Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Neuroscience

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Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W. P., Shyu, B. C. Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation. J. Vis. Exp. (112), e53709, doi:10.3791/53709 (2016).

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Abstract

Kathodaler transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) induziert unterdrückende Wirkung auf arzneimittelresistente Anfälle. Um eine effektive Durchführung von Aktionen, die Stimulationsparameter (zB Orientierung, Feldstärke und Stimulationsdauer) müssen bei Mäusen Hirnschnittpräparaten untersucht werden. Prüfung und die Ausrichtung der Elektrode relativ zu der Position der Mäuse brain slice Anordnung sind denkbar. Das vorliegende Verfahren bewahrt den thalamocingulate Weg die Wirkung von DCS auf anterioren cingulären Kortex anfallsähnliche Aktivitäten zu bewerten. Die Ergebnisse der Mehrkanal-Array-Aufnahmen zeigten, daß die kathodische DCS deutlich die Amplitude der Stimulation hervorgerufenen Reaktionen und die Dauer von 4-Aminopyridin und Bicucullin induzierten anfallsähnliche Aktivität verringert. Diese Studie fand auch, dass die kathodische DCS Anwendungen bei 15 min Langzeit-Depression im thalamocingulate Weg verursacht. Die vorliegende Studie untersucht die Auswirkungen von DCS auf thalamocingulate synaptische Plastizität und akuten Anfall-ähnliche Aktivitäten. Das derzeitige Verfahren können testen , um die optimalen Stimulationsparameter einschließlich Ausrichtung, Feldstärke und Stimulationsdauer in einem in - vitro - Maus - Modell. Außerdem kann das Verfahren die Auswirkungen von DCS auf kortikalen anfallsähnliche Aktivitäten sowohl auf zellulärer und Netzwerkebenen bewerten.

Protocol

Die Verfahren, die Tier Themen betreffen wurden von der Institutional Animal Care and Utilization Committee, Academia Sinica, Taipei, Taiwan genehmigt.

1. Vorbereiten Experimental-Lösung und Ausrüstung für die Multielektrodenarray Recording

  1. Vorbereitung künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 25 mM NaHCO 3 und 10 mM Glucose, mit 95% O 2 und 5% CO 2).
  2. Verwenden Sie zwei Arten von MEA-Sonden: 6 x 10 planaren MEA und 8 x 8 MEA. Die ehemalige Sonde umfasst die Region, die den Cortex, Striatum und Thalamus umfasst. Letztere Sonde deckt nur den kortikalen Bereich.
  3. Verwenden Sie ein 60-Kanal-Verstärker mit einem Bandpassfilter-Set zwischen 0,1 Hz und 3 kHz bei 1200 Verstärkung. Erwerben von Daten mit einer 10 kHz Abtastrate.
  4. Legen Sie zwei AgCl-beschichteten Silberdrähte in der MEA Kammer für DCS. Verwenden Sie die AgCl-beschichteten Silberdrähte elektrische Felder zu erzeugen, die durch einen isolierten Stimulator erzeugt werden.
  5. Legen Sie eine Wolframelektrode (Durchmesser, 127 & mgr; m, Länge, 7,62 cm; 8 ° AC verjüngte Spitze, Widerstand, 5 M & Omega;) für Thalamus-Stimulation, und legen Sie die Referenzelektrode in der MEA Kammer. Liefern die Ströme der Wolframelektrode einen isolierten Stimulator verwenden, die von einem Impulsgenerator gesteuert wird.

