心筋の構造、機能 in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

Bioengineering
 

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van Deel, E., Ridwan, Y., van Vliet, J. N., Belenkov, S., Essers, J. In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography. J. Vis. Exp. (108), e53603, doi:10.3791/53603 (2016).

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Abstract

Introduction

虚血性心疾患(IHD)は、世界中の男性と女性の1のための罹患率と死亡率の唯一最大の原因であり続けています。生物レベルでの臓器やシステムの間に存在する複雑さと相互関係のため、IHDのモデルとして全動物の使用は、疾患の病態生理の私たちのより良い理解のためだけでなく、関連するままですが、また、新規な予防と治療戦略の評価を可能にします。マウスモデルは、特に、心臓の開発、心筋梗塞、心筋肥大、心筋炎、および動脈瘤性病変2-7の病因の我々の知識に貢献しています。心臓の性能を決定し、予後および治療的介入の選択肢の点で有用なパラメータは、心臓の質量と形状、世界と地域の機能、心筋血流と心筋生存性の空間的な分布をしています。

traditionaのしかし、ほとんどの心臓病のマウスモデルで使用されるリットル治験の方法が完了する時間を必要とする侵襲的な測定を伴う、したがって、動物は、繰り返し測定のために使用することができない、または方法は、動物は、8月12日を犠牲に必要になります。放射能のカウント、または蛍光シグナルが物理的切開心臓またはインサイチュ 13,14 で検出される場合、例えば、局所心筋灌流を測定するために、放射性または蛍光標識された微小球が使用されます。

同様に、心筋梗塞の動物モデルにおける梗塞サイズの評価は、最も一般的に塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色によって行われ、梗塞進展の時間経過および治療的介入の効果を決定するために、この技術は、動物がする必要があることを必要とします種々の時点15で心臓組織病 ​​理学的検査のために犠牲にすること。 quantitativを可能にするなど、非破壊かつ人道的な技術としてeおよび心臓形態、機能、代謝および生存率の縦方向の分析は非常に重要です。この文脈において、前臨床イメージングは​​大きな関連性があります。現在利用可能なイメージングモダリティの間で磁気共鳴イメージング(MRI)および心エコー検査は、最も一般的に使用されている16,17,18。

しかし、非先進的なユーザーが動作するためにMRIが臨床および前臨床の仕事の両方で、基準のあり方、専用の小動物MRIシステムを取得し、維持するためのコストが高いだけでなく、この技術の複雑さと考えられているという事実にもかかわらず、日常的な使用のためのMRIは非常に高価にします。心エコー検査に関しては、心機能を測定する方法には重大な欠点が存在します。ほとんどの心エコー検査によって生成されたデータは、二次元であり、ボリュームを導出するために、幾何学的な仮定は、19を行う必要があります。また、貧困層内および観察者間のreproducibilityは、この技術のもう一つの重要な制限です。単光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)及び陽電子放出断層撮影(PET)を有する放射性同位体画像化は、主に心筋灌流および代謝17,20,21の評価のために使用されます。しかし、これらの画像診断法の制限された空間分解能が挑戦したマウスで心臓イメージングを行います。

一方、より良好なX線感度と高速読み出し時間を可能にする平面検出器技術の出現と技術ミクロシステムの現在の状態は、現在(心肺ゲート付き3次元(3D)を提供し、四次元することができMRIグレードの品質の4D)画像。彼らは実質的にメンテナンス費用無料と非上級ユーザーにより操作が簡単です。したがって、このようなミクロ器具はヒトの疾患のモデルとして小動物のルーチン検査に適しことができます。最も重要なことは、新規な前臨床ヨウ素化造影剤の開発に、よ心のimultaneous機能および代謝評価は22-24可能となりました。

この造影剤は、その静脈内投与は、血管系のin vivoイメージングと心腔内有効にした後、強力な血液プールのコントラストを製造、ヨウ素(160 mg / mlで)を高濃度に含まれています。投与後の時間の中で、その代謝取り込みに関連した心筋コントラストの継続的な増加は、このように同じ造影剤が気絶心筋及び生存率の評価のために使用することができ、観察することができます。

この原稿で概説技術の目標は、心筋灌流と一緒に心筋の世界と地域の機能を決定するために、血液プールヨード造影剤との併用での、本質的な心肺ゲーティングと高速マイクロCTシステムを使用する研究者を可能にすることであり、健康なマウスにおける心臓虚血のマウスモデルにおける生存率は、永久的な閉塞によって誘発されます冠状動脈(LAD)を左前下行します。この動物モデルとイメージング技術を用いて、最も重要な心臓パラメータの迅速な評価は、単一の撮像モダリティでかつ侵襲的処置または動物を犠牲にする必要性を必要とせずに繰り返し行うことができます。技術は、新規な予防および治療戦略を評価するために行うことができます。

Protocol

この研究におけるすべての動物作業はエラスムスMC動物研究倫理委員会によって承認されました。実験を通して、動物はエラスムスMC機関の規制に従って維持しました。実験動物の終わりに、吸入麻酔薬イソフルランの過剰投与を使用して安楽死させました。制度上の動物の世話を受け、この作業を開始する前に、委員会の承認を使用してください。

