एक चुंबकीय Microbead आड़ मॉडल चूहे में नेत्र उच्च रक्तचाप पर निर्भर ग्लूकोमा प्रेरित करने के लिए

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Medicine
 

Summary

यहाँ, हम murine आँख है कि रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के नुकसान में परिणाम के रूप में मनाया मोतियाबिंद में आंख का उच्च रक्तचाप प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। चुंबकीय microbeads पूर्वकाल कक्ष में इंजेक्शन और जलीय हास्य का बहिर्वाह ब्लॉक करने के लिए एक चुंबक का उपयोग iridocorneal कोण करने के लिए आकर्षित कर रहे हैं।

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Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).

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Abstract

मोतियाबिंद के कृंतक मॉडल के उपयोग के आणविक तंत्र है कि इस multifactorial neurodegenerative रोग के pathophysiology आबाद समझने के लिए आवश्यक हो गया है। कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के आगमन के साथ, वहाँ आंख का उच्च रक्तचाप के inducible murine मॉडल में बढ़ती रुचि है। यहाँ, हम एक Facetted उठाव के साथ एक संशोधित Microneedle का उपयोग कर चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन आंख के पूर्वकाल कक्ष में मोतियाबिंद के आधार पर की एक रोड़ा मॉडल प्रस्तुत करते हैं। चुंबकीय microbeads iridocorneal कोण पूर्वकाल कक्ष से जलीय हास्य की जल निकासी ब्लॉक करने के लिए एक हाथ में चुंबक का उपयोग करने के लिए आकर्षित कर रहे हैं। intraocular दबाव है, जो बाद में, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के नुकसान की ओर जाता है के रूप में मानव मोतियाबिंद रोगियों में मनाया की एक सतत ऊंचाई में जलीय गतिशीलता परिणामों में यह व्यवधान। microbead रोड़ा इस पांडुलिपि में प्रस्तुत मॉडल मोतियाबिंद के अन्य inducible मॉडल और भी अत्यधिक की तुलना में है सरलप्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ प्रस्तुत संशोधनों के आम मुद्दों है कि अक्सर रोड़ा मॉडल में उत्पन्न होती हैं कम से कम। सबसे पहले, एक bevelled कांच Microneedle का उपयोग microbeads की backflow रोकता है और यह सुनिश्चित करता है कि कम से कम नुकसान इंजेक्शन के दौरान कॉर्निया के लिए होता है, इस प्रकार की चोट से संबंधित प्रभाव को कम करने। दूसरा, चुंबकीय microbeads के उपयोग की क्षमता iridocorneal कोण करने के लिए सबसे मोतियों को आकर्षित करने के लिए प्रभावी ढंग से पूर्वकाल कक्ष अन्य संरचनाओं के साथ संपर्क से बचने में तैर मोती (उदा।, आईरिस, लेंस) की संख्या को कम करता है। अन्त में, एक हाथ में चुंबक का उपयोग करें जब कुशलता चुंबकीय microbeads प्रत्यक्ष और यह सुनिश्चित आंख से microbeads के छोटे भाटा है कि जब Microneedle वापस ले लिया है करने के लिए छोटे माउस आंख से निपटने लचीलापन देता है। सारांश में, microbead रोड़ा माउस यहाँ प्रस्तुत मॉडल neurodegenerative परिवर्तन है कि शुरुआत और Glau की प्रगति के दौरान होने अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली खोजी उपकरण हैकोमा।

Introduction

ग्लूकोमा एक प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय चकाचौंध शर्त यह है कि 2020 1 द्वारा दुनिया भर में एक अनुमान के अनुसार 80 लाख लोगों को प्रभावित करेगा। मोतियाबिंद रोगियों में, दृष्टि हानि रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs), उत्पादन न्यूरॉन्स कि से दृश्य जानकारी प्रेषित की चयनात्मक मौत के कारण होता है मस्तिष्क के लिए रेटिना। ग्लूकोमा एक उम्र से संबंधित कई जोखिम कारकों के साथ neurodegenerative रोग जिनमें से सबसे आम बुलंद intraocular दबाव (आईओपी) है। मोतियाबिंद और वर्तमान उपचार आंख दबाव के प्रबंधन पर पूरी तरह ध्यान केंद्रित में दरअसल, IOP केवल परिवर्तनीय जोखिम कारक है। हालांकि, कई आनुवंशिक सेलुलर, और पर्यावरणीय कारकों शुरुआत है और इस रोग की प्रगति को प्रभावित करते हैं। इसलिए, विभिन्न तंत्रों कि अंततः neuronal मौत के लिए योगदान को समझने के मोतियाबिंद के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए आवश्यक है।

