Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales
Neuroscience

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Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J. Vis. Exp. (108), e53673, doi:10.3791/53673 (2016).

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Abstract

fibre lunghe che scendono verso il midollo spinale sono essenziali per la locomozione, percezione del dolore, e altri comportamenti. Il modello terminazione in fibra nel midollo spinale della maggior parte di questi sistemi in fibra non sono state esaminate a fondo in qualsiasi specie. fibre serotoninergici, che proiettano al midollo spinale, sono stati studiati nei ratti e opossum su sezioni istologiche e il loro significato funzionale è stata dedotta in base al loro modello di terminazione in fibra nel midollo spinale. Con lo sviluppo della chiarezza e tecniche cubica, è possibile studiare questo sistema di fibre e la sua distribuzione nel midollo spinale, che rischia di rivelare caratteristiche precedentemente sconosciuti di percorsi supraspinal serotoninergici. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging delle fibre serotoninergici nel topo midollo spinale utilizzando la nitidezza, associato e le tecniche cubi. Il metodo prevede la perfusione di un mouse con una soluzione idrogel e chiarificazione del tessuto con una combinzione di compensazione reagenti. tessuto del midollo spinale è stato eliminato in poco meno di due settimane, e la conseguente colorazione immunofluorescenza contro la serotonina è stata completata in meno di dieci giorni. Con un microscopio a fluorescenza multi-fotone, il tessuto è stato digitalizzato e l'immagine 3D è stata ricostruita utilizzando il software OsiriX.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Animal Care and Ethics (ACEC) presso l'Università del New South Wales (il numero ACEC approvato è di 14 / 94A).

1. Preparazione del cavo del mouse trasparente spinale

  1. Preparazione di Ice Cold Hydrogel Soluzione
    1. Preparazione della soluzione di paraformaldeide al 16% (PFA)
      1. Aggiungere 16 g di polvere di paraformaldeide in 70 ml-pre riscaldato acqua distillata (50-55 ° C) e mescolare su un agitatore magnetico riscaldata fino paraformaldeide si scioglie. Nota: Non lasciare che la soluzione per il riscaldamento oltre 55 ° C ed essere consapevoli del fatto che paraformaldeide è tossico.
      2. Trasferire la soluzione paraformaldeide ad un cilindro e aggiungere acqua distillata fino a 100 ml. Raffreddare la soluzione paraformaldeide utilizzando un C frigorifero a 4 °.
    2. Sciogliere 125 mg VA-044 iniziatore 26,25 ml di acqua distillata e raffreddare la soluzione in un 4° C frigo.
    3. Raffreddare 5 ml di soluzione di acrilammide (40%), 1,25 ml di soluzione di bis (2%) (ATTENZIONE: Bis e le soluzioni di acrilamide sono tossici, può causare difetti genetici o il cancro), 5 ml di 10X PBS, 12,5 ml al 16% soluzione PFA, e la soluzione di iniziatore VA-044 su ghiaccio.
    4. Mescolare le soluzioni sopra sul ghiaccio.
      Nota: il volume totale è di 50 ml.
  2. Perfusione e Raccolta del cavo del mouse spinale
    1. Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluito in soluzione fisiologica 0,9% normale. Il dosaggio per mouse può essere inferiore a quello dei ratti.
    2. Su una superficie di plastica adatta in una cappa aspirante, fissare gli arti del mouse lontano dal corpo (nastro adesivo è efficace) una volta che il mouse non risponde a una presa per la sua pelle del piede.
    3. Tagliare la pelle del mouse sopra il petto e poi il torace osso per esporre il cuore con una forbice.
    4. Utilizzando una pompa peristaltica, con un ago 25 G collegato a the estremità del tubo, inserire l'ago nel ventricolo sinistro del cuore, snip l'atrio destro per creare un punto di uscita per il sangue e quindi avviare il lavaggio con 40 ml 0,9% soluzione fisiologica una velocità di circa 10 ml / min.
    5. Al termine, profumato il mouse con 35 ml di ghiaccio soluzione idrogel freddo.
      Nota: profumato ad una velocità di 10 ml / min per evitare gonfiore del tessuto nervoso.
    6. Incidere la pelle sul dorso con una lama e quindi rimuovere i muscoli vicino al vertebrati. Dopo il taglio archi vertebrali da un lato e facendoli ruotare verso l'altro lato, prendere il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una multa forbice.
  3. Cancellazione del cavo del mouse spinale
    1. Posizionare il midollo spinale in 15 ml di soluzione di idrogel notte a 4 ° C.
    2. Rimuovere 10 ml della soluzione di idrogel e versare il resto della soluzione con i segmenti del midollo spinale in una provetta 5 ml. Riempire il tubo 5 ml con la soluzione di idrogel fino a quando non è completamente pieno.
    3. Stretch un piccolo pezzo di parafilm sopra la parte superiore del tubo 5 ml e poi avvolgere parafilm intorno al collo del tubo. Nota: Assicurarsi che i contatti parafilm la soluzione idrogel e non vi siano bolle tra la soluzione idrogel e il parafilm.
    4. Inserire il tubo 5 ml a 37   ° C forno durante la notte. Osservare la soluzione idrogel fino a farla diventare un gel.
    5. Prendere il tubo 5 ml dal forno e rimuovere il gel dal tubo con una chiave (come un shoveled 1 ml puntale). Rimuovere il gel dal tessuto del midollo spinale da attaccare il tessuto grossolano al gel e poi prendere il tessuto grossolano di distanza (il gel si attacca al tessuto e quindi sarà rimosso dal tessuto).
    6. Dopo aver rimosso il gel dal tessuto del midollo spinale, lavare il midollo spinale 4 volte con PBS 1x (pH 7,4) per 24 ore su un agitatore.
    7. Preparare la soluzione di compensazione CUBIC sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-idrossipropil) ethylenediamine a 5.38 ml di acqua distillata.
      Nota: Un agitatore caldo viene utilizzato. Aggiungere 2,31 g di polietilene glicole mono-p-isooctylphenyl etere / Triton X-100 alla soluzione una volta che è chiaro e si raffredda a temperatura ambiente.
      Nota: 10 g di questi tre sostanze chimiche sono per un mouse.
    8. Tagliare il mouse midollo spinale coronale in segmenti lunghi 2-3 mm con una lametta e metterli in 5 ml di soluzione di compensazione CUBIC sopra. Posizionare su un agitatore in forno a 37   ° C per 3 giorni.
    9. Tre giorni dopo, cambiare la soluzione di compensazione per una nuova. Nota: la suddetta soluzione viene preparata prima dell'uso.
    10. Due o tre giorni più tardi, dopo l'aggiornamento della soluzione di compensazione CUBIC, controllare la trasparenza del tessuto contro una carta con carattere 8 lettere. Se è trasparente, le lettere sono visibili attraverso il tessuto eliminato. Rimuovere la soluzione di compensazione e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare il tessuto 4 volte al giorno (ogni 6 ore).