心臓虚血モデルの作製

  1. 4%イソフルランの吸入によりマウス(12週齢のC57Bl6を、)麻酔。 20 Gカニューレを用いて動物を挿管し、18センチH 2 Oのピーク吸気圧および4センチH 2 Oの呼気終末陽圧で毎分100回の呼吸でマウスを人工呼吸させます
    1. 麻酔を維持し、目は麻酔下ながら、眼の乾燥を防ぐために低下し適用するために、2.5%のイソフルランを含むO 2 / N 2(V / V = 1/2)の混合ガスを使用してください。プラ加熱パッド上でマウスをCEおよび手術中、37℃で体温を維持するために直腸体温を測定します。
  2. 手術の皮下直前にブプレノルフィン(0.05から0.2ミリグラム/キログラム)を注入し、外科処置の開始前に麻酔の十分な深さを確保するためにつま先ピンチ反射を確認してください。脱毛クリームを使用して、マウスの胸部を脱毛すると、皮膚にヨウ素を適用します。
  3. 2番目と3番目の左側の肋骨の間の皮膚でハサミで小さなカットを行うことで、切開を行います。小胸筋とxiphihumeralisの筋肉だけでなく、肋間筋へのアクセスを可能にするために、小さなフックを使用して、サイ​​ドに広背筋を引き出します。
  4. 慎重に湾曲した2ミリメートルの板バネのはさみを使用して肺を傷つけることなく第三肋間筋を切断。脇湿ったガーゼの小片を使用して肺を押して、心膜を破裂。
    注:左横隔神経を傷つけないように注意してください。
    1. Repositi胸部内側に筋肉を保持し、左心房の左心室(LV)自由壁と一部の大部分が表示されるようにして再配置小さなフックに。
  5. 左冠状動脈の下に7-0絹縫合糸を挿入し、しっかりと縫合糸を結びにより動脈を閉塞します。
    注:ほとんどのマウスでは、冠状動脈が表示されていないので、アトリウムを使用して、合字の位置を決定し、常に梗塞サイズを標準化するために2ミリメートル左心房のエッジ下の冠状動脈を結紮。
  6. 視覚的に左心室自由壁の杭を確認することにより、梗塞の成功誘導のために確認してください。杭が観察されていない場合、LADを閉塞するための追加の試みを行います。
  7. 6-0絹縫合糸を使用してしっかりと胸を閉じます。
    注:胸が回復した後独立した呼吸を可能にするために気密閉鎖されるべきです。
  8. 生理食塩水で傷口をきれいにし、使用して皮膚を閉じます絹縫合糸。創傷治癒を促進し、感染を防止するために、皮膚に創傷スプレーを適用します。
  9. オフイソフルランを回して換気チューブを取り外す前に、それ自体で呼吸する動物開始まで待ちます。回復しつつ加熱パッド上のケージにマウスを置きます。
    注:それは腹側横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
  10. 術後の鎮痛のための手術後ブプレノルフィンの追加投与量ごとに8-12時間を管理します。腹腔内にブプレノルフィン(50μgの/キログラム)を管理します。
    注:ミクロ(第3節)最初のスキャンのための手術後3-4時間と第2の走査のための手術後6-7時間までに動物をスキャンします。

マイクロCTコントラストの2インジェクション

  1. 2 successivに、解剖学的機能および代謝の情報を取得するために電子マイクロCTイメージングセッションは、ヨード造影剤を使用しています。
  2. 70%のアルコールを使用して、バイアルストッパーのゴムを公開し、扱います。低デッドスペース、注射器を用いて、造影剤の必要量(体重の5〜10μL/ g)を引き出します。いずれの場合前後にプランジャーを前進および/または穏やかに注射器の側面をタップし、流体が先端に表示されるまで、ゆっくりと滅菌吸収性組織内に空気を排出することにより、射出時のパージ空気の泡を塞栓症の危険を防止するために、針。
    注:マイクロCTコントラストの注射は、意識的または鎮静させた動物で行うことができます。物理的な拘束は、意識のある動物で実行する必要があります。ストレスを最小限に抑えるために、吸入麻酔システムの光鎮静または一般的なイソフルラン麻酔を検討してください。
  3. 注射の前に、70%アルコールで尾を綿棒。ランプまたはより優れた血管拡張を提供するために、温水(40〜45℃)に尾を浸漬することにより尾を温めます。造影剤を注入する私ntravenously(例えば、外側尾静脈のうちの1つを介して)体重の5〜10μL/ gで。
    注:コントラスト強調は、研究対象の動物と画像ノイズのレベルの健康や栄養状態に影響され得るように、特定の動物モデルまたはマイクロCT機器の取得設定の注入量を最適化します。

