懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

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Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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Abstract

複雑な翻訳後修飾を有する組換えタンパク質を生産する技術は、構造と機能の研究のための主要な課題です。迅速な確立と一過性にトランスフェクト哺乳動物細胞株からの高回収はこの障壁に対処し、自然にERおよびゴルジ体媒介分泌経路を通って流れるされているタンパク質を発現する有効な手段です。ここで、高いタンパク質収率のために設計された哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトしたヒトHEK293FおよびHEK293S細胞株を用いて、タンパク質発現のための1つのプロトコルです。このシステムの適用は、培養物1リットル当たり、回収、精製したタンパク質の95から120 mgの間の収率で表される3つの代表的な糖タンパク質を用いて実証されています。これらのタンパク質は、ヒトのFcγRIIIAおよびラットα2-6シアル酸転移酵素、ST6GalI、N末端GFP融合だけでなく、変更されていないヒト免疫グロブリンG1のFcと表現の両方です。この堅牢なシステムUTI質量分析および核磁気共鳴分光法を用いて、構造研究のための同位体濃縮タンパク質および炭水化物の発現のために適合可能である無血清培地をlizes。さらに、N-グリカンの組成物は、収率を低下させないようにして特定のグリカンの改変を防止するための小分子を添加することによって調整することができます。

Introduction

構造および機能の詳細な分析のために適切に折り畳まれ、翻訳後修飾されたヒトタンパ​​ク質を高収率で製造することは重要な課題です。発現系が多数天然様の機能と動作を有する組換えタンパク質を産生すること可能です。酵母、植物、昆虫および哺乳動物系でもある1-4を説明しても細菌発現系、主に大腸菌株は、原因でこれらの発現系のシンプルさに、研究の分野で最もアクセスし、一般的に使用されるツールを表しています。しかしながら、これらのシステムの大部分は、標的タンパク質の適切な翻訳後修飾することができません。バーブとMoremen研究所の基本的な関心は、適切なグリコシル化と真核生物のタンパク質を生産しています。多くのヒトタンパク質(5を参照)適切な機能のために適切なグリコシル化を必要とします。

真核生物グリコシル化機構が広範かつ両方アスパラギン(N)を含む、修飾の多様を作成することが可能である-セリン/スレオニン(O)は、複雑なグリカン6 -結合しました。これは、ヒトタンパク質の> 50%がN-グリコシル化7であると推定されています。グリカンは、少数を示すために、本質的な治療用モノクローナル抗体を含む多くのタンパク質の構成成分、エリスロポエチン、および第IX因子などの血液凝固因子です。複数のメソッドは、11-14または操作された組換えシステム15-20からの回復を化学酵素には、純粋に合成8-10から適切にN-グリコシル化タンパク質および範囲を準備するために存在するが、驚くことではないが、人間の発現系は、これまでで最も堅牢であることが証明されましたヒトタンパ​​ク質を生成するための方法。

多くの治療用のヒト糖タンパク質は、哺乳動物細胞を用いた組換え系において産生されます。ノートのシステムは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、マウス骨髄腫(NS0)、ベビーハムスターKidneですY(BHK)、ヒト胚性腎臓(HEK-293)及びタンパク質産生のために4,21,22接着または懸濁培養で使用されるヒト網膜細胞株。しかし、哺乳動物タンパク質発現系は、安定な細胞株の生成、高価な増殖培地と基板補助トランスフェクション手順23を必要としています。

哺乳動物細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム24,25、カチオン性ポリマー(DEAE-デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリエチ(PEI))または正に荷電したカチオン性リポソーム26-29を含む多くの薬の助けを借りて達成されます。 PEIは26ポリカチオン性、荷電、直鎖状または分岐鎖状のポリマー(25 kDaの)であるDNAと安定な複合体を形成し、エンドサイトーシスされます。エンドソームの酸性化の際に、PEIは、エンドソームおよび細胞質26,30へのDNAの放出の破裂につながる、膨潤すると考えられています。

suspensiで最近まで、一過性トランスフェクション文化に細胞培養29に加え、続いて前に、DNA / PEI複合体形成することにより実施しました。しかし、ワームおよび共同研究者ら 、in situ 31,32 DNA / PEI複合体を形成されたHEK293細胞における組換えタンパク質産生のために最適化された非常に効率的なプロトコルを報告しました。これは、培養培地中に調製、複合体の滅菌、および緩衝液交換を回避します。大幅な収量増加につながった33の発現増強プラスミドを含むことにより、さらなる最適化。ここでは、これらの進歩の上に構築し、広く適用可能である方法です。発現条件はまた、Nグリカン合成に影響を与えるように変更されてもよいです。