2. Hirnschnitt Vorbereitung

  1. Verwenden männliche C57BL / 6J-Mäuse, 4-8 Wochen alt. Haus die Tiere in einem klimatisierten Raum (21-23 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit, 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, um 8:00 Uhr leuchtet auf) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
  2. Nehmen Sie einen 250-ml-Aliquot des aCSF, die in Schritt 1.1, und legen Sie sie in ein Becherglas, das Eis enthält, hergestellt. Zugleich liefern kontinuierliche Gas , das 2 von 95% O 2 und 5% CO zusammengesetzt ist.
  3. Chirurgie
    1. Anesthetize das Tier mit 4% Isofluran in einem Glasfür ca. 3 min Feld. Sobald das Tier eine chirurgische Narkosetiefe erreicht (durch das Fehlen einer Antwort auf Zehe Prise angegeben), legen Sie es auf eine flache Schale, die mit zerstoßenem Eis gefüllt ist, und entfernen Sie den Kopf einer Schere.
    2. Expose den Schädel, und schneiden Sie die verbleibenden Muskel ab. Als nächstes mit rongeurs, ziehen Sie die dorsale Oberfläche des Schädels aus dem Gehirn entfernt. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit rongeurs. Sterilisieren alle der chirurgischen Instrumente mit einer 75% igen Ethanollösung.
    3. Mit einem Spatel, schneiden Sie die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns, und das Gehirn zu entfernen. Nach Enthauptung, Transfer schnell das Gehirn in ein Becherglas mit eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte aCSF gefüllt.
  4. Herstellung von Medial Thalamus (MT) -ACC Gehirn in Scheiben schneiden
    Hinweis: Bereiten Scheiben, die den Weg von der MT zu ACC - 13 enthalten.
    1. Hand schneiden das Gehirn Block mit zwei sagittale Schnitte 2,0 mm bis zur Mittellinie in jeder Hemisphäre lateraldie subcortical Anatomie anzuzeigen. Dann machen Sie zwei Winkelschnitte. Sprechen Sie die erste Querschnitt parallel zur sichtbaren Faser-Darm-Trakt im Striatum.
    2. Machen Sie das zweite Kreuzschnitt von der Verbindung zwischen dem Cerebellum und visuellen Kortex auf den Mittelpunkt zwischen dem vorderen Kommissur und Sehbahn, die dem thalamocingulate Weg ventralen und parallel sind.
    3. Bringen Sie das Gehirn Block auf eine Winkelplatte (~ 120 °) mit Cyanacrylatkleber, und einen Schnitt machen knapp über dem Wendepunkt des Weges. Klappen Sie die Platte, glätten sie und kleben Sie es auf die Kammer Stufe eines Vibratom.
    4. Machen Sie medialen Thalamus-ACC Hirnschnitten (500 & mgr; m dick) und tauchen sie dann in eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte aCSF.Transfer Scheiben auf die Aufzeichnungskammer, und halten bei 32 ° C unter kontinuierlicher Perfusion (12 ml / min) mit Sauerstoff angereicherten aCSF für 1 h.

3. Herstellung von Perfusionskammer für Multielektrodenarray Recording

  1. Vorbereitungvon Perfusionskammer
    1. Legen Sie eine MEA-Sonde auf einem Mehrkanalsystem, und verwenden zwei separate Polyethylenröhrchen der Sonde an eine peristaltische Pumpe zu verbinden. Verwenden einen Röhre die aCSF in die MEA Kammer und dem anderen Rohr zu führen den aCSF aus der Kammer zu führen. Schließlich kontinuierlich die Zubereitung mit warm (29-30 ° C) oxygeniert aCSF (8 ml / min) perfundiert.
  2. Übertragen Hirnschnitt zu MEA. Halten Sie das Gehirn in Scheiben schneiden auf der MEA nach unten einen feuchten Wattestäbchen. bewegen Sie vorsichtig das Gehirn in Scheiben schneiden die ACC orientiert über den Elektroden zu gewährleisten.
  3. Verwenden Kits Scheibe Anker und Hold-downs das Gehirn Scheibe zu drücken. Dieser Schritt gewährleistet eine gute elektrische Verbindung zwischen der Scheibe und Elektroden.

4. Erzeugung von elektrischen Feldern durch DCS

Anmerkung: Die Definition des elektrischen Feldes Orientierung wurde auf der Grundlage der Richtung der axodendritic Achse in der ACC. Die Orientierungen von Dendriten und soma Abteile warenmit Golgi - Färbung bestätigt 12.