3.マイクロCTイメージング

  1. コンピュータの電源ボタンを押して、マイクロCTスキャナの電源を入れ、注射を対比する前に。マイクロCT制御ソフトウェアを起動し、ソフトウェア制御のウィンドウに表示されているウォームアップボタンをクリックすることにより、X線管を温めます。
  2. ライブモードボタンは、ウォームアップが完了したことを示す制御ソフトウェアで表示されるのを許可します。小口径のカバーを挿入し、小動物のベッドを配置します。
  3. 画像データが保存され、適切なデータベース、研究、および件名を作成するかを選択します。新しいデータベースを作成するには、データベースウィンドウで新しいデータベース]ボタンをクリックし、データベースが保存されるドライブに移動し、表示されるダイアログボックスで[参照]ボタンをクリックし、新しいデータベースを指定し、[OK]をクリックする名前を入力します。データベースウィンドウで新しいデータベースを確認します。既存のデータベースに接続するには、データベースウィンドウでデータベースのボタンに接続]をクリックし、データベース名をダブルクリックします。
  4. ソフトウェアコントロールウィンドウのドロップダウンメニューから、次のパラメータを選択することにより、スキャン条件設定:X線管電圧、90 kVのを。 CT、X線管電流、160μA。ライブX線管電流、80μA。 FOV、20ミリメートル。ゲーティング技術、心肺;スキャン技術、4.5分。
    注:この撮影プロトコルは、拡張末期と収縮末期の3Dデータセットの再構築を可能にし、40ミクロ​​ンの再構成された等方性ボクセルサイズ512×512×512のマトリクスサイズ、各。
  5. 造影剤を動物に注入した後、4%イソフルランの吸入により誘導室中で麻酔。空気中の酸素の混合物中に1.5から2.0パーセントイソフルランを供給ノーズコーンとスキャナの動物のベッドの上で動物を置きます。必要に応じて、毎分≤60呼吸と動物の安定した呼吸活性を達成するためにイソフルランの流れを調整します。
  6. 安全インターロックを係合するために右にスライドさせることにより、機器のドアを閉じます。リアルタイムに被写体を表示するには、制御ソフトウェアのウィンドウに表示されるライブモード]ボタンをクリックすることで、ライブモードをオンにします。 X-キャプチャウィンドウや動物を観察します。
    注:ドアが正しく閉じられ、安全インターロックが締結されない限り、楽器は、X線を発生しません。
  7. 前後に、機器の前面パネルにあるボタンをステージZ軸制御を押してビュー(FOV)のフィールド内でマウス胸を整列させるために、動物のベッドを移動します。胸がFOV内の中央にあることを確認します。トンを配置するために、機器の前面パネルにある動物ベッドコントロール左右の矢印を使用します青いバウンディングボックスの内側彼は動物。
    1. 制御ソフトウェアのウィンドウに表示される回転制御ドロップダウンリストから「90」を選択し、[設定]ボタンをクリックして、ガントリを回転させます。動物はX-キャプチャウィンドウの青いバウンディングボックス内に留まることを確認してください。必要に応じて、機器の前面パネルにある動物のベッド制御UPとDOWNの矢印を使用して動物を揃えます。
      注:X-キャプチャウィンドウに表示される青色のバウンディングボックス内のみの画像データは、3Dボリュームを再構築するために使用されます。
  8. 心肺痕跡がはっきりと同期ビューで表示されるようにXcaptureウィンドウで、マウスの左クリックで、マウスカーソルでエッジROIをドラッグして興味(ROI)の心肺領域のサイズを変更します。 ROIは、振動板と、すべてのガントリ位置における心臓の頂端部を覆うことを確認してください。カーディはそれを確認するためにステップ3.6で説明したように、ガントリと90度回転O-呼吸痕跡がまだはっきりと見えます。
    注:電離放射線への不必要な曝露を防止するために、動物の位置および心肺ROIが調整される時間を最小限に抑えます。
  9. 買収を初期化する制御ソフトウェアのウィンドウに表示されるCTスキャン]ボタンをクリックします。 CTスキャンの確認メッセージが表示されます。確認するために、CTスキャンの確認メッセージに示されているYES]ボタンをクリックします。スキャンを中止するにはNoボタンをクリックし。 YESボタンを押すと、楽器に位置赤色のX線通電表示が点灯します。
    注:表示も制御ソフトウェア窓の機器ステータスボックスの点滅電圧アイコンで表示されます。スキャンは4.5分で完了します。 X線管は自動的にオフになり、機器上および制御ソフトウェアのウィンドウのコントロールパネルにある赤いX線通電表示が暗くなります。突起は自動的にソートされ、PROGされますRESSはGetSynchronizedRawウィンドウに表示される緑色のプログレスバーで表示されます。心臓周期の拡張末期と収縮末期の段階を表すボリュームセットは自動的に2-3追加分以内に再構築されます。
    注:スキャンは制御ソフトウェアのウィンドウのコントロールパネルに緊急停止ボタンをクリックするか、機器の前面パネルにある機械式非常停止ボタンを押して中止します。
  10. 横断、冠状、及び2Dビューアソフトウェアの再構成のサジタルビューを観察します。取得した画像の品質を確認するために数秒かかります。麻酔の不満レベルによって引き起こされる可能性が動物の動きの兆候を探してください。必要に応じて、適切な修正を行い、スキャンを繰り返します。
    注:画像内の構造は、二重エッジに示され、二倍、またはすじで示されている場合、これらは、麻酔のレベルが不十分であり得ることを示すことができ、通常の「赤旗」であり、その動物は、スキャン中に移動しました。このような場合には、麻酔のレベルを調整する必要があり、スキャンを再取得する必要があります。
  11. スキャナから動物を削除し、監督の下で麻酔から完全に回復を可能にします。
  12. コントラスト取り込み(造影剤注入後3〜6時間)の代謝段階の間に追加のマイクロCTスキャンを取得します。
    :C57BL / 6およびBALB / cマウスの平均心筋強化値についての詳細はDetombeらとアシュトン 22,23によって出版されました。

4.ミクロデータ分析

  1. 12ソフトウェアの分析に拡張末期と収縮末期VOXファイルの両方をロードします。
  2. 斜めセクションモジュールでロードされた各画像を開き、短軸像の再編成を行います。
  3. 画像処理時間を最小限にするために、画像計算モジュールの小区域/パッドボリューム機能を用いて画像をトリミング考えます。両方のボリュームについては、同一のSを維持ubRegion LowとHigh X、Y、Z寸法。
  4. 両方のボリュームを追加し、ボリュームの編集モジュールを開きます。必要に応じて構造のより良い視覚化のために、画像強度を調整します。
  5. 心内膜輪郭セグメンテーションを行います。左心室腔が心筋から線引きされるように、ボリュームの編集モジュールを選択し、オブジェクト抽出の半自動]タブから、左心室(LV)にシード点を設定し、しきい値を調整します。しきい値を決定するには、自動閾値化アルゴリズムやラインプロファイルモジュールで決定全幅半最大値(FWHM)を使用します。
    1. 大動脈に広がる地域を防止するために、僧帽弁尖面に沿って限界を描き、セグメント化を完了するために、抽出オブジェクトボタンをクリックします。拡張末期と収縮末期容積の両方が自動的に処理されます。 ( 例えば LVキャビティ)領域に名前を付け、対応するファイルのディレクトリへのオブジェクトのマップを保存します。
  6. PerfoRM心外膜輪郭セグメンテーション。新しいオブジェクトを追加し、ボリュームの編集モジュールの半自動または手動のいずれかのセグメント化ツールを使用して、心外膜心臓表面のセグメンテーションを行います。両方の拡張末期と収縮末期輪郭が正しく識別されていることを確認してください。必要な場合は、手動調整を行います。 領域 (例えばLV心筋)に名前を付け、対応するファイルのディレクトリへのオブジェクトのマップを保存します。
    注:空間フィルタモジュールとフィルタリング画像がさらにセグメント化の速度及び品質を向上させるために行うことができます。
  7. オブジェクト・マップから体積測定値を抽出するために(保存)インタレスト・モジュールの地域で追加さボリュームを開きます。補正されたマップがロードされていることを確認し、サンプルのオプションウィンドウを開き、LV空洞とLV心筋の両方のオブジェクトが選択されていることを確認し、サンプル画像]ボタンをクリックします。ログファイルを保存します。
  8. 心機能および代謝の地域分析のために、ラジアルディを使用インタレスト・モジュールの地域のviderツールは、さらにセグメント化されたボリュームをさらに分割します。