中間段階でのN-グリカンの処理を停止し、遺伝子欠失を有するHEK293S細胞株は、、グルコサミン(GlcNAc 2 Man 5)34 2、N-アセチルグルコサミン残基に加えて5マンノース残基からなる均一なN-グリカンを有するタンパク質の発現をもたらします35。これらの細胞N-アセチルトランスフェラーゼI(GNTI)下流N-グリカン処理36,37のために必要とされる遺伝子を欠いています。キフネンシン、シアル酸類似体およびフコース類似体及び2-デオキシ-2-フルオロフコースなどのグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤の使用は、同様の効果と、N-グリカンプロセッシング38-41限界があります。

プロトコルは、ここで報告された、図1 42,43、PEI支援過渡哺乳類細胞株(HEK293FまたはHEK293S細胞)へのトランスフェクション、および適切なグリコシル化タンパク質の高収量の回復に示すようにPGEN2ベクトルを使用しています。このシステムは堅牢であり、組換えタンパク質の大規模な力価の生産のための同位体標識およびグリカンエンジニアリングを含む様々な要因に対応することができます。

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Protocol

このプロトコルは、HEK293FまたはHEK293S細胞のいずれかを使用して表現するのに十分です。

1.細胞の樹立

  1. 文化接種
    注:すべての文化の操作手順は、BSL-2施設で実施されなければならず、各項目には、水溶液中の70%エタノールを噴霧することにより滅菌されなければならない生物学的安全キャビネットに持ち込ま。
    1. 135 rpmで、80%の湿度でと8.0%のCO 2、37℃のインキュベーターシェーカーを操作します。作業に少なくとも1時間前に生物学的安全キャビネットのUVランプを「オン」に。 1時間、37℃の水浴中で密封された培地Aおよび培地Bボトルを予熱します。
    2. 水溶液中の70%エタノールを噴霧することにより通気キャップ、ピペット、ピペット、およびあらかじめ温めておいたメディアボトルと125ミリリットルの三角成長フラスコを滅菌します。生物学的安全キャビネットの中でこれらの項目を配置します。注意:125ミリリットルの三角培養フラスコをカバーするだけの外側のプラスチックを滅菌した後、場合にのみ、私を削除バイオセーフティキャビネット内の。
    3. 30ミリリットルの文化のために、培地B(最終培養の10%)の培地Aの26ミリリットルと3ミリリットルを撤回し、125ミリリットルの三角培養フラスコに移し、ゆっくり(以下、新鮮な培養培地と呼ぶ)振とうして混合します。
    4. 氷の上に、-80℃で凍結し、HEK293F細胞を含む細胞の1つのバイアルを移し、培養室に移動します。注:HEK293F細胞を、1×10 7細胞/ mlの濃度で供給されます。
    5. (これは約1分かかり、細胞が完全に解凍されるべきではない)部分的に細胞を解凍するために37℃の水浴中で穏やかにバイアルを温め。水溶液中の70%エタノールでバイアルの外側を滅菌し、生物学的安全キャビネットに移動。
    6. 1 mlのピ​​ペットを用いて、細胞懸濁液(約0.7 ml)を撤回し、新鮮な培地29 mlを含む125 mlの三角フラスコに移します。培養フラスコのカバーを閉じて、インキュベーションシェーカーに移動。
    7. 細胞の維持:細胞密度、生存率および細胞継代をチェック
      1. 以下のプロトコルに従うことにより、文化の解凍の24時間後の細胞密度を確認してください。注:細胞は、> 80%の本質的な細胞増殖及び生存能力を確保するために、解凍後24時間増殖させます。
      2. 水溶液中の70%エタノールで培養フラスコを滅菌し、生物学的安全キャビネットに移動。
      3. 1ミリリットルピペットとピペッターを使用して、ゆっくりと浮遊培養液100μlを撤回し、滅菌0.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに移します。閉じて、できるだけ早くバックシェーカーに培養フラスコを転送します。
      4. 細胞の7.5μlのトリパンブルー溶液の7.5μLを混ぜます。セル/トリパンブルー混合物の7.5マイクロリットルと激しく混合し、計数スライドに転送します。
      5. 自動セルカウンターをオンにして、ロード室にカウントスライドを配置します。オートリーダーが活性化され、細胞を単位に自動的にカウントされmlであり、パーセント生存率あたりの細胞の数の
      6. 0.3×10 6生細胞/ mlの細胞密度で新鮮培地への転送に必要なドナー培養物の容量を決定します。
        注:補足資料のサンプル計算を参照してください。
      7. 繰り返しは、新鮮な培地に必要な材料を準備するために、上記の「1.1文化接種」プロトコルの1.1.2と1.1.3を繰り返します。
      8. 新鮮な125ミリリットルの培養フラスコに培地A(23ミリリットル)と培地B(3ml)に転送します。安全キャビネットから培地Aおよび培地Bの株式ボトルを取り外します。
        注意:メディアボトルの在庫はHEK 293F細胞と同時にバイオセーフティキャビネットに保管すべきではありません。これは、株式媒体ボトルを汚染の可能性を制限します。
      9. インキュベーターからのHEK293細胞培養を削除して、水溶液中の70%エタノールでスプレー。新しいピペットを用いて、細胞(4ミリリットルのアリコートを撤回、このボリュームはTに従って測定しましたO培養物からのステップ1.2.6)、新鮮な培地を含むフラスコに移します。
      10. 1.1.1に応じて設定したインキュベーターシェーカーにバイオセーフティキャビネットからの文化の両方を転送します。 2-3×10 6生細胞/ mlのおおよその密度に細胞を増殖させます。
        注意:細胞の約2倍の時間は32時間です。それは、この密度に到達するために3-4日かかります。最初のトランスフェクション前に、細胞の安定的な成長パターンを持っている3-4の継代のために細胞をインキュベートします。