  1. Platzieren Sie die AgCl-Elektrode (definiert als die Anode) proximal des ACC und legen die andere Elektrode (definiert als die Kathode) distal der ACC. Aufzeichnung der Feldstärke, die durch die beiden Feldausrichtungen (parallel und senkrecht zu den ACC axodendritic Fasern) durch die MEA und liefern die Ströme der elektrischen Felder mit einem Stimulator erzeugt wird.
  2. Befestigen Sie den Abstand der AgCl-Elektroden (ca. 1,5-2 cm) und stellen Sie die Stromstärke des Stimulators die DCS zwischen 0,5 und 2 mA zu machen.

5. elektrisch induzierte Cortical synaptischen Antworten

Hinweis: Induzieren synaptischen Reaktionen im ACC durch elektrische Stimulation in dem MT, in dem ein programmierbarer elektrischer Reizgenerator Rechteck zweiphasige Stromimpulse erzeugt.

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 3 oben.
  2. Legen Sie eine Wolframelektrode im MT und liefern Impulse von dem Stimulator zur thalamic Bereich der Scheiben über bipolaren Wolframelektroden.
  3. Verwenden Sie verschiedene Stromstärken, die Schwelle zu bestimmen, die ein ACC Antwort auslöst. Hier verwenden eine Intensität von ± 150 & mgr; A und die Dauer von 200 & mgr; s, die eine 80% ige maximale Reaktion in der ACC in den meisten Scheiben hervorgerufen.
  4. Bewegen Sie die Wolframelektrode entlang der thalamocingulate Weg (von MT zu Corpus callosum) in der MT-ACC Scheibe, die optimalen Reaktionsprofile zu erhalten.
  5. Machen 10-20 Sweeps von ACC-Antworten, und verwenden Sie die Software im Durchschnitt automatisch alle von der ACC durch MT Stimulation hervorgerufen. Das Ergebnis iss die synaptischen Antworten in ACC induziert von MT-Stimulation durch MT-ACC-Weg.

6. elektrisch induzierte krampfanfallähnliche

Anmerkung: Seizure-ähnliche Aktivität wurde induziert durch die Anwendung von 4-Aminopyridin (4-AP; 250 uM) und Bicucullin (5 uM). Zurück Zeit-Kontroll-Studien zeigten, dass die maximale und stabile Antworten erschienen2-3 Stunden nach der Medikamentenapplikation 14.

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 5 oben.
  2. Hinzufügen Medikamente zur Perfusionslösung. Verwenden Sie 4-AP (250 & mgr; M) und Bicucullin (5 uM). Mischen Sie die Medikamente gleichmäßig, und weiter Perfusion für 2-3 Std.
  3. Um anfallsartige Aktivität zu erleichtern, halten die Transfusionspumpe mit einer relativ schnellen Durchblutungsrate (8 ml / min), die auch dazu beitragen, den Aufbau eines pH-Gradienten zu verhindern.
  4. Legen Sie eine Wolframelektrode in der MT und liefern elektrische Stimulation (150 uA, 200 & mgr; s Dauer) ACC Antwortprofile erhalten.
  5. Machen 10-20 Sweeps und der Mittelwert der Antworten.
  6. Ersetzen Sie die Perfusionslösung mit frischen aCSF, um die Drogen auszuwaschen. Wiederholen Sie Schritt 6.5.