  1. Incubare i segmenti del midollo spinale nella soluzione di anticorpo primario (anti-serotonina, cresciuto a coniglio, diluito 1: 100 in PBST) per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °.
  2. Rimuovere la soluzione di anticorpi e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) in un forno a 37 ° C.
  3. Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario (594 coniugato capra anti-IgG di coniglio, diluito 1: 100 in PBST) incubare il tessuto per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °.
  4. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 4 ml di PBST per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) su un agitatore in forno a 37 °. Il giorno successivo il tessuto è pronto per l'imaging.

3. Imaging

  1. Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere 4 ml di 85% glicerolo per rendere l'indice di rifrazione del tessuto anche.
  2. Mettere qualche goccia di 85% glicerolo accanto al tessuto del midollo spinale e applicare il coprioggetto con un bicchiere coprioggetto 22 x 50 mm 2.
    Nota: L'orientamento del midollo spinale decide come l'immagine assomiglia.
  3. Mettere il vetrino sul telaio del microscopio a fluorescenza multi-photon tenuta e spostare il tessuto nel percorso della luce.
  4. Scegliere l'elio neon linea laser 594 nm e regolare l'intensità del laser al livello ottimale controllando la luminosità del segnale positivo nell'immagine live.
  5. Selezionare l'area di scansione del tessuto del midollo spinale con l'obiettivo 20X (in acqua, NA 0,7) e preparare per creare un z-stack, e la profondità di ogni passo impostato a 3 micron.
  6. Acquisire il tessuto dalla parte superiore alla parte inferiore del z-stack sotto la obiet 20Xtiva e quindi obiettivo 63X (in olio, NA 1.4) (dimensione del passo è stato di 1 micron), rispettivamente. Ricostruire i video 3D utilizzando un software 3D 28.