    2.トランスフェクションのための材料を準備します

    1. 準備HEK293細胞(1日目)
      1. トランスフェクションの前に新鮮な培地B 24時間で1×10 6細胞/ mlの密度に継代培養細胞は1.2ステップの方法。
        注:トランスフェクション培養物の体積は、細胞の数に依存するであろう。大きなトランスフェクションボリューム(> 20ml)をこの段階で文化のより大きな容量が必要になります。
    2. セントの準備材料のocks
      1. 25mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および150mMのNaCl(pHは7.5)を含む緩衝液中に1mg / mlの濃度で線形ポリエチレンイミン(PEI)のストック溶液を調製します。完全にPEIを溶解し;これを室温で30〜60分をとることができます。長期使用のために-20℃で、0.22μMシリンジフィルターとストアを介して滅菌します。
      2. (2.2.2.1-2.2.2.4手順に従って)無菌プラスミドDNAを準備します。プラスミド構築の手順は、他の場所に記載されている42。 DNAの調製のための簡単​​な手順は、ここで説明されています。
        1. 100μgのを補充したLB培地1 L(Tryptone-が10g / L、酵母extract-を5g / Lナトリウムクロリドを10g / L)/中PGEN2ベクターで形質転換された化学的にコンピテントな大腸菌細胞の培養物を成長させますmlのアンピシリン。E.大腸菌は、無加湿振盪インキュベーター中で37℃で成長させました。
        2. マヌーに従ってPGEN2ベクトル符号化対象のプラスミドDNAを精製facturerのDNA精製プロトコル。
        3. プラスミドDNAの完全な無菌性を確保するために、生物学的安全キャビネット内のDN​​A抽出手順の最終イソプロパノール沈殿および再懸濁の手順を実行します。
        4. 万xで溶出したDNAと遠心分離機に(プラスミド調製キットで指定された)イソプロパノールの量を追加します。 10分間のグラム。水溶液中で70%エタノールでのDNA容器の外側を滅菌し、バイオセーフティキャビネット内に転送します。ピペットと空気乾燥DNAペレットを使用して、イソプロパノール、上清を捨てます。乾燥したら、無菌の10mMトリス緩衝液、pH 8.0でペレットを再懸濁。
      3. 水に220ミリモルのバルプロ(VPA)は、酸の原液を調製し、滅菌0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌します。さらに使用するまで-20℃で溶液を保管してください。