7. Prüfung Wirkung von DCS auf evozierte kortikale Antworten

  1. Wiederholen Sie die Abschnitte 3 und 4. sicherstellen, dass einheitliche elektrische Felder erzeugt durch Ströme zwischen zwei parallelen AgCl-beschichteten Silberdrähten vorbei, die innerhalb des M platziertEA Kammer. Wenn es keine Probleme gibt, bleibt das DCS zwischen 0,5 und 2 mA.
  2. Schalten Sie das DCS, und legen Sie eine Wolframelektrode den Thalamus (± 150 & mgr; A, 200 & mgr; s Dauer) zu stimulieren. Zur Erzielung maximaler synaptischen Antworten im ACC, machen 10-20 fegt und die Antworten im Durchschnitt.
  3. Gleichzeitig schalten Sie die DCS (2 mV / mm DCS Stärke) und Thalamus-Stimulation (350 uA, 200 & mgr; s Dauer). Bewerten Sie die Änderungen der Amplitude des Thalamus-Stimulation-evozierte ACC Reaktion während DCS.
  4. Schalten Sie das DCS, und fügen Sie 4-AP (250 & mgr; M) und Bicucullin (5 uM) zur Perfusionslösung. Dann 2-3 Stunden warten. Wenn die Medikamente das Gehirn in Scheiben schneiden beeinflussen, erzeugt die Scheibe kortikalen Anfalls Antworten.
  5. Machen 10-20 Sweeps von ACC-Antworten, und messen dann die Amplitude und Dauer des elektrischen evozierten kortikalen Anfalls Antworten.
  6. Nach dem Schritt 7.5, schalten gleichzeitig auf dem DCS (2 mV / mm DCS Stärke) und Thalamus-Stimulation (150 uA, 200 duratiauf & mgr; s). Bewerten Sie Änderungen in der Amplitude und Dauer der evozierten kortikalen Anfalls Reaktionen während DCS-Anwendung.
  7. Ersetzen Sie die Perfusionslösung mit frischen aCSF die Drogen zu waschen, und wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3.
  8. Sammle alle der Aufzeichnungsdaten, und der Gruppe, die Daten in den verschiedenen Versuchsbedingungen. Bewerten Sie die Amplitude und Dauer der kortikalen Anfalls Antworten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

8. Datenanalyse

  1. Verwenden Sie Software (zB MC - Rack - Software) , um automatisch die aufgezeichneten Antworten im Durchschnitt, und exportieren Sie die Rohdaten in eine Tabelle. Analysieren Sie die Amplitude und Dauer der Rohdaten und Farbzahlen generieren.
  2. Um Schwingungsanfallsereignisse erfassen, verwenden Software den Ausgangswert und Standardabweichungen (SD) zu messen. Set 3 SD des Rauschpegels als Schwellenwert. Amplituden der Spitzen während einer Schwingungs Ereignis, das diese Schwelle übertreffen werden automatisch erkennen,ed.
  3. Führen Sie die statistische Analyse unter Verwendung von Student-t - Test.
  4. Express - Messungen und eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) Ergebnisse im Text als Mittelwert ± SE, wobei n die Anzahl der Scheiben anzeigt , untersucht 12.

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Representative Results

Vorbereitung der Thalamocingulate Scheibe und MEA Recording System-Setup

Die MT-ACC slice von Mäusen ist eine spezielle Scheibe Zubereitung , die Erforschung der elektrophysiologischen Eigenschaften des thalamocingulate Wegs ermöglicht. 1A zeigt die Art und Weise , in der die MT-ACC Scheibe hergestellt. Das Gehirn der Maus wurde schnell entfernt und hielt in kühlen , sauerstoffreiches aCSF (1A, a, b). Zu subkortikalen Anatomie zeigen, wurde das Gehirn geschnitten 2,0 mm lateral von der Mittellinie in jeder Hemisphäre sagittal brain Blöcke (1A, c, d) zu erwerben. Zwei abgewinkelte ventral Schnitte wurden in den Gehirnblöcken die thalamocingulate Weg zu halten. Die erste Kreuzschnitt in der Vorderseite des Gehirns Blocks gemacht wurde, parallel zu der sichtbaren Fasertrakts im Striatum. Der zweite Querschnitt wurde an der Rückseite des Gehirns Block von der Verbindungs ​​Wetteschen den Cerebellum und visual cortex auf den Mittelpunkt zwischen der vorderen Kommissur und Tractus opticus. Nachdem die Einschnitte gemacht wurden, wurde das Gehirn Block auf einem abgewinkelten Kunststoffplatte (120 ° Winkel) geklebt, und ein Schnitt auf der dorsalen Seite direkt durch den Kortex (1A, eg) wurde hergestellt. Das Gehirn Blockplatte wurde auf eine Vibratom geklebt und in kühlen mit Sauerstoff angereicherte aCSF getaucht. Schließlich ein paar Scheiben (500 & mgr; m dick) wurden aus dem Gehirn Block entnommen und in mit Sauerstoff angereicherte aCSF (1A, h, i) inkubiert.

