它可用于脱乙酰测定,这意味着它需要在细胞过度具体乙酰转移或能够乙酰化的蛋白帽子的混合物被纯化之前将乙酰化。使用在1.2中描述的纯化过程中,乙酰化蛋白质可纯化( 图1B,上图)。以确认该蛋白确实乙酰并且可用于在体外脱乙酰化测定中,使用抗AC-κ ​​抗体Western印迹是必要显示在细胞中过表达乙酰基转移( 图1B中的纯化的蛋白质的增加的乙酰化水平,罗威r)的。

成功的蛋白质纯化后,可以进行体外脱乙酰化测定法。乙酰化酶,包括SIRT2,是III类组蛋白去乙酰化酶的赖氨酸,因为他们需要NAD +为他们的酶功能,与其他脱乙酰基酶是不同的。与此相一致,没有脱乙酰可以通过Western印迹使用抗AC-κ ​​抗体在不存在NAD +的检测,不论催化剂活性SIRT2的存在( 图2,泳道2比1)。相反,降低了乙酰化蛋白的乙酰化水平时既SIRT2和NAD +的存在于反应表明,该蛋白质可以被认为是对于SIRT2一个脱乙酰目标。为了验证这些结果,可以使用不同的阴性对照。例如,在蛋白质的脱乙酰水平没有差异可以被检测,当脱乙酰缺陷SIRT2(SIRT2 H187Y)被用来代替具有催化活性的野生型SIRT2( 图2,泳道5比4)。当一个完善的沉默调节蛋白的抑制剂,NAM,加入到反应混合物中,这意味着在该蛋白的乙酰化水平的降低是由SIRT2的脱乙酰酶活性介导的类似的效果就可以看出。

异常脱乙酰参与几个细胞过程和年龄相关的疾病。因此,在深化对脱乙酰酶和其底物之间的相互作用的知识的一个关键步骤是建立这个互联互通细胞,其中这种现象可能有生理方面的影响。此外, 在体内检查在细胞培养系统中的脱乙酰允许在其中可以更容易地连接到特定表型或结果的细胞或组织特定上下文脱乙酰事件的研究。这不包括在体外 DEAC所检测的可能性etylation活性人工由于脱乙酰酶和其在管的同时基板,两者的存在下可能永远不会在细胞的正常生理条件下发生的。为在体内脱乙酰测定中,细胞过度既SIRT2和SIRT2 H187Y以及蛋白底物可以按照在2.1和2.2中描述的方法被使用。从这些细胞中制备细胞提取物时,可以确认表达SIRT2,SIRT2 H187Y,并且使用特异性抗体通过蛋白质印迹蛋白底物。在这里所描述的,测定的所有外源性表达的蛋白质的标签,便于在进行的实验( 图3,下图,以检测HA标记的SIRT2 / SIRT2 H187Y和中间面板以检测Flag标记蛋白底物)。确定目标蛋白是否是SIRT2的脱乙酰基片,用抗Flag抗体拉下靶蛋白f被进行免疫沉淀使用抗AC-κ抗体通过Western印迹ollowed。减少蛋白质的乙酰化水平在细胞中表达SIRT2( 图3上图,泳道3比2)和未能影响细胞乙酰水平表达脱乙酰酶缺乏SIRT2突变体( 图3上面板,泳道4比3)表明乙酰化的蛋白质可以是在体内特定脱乙酰酶的脱乙酰目标。当SIRT2介导的脱乙酰是在所研究的细胞用NAM处理细胞( 图3上面板,泳道5比3)建立特定脱乙酰酶-底轴之后禁止这可以被进一步证实。

图1
图1:脱乙酰酶和乙酰化蛋白-底物两者的纯化,以用于 体外 脱乙酰化测定(A)既SIRT2和SIRT2 H187Y(脱乙酰缺陷突变体)的1微克被上按照如在1.1中描述的纯化方案的凝胶运行。将凝胶用市售染色液和脱色后染色,既可以检测纯化的蛋白质(上部)。蛋白质可以使用​​抗Flag抗体(低级)在PVDF膜和免疫印迹转印后进行检测。 (B)的蛋白底物和超乙酰化蛋白底物的1微克(的α-烯醇酶被用作基于在我们的实验室中产生质谱未公布的数据的SIRT2衬底)如1.2所描述的以下的纯化方案的凝胶进行运行。将凝胶用市售染色溶液和脱色后,纯化的蛋白质底物可被检测(上部)。乙酰化可使用抗AC-κ抗体(中)在PVDF膜和免疫印迹转印后进行检测。总磷 roteins可以使用抗Flag抗体(下)被检测到。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
2: 在体外 脱乙酰化测定法将纯化的乙酰化蛋白底物(的α-烯醇酶) ​​与SIRT2或SIRT2 H187Y(脱乙酰缺陷突变体)在NAD +的存在下培养(泳道4和5)。降低乙酰水平通过Western印迹使用抗AC-κ ​​抗体在SIRT2的存在下,但不是在SIRT2 H187Y的存在(泳道4比5)检测到。当在反应混合物中不包含NAD +被没有观察到脱乙酰酶活性(泳道2比4),或当NAM被加入到反应混合物(泳道6对4)。://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
3: 在体内 脱乙酰测定 HEK293T细胞稳定过表达或者SIRT2SIRT2 H187Y分别与蛋白质底物(的α-烯醇酶) ​​和帽子共转染,以增加蛋白(泳道2比1)的乙酰化水平。脱乙酰使用抗Flag抗体拉下使用抗AC-κ ​​抗体的蛋白质底物和蛋白质印迹在体内检查免疫后。乙酰化在SIRT2过度表达细胞显著降低相比于SIRT2 H187Y过度表达细胞(泳道3比4)。该SIRT2介导的脱乙酰当细胞与NAM(泳道5比3)处理蛋白质底物被抑制,请点击此处查看该图的放大版本。

反应 1 2 3 4(可选) 5(可选)
纯化的乙酰化蛋白底物(10微克) + + + + +
缓冲液B + + + + +
纯化SIRT2(2微克) - + + - +
NAD +(1mμ的) - - + + +
纯化SIRT2 H187Y(2微克) - - - + -
NAM(10毫米) - - - - +

表1:反应的成分。

样本 过度 击倒
1 PCDH - 普罗-GFP-空载体 pLKO1空载体或Si CTR
2 PCDH - 普罗-GFP-SIRT2标志 pLKO1 SH SIRT2 1或Si SIRT2 1
3 PCDH -普罗-GFP-SIRT2 H187Y -flag pLKO1 SH SIRT2 2或Si SIRT2 2

表2:蛋白质样品。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

该莱夫科夫斯基家庭基金会/ Liz和埃里克·莱夫科夫斯基创新研究奖,以AV我们想 - 这里介绍的项目是由美国国立卫生研究院从/ NCI(NCI-R01CA182506-01A1)的资助,以及由罗伯特·卢里综合癌症中心的支持要感谢批判性阅读和编辑这篇稿子的实验室成员(卡罗尔·奥卡拉汉和伊丽莎白安妮·韦恩机场)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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