    3.一過性トランスフェクションの確立

    1. トランスフェクション(0日目)
      1. 以下の手順により細胞密度を確認し、上記「1.2。細胞の維持」の1.2.5を介して1.2.2。トランスフェクション(> 95%の生存率で2.5〜3.0×10 6生細胞/ mlの)のための細胞の量を決定します。補足資料のサンプル計算を参照してください。
      2. 無菌の血清学的ピペットを用いて250ミリリットルの遠心管に、前のステップ(ここでは67ミリリットル)で計算された懸濁培養細胞の量を転送します。 100×gで5分間の遠心分離によって細胞を収集します。
      3. 一方、上記「1.1。文化接種」に応じてステップ1.1.3を次の新鮮なトランスフェクション培地を準備します。サンプル計算のための補足資料を参照してください。また、無菌の15mlチューブに新鮮な培養培地の転送5ミリリットル、脇に置きます。
      4. 移送管は水溶液中70%エタノールでチューブの外側を殺菌した後、バイオセーフティキャビネットにペレット化した細胞を含有する第デカント滅菌ピペットを使用して費やした培地からなる電子上清。
      5. 激しくピペッティングすることにより(ステップ3.1.3上記で調製した)新鮮なトランスフェクション培地を用いてフラスコに新鮮な培地と転送を10mlを用いてダウンペレット化した細胞を再懸濁します。通気細胞培養フラスコのキャップをねじ込み、振とうしながら15分〜1時間のために(1.1.1で設定された)インキュベーターにフラスコを移動します。
      6. この間、0.5μgの/μlの最終濃度(上記ステップ3.1.3から引き出さ5 mlの容量を使用して)新鮮な培地を用いてプラスミドDNAとPEIストックを希釈します。 DNAとPEIの量を決定するために、補足資料のサンプル計算を参照してください。バイオセーフティキャビネットに分散した細胞を培養フラスコを転送します。
      7. マイクロピペットを用いて培養し、プラスミドDNA(0.5μgの/μlと300μl)を加え、穏やかな手動振とうして混合します。 PEI文化へ(0.5μgの/μlと900μl)を追加し、穏やかに振とうして混合します。新鮮CULの3.8ミリリットルを追加します。24時間インキュベーターシェーカーに上記のステップ3.1.3、および転送フラスコからトゥーレ媒体。
      8. 1.1のステップに従ったバイオセーフティキャビネットを清掃してください。
    2. (50ミリリットルのトランスフェクションのボリュームの場合)希釈(1日目)
      1. 24時間トランスフェクトされた文化をインキュベートします。
      2. 滅菌1ミリリットルの血清学的ピペットを使用し、滅菌50mlチューブに移す。(2.2.3ステップに従って調製した。VPA)予熱し220 mMのバルプロ酸の1ミリリットルを撤回。
      3. 5.0予め温めた培地B mlの予熱し培地Aの44ミリリットルを撤回し、VPAの4.4 mMでの最終濃度で新鮮な培養培地50mlを準備するために、無菌の血清学的ピペットを用いて、VPA溶液にこれを追加します。
      4. 、水溶液中の70%エタノールでフラスコの外側を滅菌した後、安全キャビネット内にトランスフェクト文化を移動する準備希釈媒体を追加し、インキュベーションシェーカーに戻し、フラスコを転送します。
    3. 発現と収穫(日2-6)
      1. (5-6日、トランスフェクションからの合計)は、追加の4〜5日間細胞をインキュベートします。
      2. ステップ1.2.2以下の培地のアリコートを撤回。 1.2.5へ。 SDS-PAGEにより毎日でタンパク質の発現を分析するためにアリコートを、細胞の生存率を監視し、保存するために、滅菌した1ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、上記「1.2。細胞の維持」で説明されている(以下、第5章を参照してください)​​。
      3. 5分間の千グラムで細胞プラス培地を遠心分離することにより、5-6日後に細胞を回収。細胞生存率が50%を下回った場合にはさらに、(手順を1.2.2-1.2.5参照)上清を収穫。
      4. 分泌タンパク質が含まれています上清をオフに注ぎます。 HEK細胞ペレットに10%の漂白剤の5ミリリットルを加え、バイオハザードのように捨てます。