1B zeigt die Aufzeichnungssystem Setup MEA. Die schematische Darstellung zeigt die Perfusion und MEA-Systeme zu einem Aufzeichnungs Computer angeschlossen ist. Eine leere MEA-Sonde wurde im Verstärker angeordnet und Perfusion begann bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml / min. Die MT-ACC brain slice wurde auf der MEA Sonde angeordnet, während sichergestellt wird, dass der Aufzeichnungsbereich zu der Mitte so nahe wie möglich war. Ein Stimulator war Gebrauchd das Gehirn in Scheiben schneiden zu stimulieren und das elektrische Feld erzeugen. Nachdem alle Schritte abgeschlossen wurden, erfasst das System die elektrophysiologischen Eigenschaften des thalamocingulate Weg.

1C zeigt den Aufzeichnungsbereich - Diagramm und die Art und Weise , in der die MT-ACC brain slice auf der MEA Sonde getätigt. 1C-a zeigt das Aussehen der MEA - Sonde. Die schwarze Linie (roter Pfeil) auf der Sonde half der Benutzer die richtige Richtung der Sonde innerhalb des Verstärkers zu bestimmen. 1C-b die Hauptschaltung der MEA - Sonde zeigt. 1C-c die elektrische Anordnung zeigt, die auf dem überlagert wurde Rindengewebe.

Testing evozierte Potentiale

Zur Erhaltung des thalamocingulate Bahn im Schnittpräparat bestätigen, diese Studie angeregt dieThalamus und in der ACC in den elektrophysiologischen Experimenten aufgezeichnet. Nur Scheiben mit postsynaptischen Potentials im ACC , während eine kleine Menge an Strom in der MT in dem Experiment verwendet wurden , liefert. 2A zeigt die Positionen der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden und typische thalamischen Stimulation hervorgerufenen Reaktionen in der ACC. Um anfallsartige Aktivität, 4-AP (250 & mgr; M) und Bicucullin (5 uM) induzieren wurden verwendet, um epileptische Aktivität induzieren. Typische 4-AP mit Bicucullin-induzierte spontane anfallsartige Aktivität wurde von einem ictal Beginn zusammengesetzt, gefolgt von einer Tonika Phase und langer Dauer. Die Spuren wurden Vergrßerung in 2B gewählt. Diese Studie versucht, auch nach Induktion Arzneimittel-induzierte Anfälle Stimulation in der MT zu liefern. 4-Aminopyridine / Bicucullin-evozierte epileptiforme Aktivität wurde nach elektrischer Stimulation (2C) induziert.

TestenAusrichtung der DCS und Scheibe

Früheren klinischen Studien zeigten , dass die Ausrichtung des elektrischen Feldes der kathoden DCS wirkt thalamischen Stimulation hervorgerufene Aktivität. 3A zeigt die verschiedenen Orientierungen des elektrischen Feldes, die parallel oder senkrecht zur Orientierung der Dendriten und Soma Kompartimente in der ACC angeordnet wurde. Wenn das elektrische Feld parallel zu neuronalen Zellen angeordnet wurde, unterdrückt die kathodische Stimulation thalamischen Stimulation hervorgerufenen Reaktionen im medialen Teil des ACC (3B, oberes Feld). Wenn das elektrische Feld senkrecht zu neuronalen Zellen angeordnet wurde, wurden keine signifikanten Auswirkungen auf den Thalamus Stimulation hervorgerufenen Reaktionen beobachtet (3B, unteres Bild). Parallel kathodische DCS unterdrückt auch 4-AP- und Bicucullin-induzierte anfallsartige Aktivität im medialen Teil des ACC (3C, oberes Feld).Es verkürzt die Dauer der Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und keine signifikante Wirkung von senkrecht kathodische DCS beobachtet wurde (3C, unteres Bild). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Ausrichtung des elektrischen Feldes bei der Regulierung der synaptischen Übertragung im thalamocingulate Stoffwechselweg wichtig war.