グローバルおよびリージョナル・ハートパラメータの5.計算

  1. 左心室ストロークボリューム(LVSV)を計算するには、左心室拡張末期容積(LVEDV)から左心室収縮末期容積(LVESV)を引きます。
    LVSV = LVEDV - LVESV。
  2. 左室駆出率(LVEF)を計算するには、左心室拡張末期容積(LVEDV)によって左心室ストロークボリューム(LVSV)を分割して100%を掛け:
    LVEF = LVSV / LVEDV * 100%。
  3. 心拍出量(CO)を計算するために、心拍数(HR)による左室一回拍出量(LVSV)を乗算します。
    CO = LVSVの*のHR。
  4. 左心室の心筋質量(LVMM)を計算するには、左ventrから心内膜表面(LVMV ENDO)によって結合された左心室の心筋壁の量を差し引きますicular心外膜表面(LVMV EPI)によって結合された心筋壁の量、および心筋の比重を掛け、1.05グラム/ cm 3で:
    LVMM =(LVMV EPI - LVMV ENDO)* 1.05;
  5. 左心室の心筋の質量指数(LVMMI)を計算するには、マウスの体重(BW)により、左心室の心筋質量(LVMMを)分けます:
    LVMMI = LVMM / BW;
  6. 左心室の心筋梗塞サイズ(%LVMIS)の割合を計算するために、全体の左心室の心筋ボリューム(LVMV TOTAL)により梗塞した心筋(LVMV MI)の左室容積を分割し、100%を掛け:
    %LVMIS = LVMV MI / LVMV 合計 * 100%。
    注:LVMM、LVMMI、および%LVMISの計算については、対応する拡張末期や収縮末期のデータセットから内視と心外膜体積測定を使用しています。平均収縮終期およびエンド-ジを報告astolic指標。
  7. 分節左心室壁運動異常(LVWM)を計算するために、心室拡張末期壁径(LVEDWD)左分節から心室収縮末期壁直径(LVESWD)左の分節を引きます:
    LVWM = LVEDWD - LVESWD。
    周極性マップ(ブルズアイ極プロット)として結果を表示します。
  8. 分節左心室壁肥厚(%のLVWTh)を計算するには、心室収縮末期の壁の厚さ(LVESWTh)左分節から心室拡張末期壁の厚さ(LVEDWTh)左の分節を引き、分節による除算は、心室拡張終期の壁を残しました厚さ(LVEDWTh)、および100%を掛け:
    %LVWTh =(LVESWTh - LVEDWTh)* 100%/ LVEDWTh。
    周極性マップ(ブルズアイ極プロット)として結果を表示します。
  9. 地域の駆出率(%REFを)計算するには、分節左心室収縮末期の二乗を減算壁の心室拡張末期壁径(LVEDWD)を左分節の広場から直径(LVESWD)、心室拡張終期壁径(LVEDWD)を左分節の二乗で割って、100%を掛け:
    %のREF =(LVEDWD 2 - LVESWD 2)/ LVEDWD 2 * 100%。
    周極性マップ(ブルズアイ極プロット)として結果を表示します。
  10. 局所心筋灌流およびコントラスト取り込みを提示するために、平均強度値は、CT値(ハウンズフィールド単位、HU)に変換。水で満たされた小型無線-透明チューブを使用して、HU 0に1000年HU、および水 - 動物への外に選択した領域から選択された空気を再スケーリングすることにより、両方の拡張末期と収縮末期のデータセットに変換します。周極性マップ(ブルズアイ極プロット)として結果を表示します。

6.統計解析

  1. 平均±標準偏差(SD)として、すべての極座標表示データを表します。 STATを評価します一方向分散分析(ANOVA)または別の適切な技術を用いてistical差。

Representative Results

ミクロの取得、画像再構成、および画像品質評価。

フォーC57BL / 6マウス、永久LAD閉塞および持つ3 1偽手術に成功し、手術から回収し、単一の造影剤の静脈内ボーラス投与と2 4.5分間心肺ミクロの買収から成って撮影プロトコルを完了しました。マイクロCT研究中の平均心拍数は毎分385±18拍でした。拡張末期と収縮末期の画像再構成が必要とされていなかったようなECGリードと呼吸空気圧センサとしての呼吸と心臓モニタリングデバイスを捧げている、独自の本質的な画像ベースのゲーティングを使用していました。復興に続いて、両方の拡張末期と収縮末期のデータセットの画質は、2Dビューワーソフトを使用してプレビューしました。画質が良好発見されたと必要はなかったです追加の画像取得を実行します。したがって、報告されたすべてのデータは、マウスあたり2つのスキャンに由来しました。最初のスキャンは、10分のコントラストの血液プールの段階中に注射後採取し、第2の走査は、コントラストの代謝取り込みフェーズ中に3-4時間後に注射を取得しました。代表的血液プール心筋梗塞のマウスの心臓の短軸方向の拡張末期と収縮末期の断面( 図1)および心筋梗塞のないマウスの心臓の( 図2)は少しバックグラウンドノイズと優れた左心室腔の描写を実証しました、正確な解剖学的および機能評価を可能にします。心筋梗塞に対応するコントラストの希薄化の分野では十分ではなく、偽動作する動物( 図2)で、LAD冠動脈結紮( 図1)を施したマウス心臓の短軸方向の画像に画定されました。

左心室機能の定量的評価。

しきい値ベースの3Dセグメンテーションは、それぞれの動物に、左心室拡張末期容積(LVEDV)と左心室収縮末期容積(LVESV)を決定するために、拡張末期と収縮末期容積の両方で行われました。左心室の一回拍出量(LVSV)、左室駆出率(LVEF)、および心拍出量(CO)は、第5ボリュームとグローバル機能の測定結果に記載の式に従ってLVEDV及びLVESVから計算した1に要約します。 。3時間ライゲーションした後、動物の体重のための正規化は、LVEDVは心筋梗塞群と偽手術動物(2.8±0.23対2.3)との間に差はなかったわけ。しかし、体重正規化平均LVESVは心筋梗塞群(2.1±0.31対0.92)に高かったです。対応しますLY、平均LVEFとLAD冠状動脈閉塞を有するマウスにおける心拍出量(CO)は偽手術マウス(23.1%7.1%±対60.5パーセントと比較した場合に低かった、と0.08ミリリットル対0.55ミリリットル±0.26ミリリットルそれぞれ)。