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Representative Results

Questa sezione mostra i risultati di anticorpi serotonina colorazione nel topo trasparente midollo spinale utilizzando una combinazione di chiarezza e protocolli cubi. Abbiamo dimostrato che le fibre serotoninergici sono presenti in tutti lamine del midollo spinale con una predominanza nella porzione ventrale del corno ventrale (Figura 1, vedi anche Video 1). Il tessuto di controllo non ha avuto fibre positive (risultato non è stato mostrato). Nel corno ventrale, fibre serotoninergici densamente sono presenti nella porzione ventromediale del corno ventrale e si estendono verso la porzione laterale del corno ventrale (Figura 2, vedi anche Video 2). Alcune fibre immunopositive estendono anche dal corno ventrale verso il corno dorsale o il canale centrale. fibre immunopositive sono presenti in tutti lamine del corno dorsale, ma c'è un piccolo spazio tra le fibre positivi in ​​lamina 2 e 4, soprattutto nel lateraleparte del corno dorsale. La maggior parte delle fibre serotoninergici del corno dorsale sono di piccolo diametro e solo un piccolo numero di essi sono di grande diametro (Video 1). In una sezione orizzontale, sono state osservate fibre serotoninergici densamente nel corno ventrale di viaggiare lungo l'asse longitudinale del midollo spinale e formare un fascio di fibre. La scoperta più interessante è che questo fascio di fibre emette rami regolarmente lungo l'asse longitudinale, che sono perpendicolari al fascio di fibre. Questi rami ulteriormente collateralizzare lungo i loro percorsi alla porzione laterale del corno ventrale. Rispetto a questi rami, quelli che si estendono verso la linea mediana sono irregolari e piccole (Figura 2). Sotto l'obiettivo 63X, sono state osservate le fibre serotoninergici del corno dorsale di viaggiare lungo l'asse del midollo spinale e terminare in vari punti lungo il percorso del tratto. Le fibre spesse sono sporadicamente distribuiti tra la F sottile IBERS (Figura 3, vedi anche Video 3).

Figura 1
Figura 1:. Fibre serotoninergici in una sezione coronale del cavo lombare 200X ingrandimenti sinistra è corno ventrale destro è corno dorsale, dorsale è la parte mediale del midollo spinale, e ventrale è la parte laterale del midollo spinale. La barra della scala è di 100 micron. fibre serotoninergici sono presenti in tutti lamine, soprattutto nella parte ventromediale del corno ventrale dove la densità delle fibre è alto. Queste fibre si estendono sia verso la parte laterale del corno ventrale e il canale o dorsale centrale corno. La densità di fibre in altre lamine è basso. La maggior parte delle fibre serotoninergici sono sottili. Solo un piccolo numero di fibre sono spesse e sono considerati sia nel corno dorsale e il corno ventrale (> vedi anche Video 1 (Tasto destro del mouse per scaricare)).

figura 2
Figura 2:. Fibre serotoninergici nella parte ventrale del corno ventrale a 200X di ingrandimento di sinistra e destra sono i lati laterali del midollo spinale, dorsale è la parte rostrale del midollo spinale, e ventrale è la parte caudale del midollo spinale. La barra della scala è di 100 micron. fibre serotoninergici sono mostrati viaggiando lungo l'asse longitudinale del midollo spinale e confezionati nella porzione mediale del corno ventrale dove formano un fascio di fibre di spessore. Su questo fascio, alcuni rami sono estesi a intervalli regolari verso la porzione laterale del corno ventrale, mentre altri che si estendono verso la linea mediana sono irregolari e più brevi. Queste fibre terminano in molti punti lungo il percorso del tratto ( vedi anche Video 2(Tasto destro del mouse per scaricare)).

Figura 3
Figura 3: fibre serotoninergici nel corno dorsale sotto a 630X di ingrandimento di sinistra è la parte laterale del midollo spinale, a destra è la parte mediale del midollo spinale, dorsale e ventrale, fare riferimento alla dorsale e parte ventrale del corno dorsale, rispettivamente. . La barra della scala è di 7 micron. fibre serotoninergici viaggiano lungo l'asse longitudinale del midollo spinale e terminano lungo il percorso del tratto. Queste fibre sono principalmente di piccolo diametro con un piccolo numero di fibre spesse mescolati. Queste fibre raramente si sovrappongono tra di loro ( vedi anche Video 3 (clic destro per il download) ).

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Discussion

Il protocollo descritto mostra come le fibre immagine serotoninergici nel topo midollo spinale con la chiarezza combinato e tecniche di cubi. Si introduce un processo di compensazione più veloce rispetto al protocollo di compensazione passiva sviluppato da Cheung et al. 14 e Tomer et al. 15 e permette il tessuto del midollo spinale per essere ben supportato dal idrogel durante compensazione.