मोतियाबिंद के पशु मॉडल रोग pathophysiology अध्ययन करने के लिए और पहचान और परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैंहोनहार चिकित्सा विज्ञान। सशर्त पीटकर तनाव और चूहों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट ट्रेसर ले जाने सहित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की बढ़ती उपलब्धता inducible murine मोतियाबिंद मॉडल के लिए जरूरत प्रेरित किया है। मोतियाबिंद के कई कृंतक मॉडल वर्ष (2,3 में समीक्षा) में विकसित किया गया है। इन मॉडलों में से कई में, मोतियाबिंद जलीय हास्य गतिशीलता में खलल न डालें, IOP की पदोन्नति में जिसके परिणामस्वरूप से प्रेरित है। रोड़ा मॉडल, जिसमें microbeads या अन्य पदार्थ आंख के पूर्वकाल कक्ष में इंजेक्शन हैं जलीय जल निकासी ब्लॉक करने के लिए, आंशिक रूप से IOP 4-14 बढ़ाने के लिए उनके रिश्तेदार आसानी के कारण हाल के वर्षों में लोकप्रियता हासिल की है।

मोतियाबिंद के microbead रोड़ा मॉडल, पहली प्राइमेट 12 में किए गए, खरगोशों 8, और चूहों 4,9,11, हाल ही में चूहों 5,6,10 में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। इन अध्ययनों में, polystyrene microbeads की intracameral इंजेक्शन, अकेले या मेंएक viscoelastic सामग्री के साथ संयोजन, बाद में RGC मौत 6,10 करने के लिए अग्रणी IOP पदोन्नति में हुई। हालांकि, भाटा जब सुई आंख और iridocorneal कोण से microbeads की dislodging से वापस ले लिया है आम समस्या है कि प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं। इन कमियों को कम से कम करने के लिए, मैग्नेट आंख 4,9 के iridocorneal कोण करने के लिए चुंबकीय microbeads आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों 9,10 चुंबकीय microbeads और एक हाथ में चुंबक माउस आंख के लिए अनुकूलित (चित्रा 1) का उपयोग करता है के आधार पर एक संशोधित प्रक्रिया है। कई महत्वपूर्ण संशोधनों हमारे प्रोटोकॉल में पेश किया गया है चूहों में प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य IOP वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए। सबसे पहले, microbeads के इंजेक्शन एक Facetted उठाव के साथ एक सावधानी से तैयार कांच Microneedle का उपयोग किया जाता है। Microneedle के परिणामस्वरूप चिकनी सतहों के साथ ही इसकी तेज टिप सुनिश्चित करता है कि कम से कम नुकसान हैप्रवृत्त के रूप में यह कॉर्निया punctures। इस गिलास Microneedle का उपयोग भी बढ़ा नियंत्रण में परिणाम है जब microneedle टिप पूर्वकाल कक्ष में प्रवेश करती है, जिससे इस तरह के आईरिस और लेंस के रूप में हानिकारक पास संरचनाओं के जोखिम को कम करने। इसके अलावा, छोटे इंजेक्शन घाव कार्निया स्वयं की मरम्मत की सुविधा और अवांछित चोट से संबंधित प्रभाव कम कर देता है।