LV心筋質量および梗塞サイズの定量的評価。

どちらの左心室の心筋質量(LVMM)および左心室の心筋マスインデックス(LVMMI)は心外膜と乳頭筋と骨梁などの心内膜セグメンテーションに基づいて決定しました。拡張末期及び収縮末期再構成の両方を処理して、心筋梗塞群と偽手術動物の両方の値は、表1に要約する。心筋梗塞ボリュームがしきい値ベースの3D容積測定を使用して、コントラスト希薄に基づいて決定しました。 表1に示すように 、3時間後、LADコロナRY動脈結紮マウス1、2、および3の危険域(AAR)は22.4%、13.3%、およびLVMMの15.8%ありました。

心筋血流イメージング(MPI)。

心筋梗塞(マウス4)なしの代表拡張末期および心筋梗塞(マウス1)およびマウスとマウスでは心筋血流の収縮末期周極プロットが表示されます(ブルズアイ極プロット)は、 図3と図 4に示されています。プロットを生成するために使用される画像は、造影剤投与後10分、LAD結紮後3時間を得ました。同じ動物から得られた拡張末期と収縮末期homosegmental値は異なっていませんでした。しかし、hypoenhancementは半ば前部、ミッド下外側、半ば前外側、頂端前方、および心筋とマウスの頂端側方セグメント内で観察されましたLAD動脈閉塞( 図3)により引き起こされる冠動脈血流の障害を示すfarction。そのような障害は、偽手術動物( 図4)の中心部に観察することができませんでした。

心筋生存率および代謝

心筋梗塞のない心筋梗塞(マウス1)およびマウスとマウスでは心筋の代謝取り込み(マウス4)の代表的な拡張末期と収縮末期周極プロットが表示されます(ブルズアイ極プロット)は、 図7および 8に示されています。プロットを生成するために使用される画像はLAD結紮後に造影剤投与後3-4時間、5-6時間を取得しました。異種心筋コントラスト取り込みは視覚的にもLAD冠状動脈閉塞を受けたマウスの心臓の短軸方向の断面(で観察することができました図6)。同じ動物から得られた拡張末期と収縮末期ホモ分節の値が異なっていませんでした。周極座標プロットは、心筋灌流マップ( 図2)に示したものと同様のパターンを有するセグメント特異的な異常( 図7)を示しました 。いいえ、コントラスト取り込み欠陥は、偽手術マウス( 図8)の周極プロットに見られませんでした。

LV地域機能の定量的評価

画質は、すべての画像化されたマウスで左心室の動きと拡張末期と収縮末期再構成からの肥厚を視覚的に評価を行うことが良好でした。私のなしのマウスの各セグメントのためのLV壁運動、肥厚や地域の駆出率のスコア ocardial梗塞は、 図9 および10に示されている。期待されたようには効果が偽手術マウス( 図10)で観察されなかった、LAD冠動脈結紮は、LV地域の機能指数( 図9)の著しい減少をもたらしました。

図1
図1. 代表的血液プールの短軸方向の拡張末期 (A)と収縮末期(B)心筋梗塞のマウスの心臓の断面(マウス1)。画像はLAD冠状動脈閉塞後3時間と造影剤投与後10分を取得しました。黄色の矢印で指摘負のコントラストが梗塞領域における造影混濁が不足しているためです。

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図2. 代表的血液プールの短軸方向の拡張末期 (A)と収縮末期(B)心筋梗塞のないマウスの心臓の断面(マウス4)。画像は、偽手術後3時間及び造影剤投与後10分を取得しました。コントラスト混濁はすべて、心筋のスライスで均一に存在しています。

図3
図3.代表的拡張末期および心筋梗塞(マウス1)を持つマウスでは心筋血流の収縮末期周極プロットが表示されます(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室は、基礎、ミッドキャビティに細分化され、そして頂端短軸の部分は17セグメントAHAモデル25に記載の方法。異種灌流は半ば前方にはっきりと見える、ミッド下外側、半ば前外側、頂端前部、頂端側方セグメント。示されている値は、分節は標準偏差±ハウンズフィールド単位で意味表します。 (B)心筋潅流マップが17のセグメントに細分化することなく、示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心は、図示されていません。

図4
心筋梗塞(マウス4)のないマウスにおける心筋灌流の 図4. 代表的拡張末期と収縮末期周極プロットが表示されます(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室は、基礎、ミッドキャビティに細分化され、そして頂端短軸の部分は17セグメントAHAモデル25に記載の方法。同様の灌流は、すべてのセグメントに存在しています。示されている値は、分節は標準偏差±ハウンズフィールド単位で意味表します。 (B)心筋灌流マップは17のセグメントに細分化せずに示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心は、図示されていません。

図5
図5. 代表的な代謝取り込み、短軸方向の拡張末期 (A)および心筋梗塞(マウス1)とマウス心臓の収縮終期(B)断面。画像はLAD冠状動脈閉塞後6-7時間、造影剤投与後3-4時間を取得しました。白い矢印で述べた負のコントラストが梗塞領域における造影代謝摂取が不足しているためです。

図6
図6. 代表的な代謝取り込み、短軸方向の拡張末期(B)心筋梗塞なしのマウスの心臓の断面(マウス4)。画像は、偽手術後6-7時間と造影剤投与後3-4時間を取得しました。コントラストの心筋代謝取り込みはすべてのスライス中に均一に存在しています。

図7
図7. 代表的拡張末期と収縮末期周極プロットが表示さ心筋梗塞のマウスでは心筋の代謝取り込みの(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室は、基礎、半ば空洞、および短い頂端に細分され、 17セグメントAHAモデル25に従って-axial部分。異種の代謝取り込みは半ば前外側、頂端前方、下頂端、及び頂端側方のセグメントにはっきりと見えます。示されている値は、ハウンズフィールドユニでセグメント平均を示します標準偏差±TS。 (B)心筋代謝取り込みマップが17のセグメントに細分化せずに示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心は、図示されていません。