Un passo importante durante la fissazione del mouse midollo spinale, come riportato da Cheung et al. 14 e Tomer et al. 15, è di mantenere tutte le soluzioni raffreddare su ghiaccio, che impedisce la polimerizzazione delle sostanze chimiche. L'altro punto critico è al perfusione il mouse lentamente con la soluzione di idrogel per evitare gonfiore del tessuto nervoso. Per la soluzione di idrogel per diventare un gel, è necessario degasaggio. In alternativa a questo, abbiamo usato parafilm per coprire la parte superiore del tubo e lasciato bolle d'aria tra la hydsoluzione Roghel e il parafilm. Questo ha funzionato molto bene e la soluzione idrogel diventato un gel dopo poche ore. Sebbene alcune bolle sono stati trovati nel gel, essi non interferiscano con i seguenti esperimenti, che è stato dimostrato per l'assenza di bolle nel tessuto del midollo spinale. La compensazione è la fase più critica, e richiede una combinazione di reagenti. La soluzione di compensazione, contenente ammino-alcool, rimuove i lipidi del tessuto del midollo spinale molto più veloce rispetto alla / soluzione compensazione SDS acido borico base utilizzato nel protocollo CHIAREZZA originale 16.

Il vantaggio della chiarezza e CUBIC rispetto alle tecniche tradizionali di immunoistochimica è che l'intero blocco tessuto può essere ripreso senza sezionare il tessuto, di conseguenza, la continuità delle fibre serotoninergici viene mantenuta, ed è possibile seguire la stessa fibra per una lunga distanza nel z-stack. Con questo vantaggio, collateralizzazione può essere tranquillamente identificato con le immagini in 3D, unND nuove conclusioni possono quindi essere fatte sulla natura dei percorsi serotoninergici. Il protocollo descritto è uno strumento utile per ricerca di sistemi in fibra, così come nuclei semplicemente etichettatura tessuto con anticorpi specifici. Questa tecnica è anche una scelta ideale per interrogare i sistemi diversi nello stesso cervello di topo mediante etichettatura doppia o tripla. Nel nostro ambiente di laboratorio, un microscopio a fluorescenza multi-photon era disponibile con una distanza di lavoro di circa 300 micron. Questo limita la nostra immagine ad un massimo di 600 micron se sono scansionati entrambi i lati del tessuto. Tuttavia, un microscopio a fluorescenza foglio leggero, può immagine tutto il cervello e il midollo spinale del mouse attraverso la loro larghezza, lunghezza e profondità. L'altro vantaggio di questa tecnica è che gli anticorpi possono essere eluiti e poi un altro anticorpo o anticorpi diversi applicati nuovo al tessuto stesso. Questo riduce l'utilizzo degli animali considerevolmente, così come i costi connessi con la preparazione di nuovo tessuto cerebraleper ogni esperimento. Per lo stesso motivo, questa tecnica può essere applicata ad altri tessuti. Ci sono già stati studi condotti su polmoni, reni, cuore, intestino, e il tessuto tumorale 26,27.

Ci sono anche limitazioni a questa tecnica, per esempio, i nuclei del rafe in romboencefalo topo contiene molti tipi di neuroni, tra neuroni GABAergici. Sebbene CLARITY e CUBIC consentiranno lo studio della distribuzione dei diversi tipi di fibre raphespinal in un singolo topo cervello e il midollo spinale. Tali neuroni, che non sono indicate specificamente dai neurotrasmettitori o marcatori proteici, non possono essere identificati in questa impostazione. Un'alternativa è quella di etichettare i neuroni specifici o sistemi in fibra con sonde di acido nucleico come nella ibridazione in situ. Questo è, invece, limitato dal sistema di etichettatura e filtri disponibili per l'imaging fluorescente. Imaging tutte le fibre raphespinal resta dunque una sfida.Se queste tecniche sono stati combinati con una iniezione intracranica di un tracciante anterogrado (come Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), potrebbe essere possibile vedere fibre serotoninergici, fibre GABAergici, e altri.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution Bio Rad 161-0140 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution Bio Rad 161-0142 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde Sigma 158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea Merck Millipore 66612 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100 Merck Millipore 648462 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose Sigma S0389 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody Merck Millipore AB938 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate Life Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope Leica Leica TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

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References

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