    4.タンパク質精製

    1. プロテインAセファロース5mlでカラムを準備します。緩衝液A(20mMの3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、pHが7.4、100 mMのNACの5カラム容量でカラムを平衡化L)。
    2. 残りの細胞破片を除去し、高速(10分14,000 g)に発現したタンパク質で回収した上清を遠心します。新しいチューブにデカントすることにより収集します。バイオハザードのようにペレットを捨てます。
    3. 上清の10μlのアリコートを収集し、さらに(5節で説明)をSDS-PAGEによって、試料を分析するために、各タンパク質精製ステップで少量のサンプルを収集します。明らかにした上清をロードし、フロースルーを収集します。
    4. バッファーAの3カラム容量でカラムを洗浄し、100 mMグリシン、pHが3.0の5カラム容量のタンパク質を溶出。急速pH値を中和するために半分の1 M TRIS緩衝液の量、8.0のpHを含むチューブ中に溶出液を収集します。
    5. 将来の使用のための緩衝液Aおよび店舗の10カラム容量でカラムを洗浄します。
    6. 緩衝液は、使用した10kDaの分子量カットオフ遠心フィルターバッファの少なくとも10倍過剰で溶出したタンパク質を交換します。注:に溶出された試料を集中しないでください溶出緩衝液中に非常に低容量(<2ミリリットル)。緩衝液Aでバッファを交換するために、遠心フィルターを使用して、
    7. ストアは、次の使用まで4℃でタンパク質を精製しました。
      注:上清中に発現されたタンパク質は、タンパク質の特性に基づいまたは親和性タグの使用に選択されたアフィニティーカラムによって精製することができます。典型的な精製手順のために、カラムは、IgGまたはFc断片またはニッケルカラムに使用することができるタンパク質は、ポリヒスチジンタグで発現されるタンパク質のために使用することができます。ここでは、プロテインAカラムを用いたIgG1-Fcのための精製工程について説明します。

    SDS-PAGEによるタンパク質の分析5。

    1. 2×ローディング緩衝液(0.125 Mトリス、pHが8.0、4%SDS、10%βメルカプトエタノール、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)の等容量の各サンプルのアリコート(7.5μl)を希釈します。
    2. ヒートブロックまたはウォーターバスを用いて5分間90℃で混合物を沸騰させます。 10,000 gでFOでサンプルを遠心分離R 1分。マーカータンパク質の5μlの使い捨てチップで20μlのピペットを使用して分析のためのサンプルの14μlを用いて調製したゲルをロードします。
    3. 60分間25ミリアンペアで1つのゲルを実行します。電気泳動工程が完了した後、5分間水及びマイクロ波の1 Lと容器にゲルを移します。
    4. 水中で2時間および脱色のための染色溶液(40%エタノール、10%酢酸および0.1%クマシーブリリアントブルー)を用いてゲルを染色します。

    質量分析による6グリカン分析

    1. 以前に説明したように44グリカンを分析します。簡単に言うと、IgG1の-Fcの75μgのは、その後グリカン45のリリースのためにPNGアーゼFによって処理され、トリプシン処理しました。放出されたグリカンを完全メチル化し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOFMS)を用いて分析しました。