図8
図8. 代表的拡張末期と収縮末期周極プロットが表示され、心筋梗塞のないマウスでは心筋の代謝取り込みの(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室は、基礎、半ば空洞、および短い頂端に細分され、 17セグメントAHAモデル25に従って-axial部分。異種の代謝取り込みは半ば前外側、頂端前方、下頂端、及び頂端側方のセグメントにはっきりと見えます。示されている値は、分節は標準偏差±ハウンズフィールド単位で意味表します。 (B)心筋metaboliCの取り込みマップは17のセグメントに細分化せずに示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心は、図示されていません。

図9
図9. 代表的心筋壁運動(ミリメートル)、壁肥厚(%)、および地域駆出率(%)周極プロットが表示さ心筋梗塞とマウスの(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室がに細分化され、 17セグメントAHAモデル25によれば、基礎、中の空洞、および心尖部短軸部分。ミッドキャビティと頂端部分で運動低下、無動、およびジスキネジア領域の存在は、広範囲な心筋の欠陥を示しています。 (B)局所心筋測定マップは17のセグメントに細分化せずに示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心があります図示していません。

図10
図10. 代表的心筋壁運動(ミリメートル)、壁肥厚(%)、および地域駆出率(%)周極プロットが表示され、心筋梗塞のないマウスの(ブルズアイ極プロット)。(A)左心室がに細分化され、 17セグメントAHAモデル25によれば、基礎、中の空洞、および心尖部短軸部分。明らかな異常が検出されません。 (B)局所心筋測定マップは17のセグメントに細分化せずに示されています。心尖​​部(セグメント17)に対応​​するプロットの中心は、図示されていません。

表1
表1.左室容積とグローバル機能の指標のMEAS3時間LAD冠動脈閉塞後3マウスおよび偽手術マウスでured * BPMは、分あたりのビート。 LVEDV、左心室拡張末期容積; LVESV、左心室収縮末期容量; LVSV、左心室ストロークボリューム。 LVEF、左室駆出率; CO、心拍出量。 LVMV TOTAL、総左心室の心筋ボリューム。 LVMM、左心室の心筋の質量; LVMMI、左心室の心筋重量係数; LVMV MI、左心室心筋梗塞のボリューム。 %LVMIS、%左心室の心筋梗塞サイズ。

Discussion

過去数年にわたりマイクロCTは、小動物における心臓の構造と機能の特徴づけ26-29,30ために考慮モダリティ多くの研究となっています。しかし、従来の研究で使用される機器はいずれかのカスタム構築されなかったか、もはや商業的に入手可能です。このように、本研究は、ヒトの心臓のモデルとして小動物における心筋灌流および生存率と一緒に心臓世界と地域の機能を決定するための本質的な心肺ゲーティングの高速マイクロCTシステムを使用するためのシンプルかつ包括的なプロトコルを提供することを目的としました疾患。

心臓の構造と機能を研究するための最も重要な要件の1つは、生理的な心臓の動きを説明するために、スキャナの能力です。この目的のために、ECGベースの前向きおよび後ろ向きのゲーティング技術を使用することができます。しかし、将来の(ステップシュート)ゲーティングは、試験のために、心周期の事前指定された間隔に依存していますPLE拡張期に、心臓の動きは、少なくともときです。このアプローチでは、心周期ごとに1つの画像が取得され、心周期の一つだけ位相を再構成することができます。このように、生成するために時間がかかることに加えて、プロスペクティブゲーティング再構成は、機能情報を奪われている唯一のデータセットを生成します。レトロスペクティブゲーティングは、他の一方で、このように世界と地域の左心室の機能解析を可能にする、心臓サイクルの各部分で複数のデータセットの再構築を可能にします。

現在の仕事は、固有のレトロスペクティブゲーティングで心肺再構成を採用しました。極限レトロスペクティブゲーティングは、専用の呼吸と心臓監視デバイス29,31,32を必要とせずに拡張末期と収縮末期の心位相を再構築するために、独自の画像ベースのソフトウェアを利用しています。 studyiのための本質的な遡及的および外因性ECG依存レトロスペクティブゲーティングの優れた一致マウスおよびラットにおけるNG心機能はディンケル 29によって示されました。それを正しく設定するために、このようなECGリードと呼吸空気圧センサー、ならびに追加のオペレータのスキルとして、この本研究、本質的なレトロスペクティブゲーティング大幅にスキャンを設定するために必要な時間を最小化するだけでなく、監視ハードウェアへの依存を解消するだけでなく、中に。

復興に続いて、両方の拡張末期と収縮末期のデータセットの画質は、心臓分析のために満足な発見されました。画像の検査時には、特に注意が一般に起因する高い呼吸速度、低減衰アーティファクトを持つ動物では不足している突起の結果として発生する可能性がアーティファクトをストリーキング、麻酔の不満レベル中に発生する可能性のあるモーションアーチファクトに支払われました骨構造および灌流欠損を模倣することができ、1つ以上の検出器ELEの誤較正または障害から生じ得るリングアーティファクトメント。

心臓の構造的および機能的な情報を生成するためのマイクロCTの能力はまた、適切な血管内の造影剤の利用可能性に依存しています。ほとんどの現在市販されているマイクロCTコントラストは、一般的に粒子状非代謝性マクロファージに特異的であり、多分散代謝ヨウ素系のコントラスト23,33-36を細分化することができます。粒子状の薬剤は、それらの高い原子番号(バリウム、Z = 56;と金、Z = 79)に大きいX線不透明化を提供していますが、それらは代謝評価のために使用することはできません。また、これらの薬剤は、生物に有害と見られ、肝臓マクロファージ(クッパー細胞)、細網内皮系(RES)の細胞捕捉して除去します。なぜなら、それらの非代謝性の性質のため、これらの薬剤は、肝障害37と肝臓微小循環の付随する変化を誘導します。