Wirkung von DCS auf Anfallsaktivität

Die klinische Anwendung der transkraniellen Magnetstimulation, tDCS und DCS bietet eine nicht-invasive Ansatz für die Behandlung von arzneimittelresistenten Anfällen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Feldstimulation synaptische Plastizität und beeinflusst epileptische Aktivität in verschiedenen Hirnregionen moduliert. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die kathodische tDCS thalamocingulate synaptischen Übertragung gedrückt. Die Amplitude der Stimulation hervorgerufenen Reaktionen und die Dauer der anfallsartige Aktivität gedrückt wurden (9 von 11 Scheiben, 81.82% ist ;ure 4A, linkes Feld). 4A (rechts) zeigt , dass 15 min kathodaler DCS effektiv Langzeitdepression (LTD) in der MT-ACC - Weg und deprimiert hervorgerufenen Reaktionen (N = 11, p <0,05) induziert. Abbildung 4B (linkes Bild) zeigt , dass Thalamus Stimulation robust anfallsartige Aktivität im Cingulum hervorgerufen. Dreißig Minuten nach 15 min kathodische DCS-Anwendung, die Dauer der Thalamus-Stimulation evozierte anfallsartige Aktivität verkürzt wurde. Die Ergebnisse zeigten auch , dass die Anfallsdauer deutlich wurde nach 15 min kathodische DCS sank im Vergleich ohne DCS - Anwendung (N = 9, p <0,05; 4B, rechts).

Abbildung 1
Abb . 1: Die Herstellung des Thalamocingulate Scheibe und MEA - Recording - System Setup (A) MT-ACC Stück proverfahren (a) Entfernen Sie das Gehirn und (b) Transfer mit Sauerstoff angereicherte aCSF zu kühlen. (C) Machen Sie zwei parasagittal Schnitte von der Mittellinie. (D) Seitenansicht des medialen Teil des Gehirns blockieren. (E) Machen Sie zwei abgewinkelte ventralen Schnitte des Gehirns blockieren. (F) Kleben Sie das Gehirn Block auf einer abgewinkelten Kunststoffplatte. (G) Stellen Sie eine dorsale Schnitt und entfalten das Gehirn blockieren. (H) Kleben Sie das Gehirn Block in einem Vibratom. (I) sammeln Scheiben aus dem Gehirn blockieren. (B) MEA Aufzeichnungssystem - Setup. (C) MEA Aufzeichnungsbereich. (A) MEA - Sonde. (B) MEA - Schaltung. (C) Die ACC des Gehirns Scheibe wurde über den Elektrodensonden orientiert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