दूसरा, चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन और एक हाथ में चुंबक के उपयोग के सटीक नियंत्रण छोटे माउस आंखों में iridocorneal कोण करने के लिए मोती आकर्षित करने के लिए अनुमति देते हैं। चुंबकीय microbeads कि क्योंकि इस microbead आकार तैयार Microneedle उद्घाटन रोकना नहीं था और महत्वपूर्ण बात, एक बार इंजेक्शन व्यास में 4.5 माइक्रोन का इस्तेमाल किया गया है, इन microbeads प्रभावी ढंग से जलीय हास्य की जल निकासी अवरुद्ध। यह दृष्टिकोण न केवल इंजेक्शन microbeads की भाटा कम कर देता है, लेकिन यह भी सुनिश्चित करता है कि microbeads की अधिकतम संख्या लक्षित क्षेत्र में जम जाता है को प्रभावी ढंग से जलीय हास्य जल निकासी ब्लॉक करने के लिए। furthermore, इस रणनीति भी पूर्वकाल कक्ष ऐसे आईरिस और लेंस, और पीछे कक्ष को रोकने के पारित होने के रूप में अन्य संरचनाओं, साथ संपर्क से बचने में तैर मोतियों की संख्या कम कर देता है। सामूहिक रूप से, इन संशोधनों सुनिश्चित करना है कि microbead इंजेक्शन सर्जरी रिश्तेदार आसानी से और एक समय पर ढंग से चूहों में आंख का उच्च रक्तचाप के एक अत्यधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रभावी और निरंतर प्रेरण, जिसके परिणामस्वरूप में किया जाता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रक्रिया प्रायोगिक पशुओं के उपयोग और पशु की दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन से नेत्र में उपयोग और दृश्य अनुसंधान के लिए वक्तव्य के लिए पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया था।

पूर्वकाल Intracameral इंजेक्शन के लिए Microneedle की 1. तैयारी

  1. एक खींचने के साथ, एक borosilicate ग्लास केशिका से एक Microneedle उत्पन्न
  2. एक माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से microneedle की नोक पर एक खोलने बनाने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप उद्घाटन लगभग 190 माइक्रोन और 70 माइक्रोन की एक बड़ी और छोटी अक्ष व्यास के साथ एक अंडाकार आकृति, क्रमशः होनी चाहिए। एक शासक माइक्रोस्कोप छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा का ठहराव के द्वारा पीछा के अंतर्गत रखा के साथ पहली बार प्राप्त छवियों द्वारा तैयार Microneedle उद्घाटन के क्षेत्र को मापने।
  3. micropipette bevelling प्रणाली में, एक 20 degre पर Microneedle जगहbevelling थाली करने के लिए ई कोण रिश्तेदार इतना है कि Microneedle उद्घाटन प्लेट को छू रहा है। बेवल के लिए किनारों तक लगभग 10 मिनट के फ्लैट और चिकनी कर रहे हैं। आसुत जल की कुछ बूँदें प्रक्रिया में सहायता करने के लिए जोड़ें।
  4. Microneedle घुमाएँ उद्घाटन आसपास जब तक टिप तेज है दो किनारों के उठाव के लिए।
  5. स्वच्छ सभी मलबे और microneedle टिप खोलने एक एयरोसोल डस्टर का उपयोग करने से पानी।
  6. ध्यान से एक खुर्दबीन के नीचे समाप्त Microneedle जांच करते हैं। भंग के साथ त्यागें microneedles सर्जरी के दौरान Microneedle तोड़ने के जोखिम को कम करने के लिए।
  7. इथेनॉल के साथ पहले rinsing, तो बाँझ संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) के साथ द्वारा Microneedle जीवाणुरहित।

2. चुंबकीय Microbead समाधान की तैयारी

नोट: चुंबकीय इस अध्ययन में इस्तेमाल microbeads epoxy समूहों के साथ लेपित हैं। इस तरह के मोतियों की clumping और अवांछित आणविक बातचीत के रूप में किसी भी प्रतिकूल प्रभाव को रोकने के लिए, इन समूहों epoxy चाहिएपहले इंजेक्शन सर्जरी के साथ आगे बढ़ने से पहले microbeads से हटा दिया जाना।