代謝性ヨウ素系コントラストは、他の一方で、タージェではありませんテッドは、RES-特異的に除去するために、より良好な安全性プロファイルを提供し、肝臓毒性を避けるべきです。それらのよりよい安全性プロファイルに加えて、これらのコントラストは、このように生存能力評価22,23のために使用することができる、代謝的に活性な組織により取り込まれます。この目的のために、ヨウ化造影剤は、本研究のために選択しました。コントラストは、単一のボーラス静脈内注射などの動物体重のグラムあたり5または10マイクロリットルの投与量で投与しました。両方の用量は十分な拡張の結果が得られたが、コントラストを10μl/ gを注入した場合、コントラストの左心室の心筋レベルの用量依存的増加が観察されました。興味深いのは、より大きな用量で、血液プールの持続時間を長くし、心筋の造影取り込みのピークは遅れました。一匹の動物(マウス1)は、手術後10週間、それは隔週画像化した。この期間中に追跡しました。経験から、何ら悪影響は5の(合計のコントラストに関連していませんjections)またはX線照射(10マイクロCTスキャンの合計に関連する)モニタリングの期間中に、このマウスで観察されました。長期的なヨウ素暴露の最も一般的に報告された副作用の一つは、死後の検査で肉眼では観察されなかった甲状腺の乱れです。マンハイムらは、3回連続コントラスト投与後チロキシンレベルを研究し、レベルは対照37と比較した差異は見られませんでした。同じマイクロCTデータセットを使用して、放射線誘発性肺線維症の徴候は、処置の安全性準拠した(データは示さず)、この動物において検出されませんでした。

世界と地域の心室心臓機能の評価は、治療的介入38,39の予後と選択の面で最強の心臓パフォーマンスの決定要因と重要であると考えられます。グローバルな左心室機能の指標は、(左心室拡張末期容積を含みますLVEDV)、左心室収縮末期容積(LVESV)、左心室の一回拍出量(LVSV)、左室駆出率(LVEF)、および心拍出量(CO)。以前のマイクロCT研究は世界的な心機能の定量的な評価は、マウスの心臓血管疾患モデルで可能であり、世界的な心臓機能のその顕著な減少がすぐにLADの動脈閉塞後に行われることを確認しました。これらの知見はLVSV、LVEFのその顕著な減少で以前の報告と一致している、とCOは、閉塞29,40-43後1日目にすでに発生しました。従って、正確な測定のための画像取得時の心拍数は、可能な44のような生理学的に保たれるべきであり、心臓の機能的性能は、麻酔の種類と程度に依存することに言及することは注目に値します。

左心室の心筋質量(LVMM)の定量的評価は、左心室肥大の評価のために重要であり、主にMRを用いて行きました私11,43,45,46。 LVMMは、多くの場合、体重に関して補正し、異なる年齢や体型のマウスのうち、心臓重量の正常化を可能にするために、左心室の心筋重量係数(LVMMI)として提示されています。心筋梗塞のマウスは有意な左室肥大47を開発するとして、これらのパラメータの正確な推定は、重要です。 LVMM、LVMMI、およびLVジオメトリの評価は、心肥大および異形成11の診断のためにも重要です。このように、これらのパラメータの決意は、求心性肥大、偏心肥大、又は同心円リモデリングなどの状態を区別するためにさらに有益であろう。本研究では、LVMMとLVMMI両方の値は、LAD動脈結紮を施したマウスおよび偽手術動物で測定しました。続いて、心筋梗塞の大きさを同定し、梗塞の大きさの割合を計算しました。手術中にLAD冠状動脈への合字があったがAPPL同じレベルでIED、ある程度の変動と閉塞生成梗塞:13.3%、15.8%、および22.4%( 表1)。この変動のための一つの可能な説明は、冠動脈解剖学と動物の間彼らの領土の血液供給の違いから発生し、以前の報告48と一致してあります。心筋梗塞のマウスモデルにおける梗塞サイズの評価の最も一般的な方法 、ex vivoでトリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色、同じ動物における疾患の長手方向の監視を許可しませんでした手法によるものです。アシュトン 22によると、この本の以前の研究の文脈では、ヨウ化造影剤と組み合わせてミクロ代替と長手方向に梗塞サイズを決定するための非破壊的方法を提供することができることは注目に値します。

マイクロCT技術のさらなる利点は、局所虚血の非常に正確な決意です。リーKEヒトでマウスの左冠動脈は下降動脈(LAD)および中隔枝(LCX)に分かれます。しかし、マウスでは、LADとLCXの側brachesの解剖学は、動物48の間で大きく異なります。 LCXの大きなbrachesは時々密接LADを平行し、マウスの冠状動脈が心筋イントラため、表示されませんので、LCXのサイドブレースは、時間に誤っが、不可避的にマウス脳梗塞手順の間に冠動脈閉塞に含まれています。セクター7、10、11、12ながら灌流造影取り込みセクター2、3、8,9がLCXの影響を受けるので、そのようなものとして、ミクロ後に得られたcircumferentional極性マップは、冠状動脈が閉塞された正確に決定することができます、13、15、16及び17は、LADによって供給されます。したがって、ポーラーマップは、閉塞した動脈の正確な決意のための大きな利点であり、それに応じてmyocaの影響の正しい解釈に重要なことを助けます心機能と疾患の進行のrdial梗塞。

心筋梗塞のマウスモデルは非常に模倣冠状血管が突然、急性プラーク破裂の結果として、閉塞および梗塞心臓49の疾患の開発を研究するための大きな利点のようであるなっヒト臨床状況を使用していました。開発した欧米諸国で心筋梗塞を患っている患者の治療を迅速に冠状血管の循環を回復することを目的としているが、多くの場面で、特に心筋梗塞の発生率は急速に増加している少なく経済的に先進国では、閉塞がで環化することはできません時間1,50。これは、ほとんどの場合、慢性心不全につながると公衆衛生に多大な負担があります大規模な心室梗塞に誘導します。したがって、永久冠動脈OCCと心筋梗塞モデルを用いて、長手方向の非侵襲的診断法lusionと大きな心室の梗塞はこの疾患に対する新たな治療戦略を開発するために非常に重要です。