    特別シナリオ7.プロトコルの調整

    1. 15 N-でタンパク質を標識標識アミノ酸(50ミリリットルのトランスフェクションボリュームの)
      1. 単一の滅菌ガラスバイアルに各アミノ酸5mgを分配します。水をオートクレーブし4mlで再懸濁(Tyrが完全にLysおよびPheのとは違って、可溶化されていないことに注意)。 121℃で15分間オートクレーブして溶液を滅菌します。ソリューションは50〜60℃程度に冷却することを許可します。
      2. 50ミリリットルのトランスフェクションのボリュームについては、「3.1一過性トランスフェクションの確立」に応じてステップ3.1.3に従ってください。適切なボリュームを持つ例えば補足資料を参照してください。
      3. トランスフェクションのために、上記のように調製標識アミノ酸残基で置換され、新鮮な培地を使用して「3.一過性トランスフェクションの確立」の手順に従ってください。
      4. トランスフェクションの24時間後、培養希釈の日に、あらかじめ温めておいた培地Bの5.0ミリリットル、あらかじめ温めておいた培地Aの40ミリリットルと(ステップ7.1.1のように調製。上記の)アミノ酸混合物の新たにオートクレーブ処理4ミリリットルのアリコートを撤回そして、1を追加mlのVPAの4.4 mMの最終濃度に希釈新鮮培養培地50mlを調製するためにVPA液のストック溶液を予熱。無菌の血清学的ピペットを用いてトランスフェクション培地にこのメディアを追加します。
      5. 、水溶液中の70%エタノールでフラスコの外側を滅菌した後、安全キャビネット内にトランスフェクト文化を転送する準備希釈媒体を追加し、インキュベーションシェーカーに戻し、フラスコを転送します。
        注:中Aは、化学的に定義され、無血清培地です。これにより、異なる製剤を調製することが可能です。カスタム中に特定のアミノ酸を欠いている製剤を得るためにサプライヤーにお問い合わせください。しかし、我々は、完全なドロップアウト培地を補充した後、浸透圧の調整を必要とするので、ほんの数の選択残基を欠いている培地を使用することを好む、すべてのアミノ酸は除外させることが可能です。私たちは、補足することができ、浸透圧調整を必要としないのLys-Tyrで-Pheのドロップアウト培地を選択しました。フーrthermore、ミディアム自由に培地成分の濃度を共有していない業者。我々は成功を収めてのLys、TyrおよびPheのための100 mg / Lでそれぞれを使用していました。トランスフェクションおよび発現媒体のボリュームが追加されたアミノ酸を考慮して調整する必要があります。ここでは同位体標識については、上記のプロトコルの調整がされています
    2. 小分子でトランスフェクションをサプリメント
      1. オートクレーブ処理水を用いた2-デオキシ-2-フルオロ-L-フコースの100mMのストック溶液を調製し、0.22μmのフィルターを使用してこの溶液を滅菌します。
      2. 50ミリリットルの文化のために、トランスフェクションおよび希釈メディアへのフコースアナログソリューションの(250μMで)125μlを添加します。注:総培養体積のわずか0.25%が、この濃度アカウントに置換基を追加する.Itグリカン処理の小分子阻害剤を使用して発現を改変することが可能であるので、我々はそれ以上の音量調整を行うために無視。ここでは、2デオキシを含むための条件を記述する2-フルオロL-フコース、グリカンのフコシル化の阻害剤。我々は、トランスフェクションおよび希釈培地中の250μMの濃度でフコースアナログを追加することによって、フコシル化で> 90%の減少を発見しました。

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Representative Results

高レベルのタンパク質発現および純度

この最適化された発現系は、グリコシル化タンパク質の高い収率を生じました。典型的なパターンのIgG1-Fcと( 図1)の式に示されています。この場合は、0日目、粗培地中の可溶性発現の割合を用いて分析されて5日目タンパク質発現までの1日目(希釈)に続いて、トランスフェクションの日とその後の培養の日です。培養物のアリコートを培養希釈後3時間に回収されたようなタンパク質発現の非常に少量の1日目に観察されました。これは、培養培地中で明確な緑の色を表示GFPタグ付きタンパク質を可視化することが容易です。このような増加は、5日目4日目と5日目の間で観察された5日目に2日目からのGFP-FcγRIIIAおよびGFP-ST6GalIの発現のための発現の有意な増加が観察されず、細胞があった<50%実行可​​能なので、培養物は、タンパク質分解を制限するために回収しました。収率( 表1)と完全なグリコシル化(データは示していない);タンパク質をGFP-FcγRIIIAに対するIgG1のFcまたはニッケルカラムのカラムを用いたアフィニティ精製は、高純度( 図2> 99%)を有するタンパク質を生じました。

タンパク質およびグリカンの15 Nまたは13 Cの同位体標識

このシステムは、効率的に記述されたプロトコル記載の同位体濃縮のIgG1のFcを表明しました。タンパク質収率のわずかな減少が(25-50%)が観察されたが、十分に分散した信号は、1 H原子の共振周波数と直接結合してアミド15 N原子( 図3)相関2D NMRスペクトルで見られました。この発現レベルは、典型的には、2-20(構造ベースの研究のために必要な規模で効率的なタンパク質生産を可能にしますmgタンパク質)およびタンパク質に標識された同位体の取り込みに成功を示しています。このスペクトルおよび公開されたスペクトルとの類似度が高いタンパク質標識の高度が最小15 N標識43のスクランブルで発生示します。