e = "1"> Figur 2
Abbildung 2: Unterschiedliche evozierte Potentiale zu Thalamic Stimulation und Arzneimittel-induzierte Stimulation (A) Thalamic Stimulation hervorgerufenen Reaktionen im ACC.. (B) 4-Aminopyridine- und Bicucullin-induzierte anfallsartige Aktivität. (C) Thalamic Stimulations- und medikamenteninduzierten anfallsartige Aktivität. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Fig . 3: Wirkung verschiedener Orientierungen von DCS (A) verschiedene Orientierungen des elektrischen Feldes. (B) Thalamic Stimulation hervorgerufenen Reaktionen mit DCS. (C) Wirkung der kathodische DCS auf die Anfalls-ähnliche Aktivität.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53709/53709fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Wirkung kathodaler tDCS auf Anfallsaktivität (A) Fünfzehn min kathodische DCS-induzierte LTD und depressiv evozierte Aktivität.. (B) Das Auftreten von anfallsartige Aktivität verringerte sich die kathodische Stimulation. Die Unterdrückung der anfallsartige Aktivität von 15 min kathodische DCS ausgehalten , auch wenn die Anwendung von DCS beendet wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In der vorliegenden Studie wurden die Effekte der Dauer und der Orientierung von DCS auf ACC anfallsähnliche Aktivität wurden getestet. Um eine stabile Daten in mouse brain slices erhalten, wie die Integrität des MT-ACC-Weg zu halten und eine Beschädigung zu vermeiden, ist es Schlüssel, insbesondere die Schritte, in denen zwei abgewinkelte ventralen Einschnitte und eine dorsale Schnitt des Kortex hergestellt sind. Darüber hinaus kann die Zeit, um die Hirnschnitt herzustellen auch die Aktivität des Gehirns slice beeinflussen, was die kürzeste Zeit sein sollte, möglich, das Gehirn frisch und stark zu halten. Eine frühere Studie zeigte , dass elektrochemische Schädigung Zielgewebe in einem in vivo - Herstellung 15 auftreten können. Ein in vitro brain slice Präparat kann verwendet werden , um dieses Problem zu vermeiden. In einem in vitro - Präparat, wird das Gewebe nicht direkt den Elektrodenkontakt, wodurch elektrochemische Effekte 16 zu minimieren. Die Wirkungen von DCS wurden mit Elektroden verglichen, die in verschiedenen Richtungen orientiert waren. Wenn die electrodes wurden bei 90 ° und 270 ° orientiert sind , DCS nicht evozierte Aktivität nicht beeinträchtigte (Abbildung 3). Somit ausgeschlossen Diese kontrollierte Experiment die Möglichkeit von Nebenwirkungen von elektrochemischen Reaktionen auf DCS, die das Gewebe in unserer Studie beschädigt. Die Schutz Recovery-Methode der Gehirnscheiben ist ein weiterer Schlüssel; die aCSF Formel in dieser Studie liefert an die Schutzschneidverfahren eine alternative und zur Konservierung von Neuronen in Hirnschnitten von 4 bis 8 Wochen alte Tiere sehr effektiv. Das Verfahren ist nicht für die Verwendung mit Tieren aller Altersklassen konzipiert; die Verwendung von Tris aCSF erscheint in jungen Mäusen wirksam wie die Verwendung der Schutz NMDG Rückgewinnungsverfahren in Mäusen im Alter von 6 Wochen alt ist. Daher sollten Anwender halten die relative Alter Äquivalenzen zwischen den Arten im Auge für das Experiment die beste Methode zu wählen.

Verwendung einer MEA brain slices aufzuzeichnen eine übliche Technik ist, aber ein elektrisches Feld mit einer MEA Aufzeichnungs sys Kombinierentem ist im Allgemeinen nicht durchgeführt. in leitenden Lösung des MEA-Aufzeichnungssystem ein Gleichstromfeld Affecting ist ein interessanter Ansatz, vor allem für einen Zeitraum von vielen Sekunden bis Minuten. Eine frühere Studie zeigte , dass DCS Anwendung in der aCSF Lösung nicht den pH ändern, was darauf hinweist , dass der pH der leitfähigen Lösung in dieser Versuchsanordnung 12 stabil war. Eine relativ schnelle Perfusionsrate (8 ml / min) aufrechterhalten wurde anfallsähnliche Aktivität und alle Produkte der chemischen Veränderung in der MEA-Sonde wurden ausgewaschen durch die Perfusion zu erleichtern, wodurch der Aufbau eines pH-Gradienten zu vermeiden. Multielektrodenarray-Recording-Technologie wird durch die Art von Hirnschnitten und Bereich der Aufzeichnungselektrode oft begrenzt. Die Art der Hirnschnitt bestimmt, welche Schaltungsweges wird aufgezeichnet, und der Bereich der Aufzeichnungselektrode bestimmt, ob einzelne oder mehrere Hirnkerne aufgezeichnet. Diese Bedingungen müssen vor dem Experiment bestätigt werden.

Vor iV Studien zeigten , dass die langfristigen Wirkungen der DCS 17 durch die Modulation der synaptischen Übertragung auftreten. In der vorliegenden Studie führte die kathodische DCS LTD in der MT-ACC-Weg. Die LTD oder Depotenzierung Pfändungen bezogenen Potenzierung wurde vorgeschlagen, einen Teil des zugrunde liegenden Mechanismus der Anfallsunterdrückung zu sein, dass die Erhöhung des Ergebnisses der tDCS Behandlung darauf hindeutet, kann möglich sein. Es wurde jedoch keine veröffentlichte Studie über die Feldstärke an der cingulären Cortex konzentriert. Die tiefe Lage des cingulären Cortex im medialen Teil des Kortex ist schwierig zu testen. Zum Beispiel ist es unvermeidbar, dass der Stromfluss die Gewebe und Gefäße beeinträchtigen können, die näher an der Oberfläche sind. Die Schwierigkeit der Ausrichtung tiefe Gewebe durch tDCS kann die Anwendung von tDCS für in - vivo - Studie begrenzen. Deshalb zu verstehen, wie DCS neuronalen Aktivitäten beeinträchtigt, sollte eine Hirnschnitt-Herstellung verwendet werden, da unspezifische Effekte vaskulärer müssen ausgeschlossen werden.