心筋のCT灌流イメージングは​​、定量的な地域の冠動脈の血流異常の評価と心機能および生存率との関連性を可能にし、急速に進化する技術です。新しい小型の動物実験は、マイクロCTとSPECT、灌流および生存能力評価の22のための選択のモダリティとの間のギャップを減少させました。 LAD冠状動脈閉塞によって引き起こされる局所血流障害の程度を評価する目的で、マイクロCTデータは、心筋パーフュージョン情報を評価しました。ライゲーションLAD動脈を自由壁、隔壁の一部、及び左心室の頂端領域への血液供給を提供することが知られています。マウス1の心筋灌流欠損(hypoenhanced領域)は半ば前部、ミッド下外側、半ば前外側、頂端での極座標系と明白に示されています前部、頂端側方セグメントは、調査結果は同じ冠動脈分布( 図3)と一致しています。拡張末期と収縮末期画像由来の血流障害との間の差異はhomosegmentsで見つかりませんでした。偽手術動物の拡張末期と収縮末期心筋灌流ポーラーマップ表示は、 図4に示されている。対照動物のセグメント間の心筋血流のわずかな違いは、拡張末期と収縮末期の表現の両方に重要ではありません。興味深いことに、hypoenhancementの領域は、視覚的に( 図1)の短軸断面画像上で見ることができ、 図3に示すように、容易に定量化することができる。これはBefeda らの研究では不可能であったによって説明することができますマイクロCT機器の大きなノイズが22を使用していました。視覚的に識別するために、信号の差は、少なくとも3〜5倍大きくなければなりません画像51のノイズ(標準偏差)より。本研究で用いたミクロの低ノイズは、心筋血流パターン欠陥の成功評価を可能にする、損なわれ、正常に灌流心筋との間の小さな信号差(127HU±23HU対217HU±29HU)の検出を可能にしました。

ヨウ素化造影剤を使用することの主要な利点の一つは、心筋生存性及びコントラストに関連する心筋の増強による代謝を評価する能力です。我々の知る限りでは、心筋を増強するコントラストの能力は最初Detombe 23によって記載され、心筋梗塞のイメージングのための最初の使用は、アシュトン 22によって報告されました。グループは、心筋梗塞を有するマウスにおける灌流心筋は対照と同様増強を示したことが示され、および梗塞心筋には強化、分節心筋Eの定量的評価を示さなかったことが、nhancementは報告されませんでした。空洞への心筋の拡張に対しては最大であった場合、4時間の造影剤投与の後 - さらに、心筋増強を定量的に評価することができるかどうかを調べるために、すべてのマウスは3、同じ撮像プロトコールを使用してイメージを再作成しました。

心筋コントラスト取り込み欠陥が視覚的にではなく、偽手術動物( 図6)で、心筋梗塞( 図5)とマウス心臓の短軸方向の拡張末期と収縮末期断面画像上で観察されました。心筋の取り込みを定量的に拡張末期と収縮末期再構成の両方からそれぞれ心筋セグメントにおいて評価し、極座標系( 図7および8)で発表されました。同じ動物から得られた拡張末期と収縮末期homosegmental値は異なっていませんでした。しかし、周極プロットは、セグメント固有の異常を示した(FigurE 7)心筋灌流マップ( 図2)に示したものと同様のパターンを有します。いいえ、コントラスト取り込み欠陥は、偽手術マウス( 図8)の周極プロットに見られませんでした。心筋の取り込みデータは、グローバル機能解析及びLV心筋の質量および梗塞サイズの定量的評価を行うために十分な品質であった(図示せず)。永久LAD冠状動脈閉塞で現在使用されているモデルに関係していないが、我々は対照的に、心筋抽出はなく、心筋細胞の状態に( 例えば瘢痕、唖然と冬眠心筋)、だけでなく、局所心筋血流量の変化に関連させることができると信じています。この仮説をテストするには、今後の作業は一時的な心筋虚血および再灌流でモデルを採用します。

収縮期fのような重要なマーカーとして役立つ心筋壁運動と肥厚で心筋結果の積極的な収縮慰めと心筋生存性。局所壁運動、肥厚、および駆出率の評価は、積極的な心筋収縮から受動的収縮期の壁運動を識別するのに役立ちます。標準化された病変の程度および重症度の定量化、壁運動、壁肥厚、および地域駆出率を有効にするためには、一般的に極性マップにマッピングされます。地域の心室壁運動の異常は、最も一般的にMRI 52によって評価される心筋虚血の重要なマーカーです。心筋梗塞とないマウスの各セグメントのLV壁運動、肥厚や地域駆出率スコアは、 図9 および10に示されている。期待されたように、LAD冠動脈結紮はLV地域の機能の指標(の著しい減少をもたらしました図9)が 、全く効果のに対し、偽手術マウス( 図10)で観察されました。これらの結果はと一致しています以前のデータを報告しました。

結論として、この作品は、健康や​​心筋梗塞のマウスモデルにおける心筋灌流および生存度の評価とともに、心筋の世界と地域の機能パラメータの包括的な決意ための高速マイクロCTシステムの最初の成功した使用を実証してきました。この研究は、さらに、心臓機能および病態生理学的変化の正確かつ非破壊評価のための、および新規な予防および治療戦略の評価を可能にする、心臓血管疾患の他のモデルの特徴付けに向けて拡張することができます。

Disclosures

EDバンD.、RR、JEは、彼らが何の競合金融利害関係を持たないことを宣言します。 SBは、撮像機器を製造してパーキンエルマーの有給従業員です。このこの動画の記事のための出版費用は、パーキンエルマーによって支払われました。

Acknowledgments

この作品は、動脈疾患をstenosing対拡張するステフティングLijf専用リーベン、プロジェクトによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantum FX MicroCT Imaging System PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA Micro Computed Tomography System
XGI-8 Anesthesia System PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA Cat. No. 118918 Gas Anesthesia System
Analyze 12.0 Software Analyze Direct, Overland Park, KS, USA Visualization and Analysis Software for Imaging
eXIA160 MicroCT Contrast Binitio Biomedical, Ottawa, ON, CANADA Cat. No. eXIA160-01; eXIA160-02; eXIA160-03; eXIA160-04; eXIA160-05 Iodine based Radiocontrast for MicroCT Imaging
Isoflurane Pharmachemie BV,
Haarlem, Netherlands
Cat. No. 45.112.110 inhalation anesthesia
1/2CC U-100 28G1/2 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company,
USA
Cat. No. 329461 Insulin syringes with sterile interior
Leica microscope type M80 Leica Microsystems BV, Eindhoven, Netherlands Stereo zoom microscope

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