異なるN-グリカンを有するタンパク質を生産

異なるグリコフォームはHEK293FとHEK293S細胞を作製しました。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI-MS)は、酵素的に放出されたN-グリカンの分析予想グリコフォーム( 図4)を示しました 。マン5 GlcNAcの2形式のものであり、フコース( 図4)を含有していないN-グリカンを抱いHEK293S細胞から発現されるタンパク質。 HEK293F-表される材料からのグリカンは複合型、コアフコースと二分岐の形であり、主に端子を有しますN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、またはモノ - またはジ - ガラクトシル(Galの)フォームの小さな割合。それはST6GalIとのFcγRIIIaのネイティブN-グリカンが何であるかを知っていないが、IgG1のためのFcグリカンプロファイルは、ヒト血清から精製された46のIgG1 Fcに対する非常に似ています。主な違いは、変更の程度を含みます。ヒト血清からのIgG1 FcをHEK293F発現について観察されるよりもガラクトシルの高い程度を示します。式の2-デオキシ-2-フルオロ-L-フコース、グリカンのフコシル化の阻害剤の添加は、HEK293F細胞株を用いて行っフコースの取り込みを劇的に> 90%の減少( 図4)を示しました

図1
図1: 組換えタンパク質の高収量はPGEN2ベクターから発現させることにより回収されます。 (A - B)2つの発現V本研究で使用ectorsはアンプRカセットおよび E.が含ま pIBI30プラスミドから生成されました大腸菌複製起点。 HEK293F細胞の一過性トランスフェクション後の分泌のIgG1 Fcタンパク質の(C)の発現レベル。 SDS-PAGE分析は、5日目に0日目から発現されたタンパク質の蓄積を示しており、矢印で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 培養培地から発現したタンパク質の回収。 (A)のIgG1-Fcと、(B)、GFP-のFcγRIIIa。 「媒体」は、遠心分離後、培養培地を指します。 FT =は、精製カラムからの画分を通って流れます。 SDS-PAGEサンプルはPRであります βメルカプトエタノールなしで非還元条件下でepared。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:IgG1のFcのアミノ酸選択的標識1 H- 15 N異核単一量子コヒーレンススペクトル[15 N-Tyrを、15 N-Lysが]のIgG1 Fcが(15 Nで補充カスタム培地AにHEK293F細胞を用いて発現標識)L-TyrおよびL-Lysの標識されました。クロスピークは、以前の報告43,47に基づいて割り当てられていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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4: グリカン組成物の小分子モジュレーターの存在下でのタンパク質発現のIgG1 FcのN-グリカンプロファイルは、異なる培養条件を用いて、HEK293細胞中で発現させました。トップスペクトルは、IgG1 FcがHEK293S細胞において発現から単離されたグリカンを用いて調製しました。中央スペクトルはHEK293F細胞で発現材と下部スペクトルからのIgG1のFc糖形態は、同様に細胞をGDP-フコース生合成の阻害剤、2-デオキシ-2-フルオロ-L-フコースの存在下で増殖させた期待調製した明らかにする。 N-グリカンは、CFG規則5次の漫画の図として提示されている:N-アセチルグルコサミン(GlcNAcを)、青四角;マンノース(男)、緑の円;フコース(Fucは)赤い三角;ガラクトース(GAL)、黄色の丸。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

<TBODY>
タンパク質 収量(mg / Lで)
IgG1ののFc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

1:HEK293F 細胞で発現の異なるタンパク質の収量。

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Discussion

このプロトコルは、S又はHEK293F細胞の一過性トランスフェクションを介してタンパク質発現を示す図です。バーブとMoremen研究室で確立最適なトランスフェクション条件は、高効率のトランスフェクションを達成するために、細胞密度および試薬濃度の重要な組み合わせを採用します。このプロトコルを実装する重要な考慮事項は次のとおりです(一貫性のある文化が倍加時間で)トランスフェクションの前に安定した文化を維持します。積極的に95%を超える細胞生存率に(トランスフェクションの前に/ mlで24時間、1×10 6個の細胞に細胞を希釈することによって達成される)細胞を増殖させるのトランスフェクション。トランスフェクション時の細胞密度は90%培地Aおよび10%B培地を含む培養における生存率> 95%(トランスフェクションの密度)と6×10 2.5〜3.0の間の生細胞/ mlであるべきです。そして、31はそれぞれ、3 / mlのと9μgの/ mlの前のPEI添加にDNAを添加し;メディアコンタで1:24時間トランスフェクション後に培養液1に希釈され、2.2 mMの濃度をもたらすのにining 4.4 mMのバルプロ酸は、希釈した培養中の酸をvalprioc。生産段階の成長が、追加の4~5日間37℃、8%CO 2の加湿振盪フラスコで継続します。ここに記載のベクターを最適化し、可溶性タンパク質発現系32,42の重要な特徴です。