jove_content "> Für die Zwecke eines experimentellen Modells zur Gründung wird das beschriebene Anfall in einem gesunden Gehirn induziert. Die anfallsartigen Aktivitäten weiterhin durch einen elektrischen Impuls induziert wurden. Der Zeitpunkt des Auftretens Anfall präzise gesteuert werden könnte, wenn die DCS angewendet wurde wenn der zugrunde liegende Mechanismus der tDCS. die Ergebnisse für tDCS Behandlung mehr Informationen zur Verfügung stellen kann. Ein weiteres bemerkenswertes Ergebnis der langanhaltende Veränderungen der regionalen kortikalen Erregbarkeit war, die durch tDCS induziert wurden. in Zukunft kann aufgeklärt werden, dann ist die Kombination von DCS und pharmakologische Therapie LTD bei der Behandlung von Epilepsie zu verbessern kann eine sehr interessante Entwicklung.

Abschließend wurde eine Methodik zur Untersuchung der Auswirkungen von DCS auf thalamocingulate und transkallosale synaptische Plastizität und akute Anfälle vorgesehen. Die langfristigen Auswirkungen von DCS auf anfallsartige Aktivität in unserem Gehirn in Scheiben schneiden Vorbereitung erfolgte durch eine LTD-ähnlichen Mechanismus.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Name Company Catalog Number Comments
aCSF (total:1 L):
D(+)-Glucose MERCK 1.08337.1000 10 mM
Sodium hydrogen carbonate MERCK 1.06329.0500 25 mM
Sodium chloride MERCK 1.06404.1000 124 mM
(+)-Sodium L-ascorbate, >=98% SIGMA A4034-100G 0.15 g/2 c.c
Magnesium sulfate, anhydrous, ReagentPlus SIGMA M7506-500G 2 mM
Calcium chloride dihydrate MERCK 1.02382.1000 2 mM
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate MERCK 1.06346.1000 1 mM
Potassium chloride May & Baker LTD Dagenham England MS 7616 4.4 mM
Name Company Catalog Number Comments
Drugs:
(+)-Bicuculline TOCRIS 0130 5 µM in aCSF
4-Aminopyridine TOCRIS 0940 250 µM in aCSF
Name Company Catalog Number Comments
Brain slice Preparation:
Vibratome Vibratome Series 1000 Block slicing into 500 µm thick slices
Name Company Catalog Number Comments
MEA system:
Multielectrode array (MEA) probes: 6 x 10 planar MEA Multi Channel Systems 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10 electrode diameter, 30 µm; electrode spacing, 500 µm; impedance, 50 kΩ at 200 Hz
Multielectrode array (MEA) probes: 8 x 8 MEA  Ayanda Biosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8 pyramidal-shaped electrode; diameter, 40 µm; tip height, 50 µm; electrode spacing, 200 µm; impedance, 1,000 kΩ at 200 Hz
A 60-channel amplifier was used with a band-pass filter set between 0.1 Hz and 3 KHz at 1,200X amplification Multi-Channel Systems MEA-1060-BC
MC Rack software at a 10 KHz sampling rate Multi-Channel Systems Software for data collect and recordings
control of a pulse generator Multi-Channel Systems STG 1002
slice anchor kits and hold-downs Warner Instruments SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltic Pump-minipuls3 Gilsom MINIPULS3 perfusion rate : 8 ml/min
Name Company Catalog Number Comments
Stimulation system:
Isolated stimulator A-M Systems Model 2100 intensity of ±350 μA , duration of 200 μsec
Tungsten electrode A-M Systems 575300 placed in thalamus

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References

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