標的タンパク質を発現させるために失敗した場合は、上記の要因に加えて、多数の他の変数は、低収量に寄与し得ます。タンパク質をコードするDNA配列は、ヒト細胞のための最適化されたコドンが含まれています確認してください。これは、複数のオンラインリソースを評価することができます。手順を通して無菌性は非常に重要です。活発に成長し、純粋なHEK293F細胞の培養は、肉眼に少し粗く表示され、および媒体(特に細胞密度<1.0×10 6細胞/ mlで)主に明確にする必要があります。

細菌や真菌べきで汚染された文化すぐに拡大を防止するために除去されます。それは健全なストック培養物を維持することが重要です。これは、0.3×10 6細胞/ mlの細胞密度でこれらの培養物を接種することにより達成されます。低い接種密度は、細胞の増殖および分裂48のために必要な種々の成長因子の供給を制限することにより、成長速度を遅くすることができます。培養物は25以上、または30回継代されているように、発現の減少が観察されました。この理由のために、培養物を30倍以上が破棄さ継代。

これは、タンパク質が発現培地中で分解されている、または発現の期間が長すぎる、タンパク質分解を導くことが可能です。これらの理由のために、最適な発現の時間枠を決定するために、それぞれの日に培養物の生存性およびタンパク質発現を監視することをお勧めします。これは、メディアを収穫した後、できるだけ速やかにタンパク質を精製することが重要です。いくつかのタンパク質については、ドゥリンプロテアーゼ阻害剤を含むように有用ですグラムの精製。合計では、これらの調整はバーブとMoremenラボ42,43中のタンパク質の回収率を改善しています。

HEK293細胞の一過性トランスフェクションは、自然に分泌経路に標的化された可溶性タンパク質及びタンパク質ドメインを生成するための優れた有用性を示しています。それは、細胞質または膜内在性タンパク質の産生は、さらに最適化を必要とする可能性があります。このシステムの主な利点は、タンパク質生産のためのネイティブ基板と機械がHEK293細胞49内に存在し、利用可能です。これは主に、このような1,50,51組み込ま正確に折り畳まれたが、異なるNグリコフォームと翻訳後修飾、または酵母およびバキュロウイルス系がないか、制限されたとの細菌のような他の組換えタンパク質の生産方法に比べてその利点を占めています。

さらに、ここで説明するプロトコルは、低分子量を含むように追加された能力を示すCOMそのような標識されたアミノ酸、N-グリカンの組成を変更するように設計された標識グルコースまたは低分子ポンド。 HEK293細胞は、植物酵素を含む非哺乳動物タンパク質の発現における熟達証明、およびタンパク質複合体を回収するための複数のポリペプチドの同時発現を支持する(データは示さず)。

糖タンパク質の構造的および機能的特徴付けは、多くの場合、サンプルの生産上の課題によって妨げられています。ここに記載のタンパク質発現系は、洗練された細胞内のグリカンプロセシング酵素の天然の補体6を使用して翻訳後修飾を達成することにより、この欠点を克服します。この堅牢かつ単純なプロトコルは、サスペンション人間HEK293細胞の一過性トランスフェクションのために証明されています。この方法は、3つのNグリコシル化タンパク質と有意な糖タンパク質の収率(> 95ミリグラム/ L)を示し、そのような標識されたアミノ酸残基、または小分子化学INHとしてサプリメントを収容することができibitor 2-デオキシ-2-フルオロ-L-フコース。発現される糖タンパク質は、定義された糖形態52の広い範囲を調製するためにさらに改造後に精製することができます。

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Acknowledgments

この作品は、財政補助金K22AI099165(AWB)により、P41GM103390(KWM)と国立衛生研究所からP01GM107012(KWM)、アイオワ州立大学の生化学、生物物理学&分子生物学のロイ・J・カーバー部門からの資金によってサポートされていました。この作品の内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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