  1. चुंबकीय मोतियों से epoxy समूहों का हटाया
    1. एक 10x Tris बफर में 0.02 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH, मेगावाट 39.997 जी / मोल) का समाधान (मेगावाट 121.14 जी / मोल) तैयार करें।
    2. धीरे चुंबकीय microbead समाधान का जायजा भंवर (4.5 मीटर व्यास, 4 एक्स 10 8 मोती / एमएल) जब तक मोती समान रूप से समाधान में निलंबित कर दिया है।
    3. जल्दी 10x Tris बफर में 0.02 एम NaOH के 50 मिलीलीटर में चुंबकीय मनका समाधान के 1 मिलीलीटर pipet।
    4. आरटी पर 24 घंटे के लिए बारी बारी से मोतियों से epoxy समूहों को दूर करने के लिए।
    5. ट्यूब के नीचे करने के लिए एक चुंबक हासिल करने से मोती ले लीजिए। ट्यूब क्षैतिज ओरिएंट सुनिश्चित करें कि सभी मोती चुंबक को आकर्षित कर रहे हैं। आरटी पर एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए घुमाएँ।
    6. एक micropipette के साथ, ध्यान से मोतियों की गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    7. धीरे 10x टी के 50 मिलीलीटर में गोली भंवरआरआईएस तक मोती अच्छी तरह से निलंबित कर दिया है बफर।
    8. दोहराएँ 2.1.6 के लिए 2.1.4 कदम।
  2. एकाग्रता और बाँझ बैलेंस्ड नमक के घोल में चुंबकीय microbeads का मेजबान

नोट: यह आवश्यक है बाँझ संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) में चुंबकीय मनका समाधान का जायजा ध्यान केंद्रित करने के लिए 1.6 x 10 6 मोती / μl के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए इतना है कि 2.4 x 10 6 मोती एक में पूर्वकाल कक्ष में इंजेक्शन जा सकता 1.5 μl, जो छोटे माउस आंख के लिए उपयुक्त है की अंतिम मात्रा।

  1. धीरे 2 मिनट के लिए vortexing द्वारा अति शुद्ध प्रयोगशाला ग्रेड पानी के 5 मिलीलीटर में मोती धो लें।
  2. उन्हें एक चुंबक के साथ ट्यूब के नीचे करने के लिए आकर्षित करने के द्वारा मोती ले लीजिए।
  3. एक micropipette के साथ, ध्यान से मोतियों की गोली परेशान बिना पानी निकाल दें।
  4. दोहराएँ 2.2.1 2.2.3 के लिए तीन और बार दोहराएँ।
  5. एक लामिना का प्रवाह हुड में, pipettin द्वारा बीएसएस के 500 μl के साथ मोती धोनेऊपर और नीचे जी। एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत इस खंड में बचे हुए चरणों को पूरा करें।
  6. उन्हें एक चुंबक के साथ ट्यूब के नीचे करने के लिए आकर्षित करने के द्वारा मोती ले लीजिए।
  7. एक micropipette के साथ, ध्यान से मोतियों की गोली परेशान बिना बीएसएस को हटा दें।
  8. दोहराएँ 2.2.5 2.2.7 के लिए तीन और बार दोहराएँ।
  9. मोती ऊपर और बीएसएस के 250 μl में नीचे pipetting द्वारा Resuspend।
  10. सुनिश्चित करें कि मनका समाधान अच्छी तरह से homogenized है। फिर, जल्दी से बाँझ 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन के 25 μl विभाज्य। शेयर मनका समाधान के अंतिम एकाग्रता 1.6 x 10 6 मोती / μl है।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. नेत्र उच्च रक्तचाप की प्रेरण

नोट: धारा 3 एक दो व्यक्ति ऑपरेशन है। घटना है कि एक विशेष कार्रवाई एक विशिष्ट व्यक्ति के द्वारा प्रदर्शन किया जा रहा है, उचित व्यक्ति की पहचान की है। सामान्य तौर पर, 1 व्यक्ति खुर्दबीन के नीचे माउस संभालती है जबकि व्यक्ति 2 r हैmicrosyringe पंप से छेड़छाड़ के लिए esponsible। शल्य प्रक्रिया की कुल अवधि 10 मिनट से कम होना चाहिए (3.17 करने के लिए 3.9 कदम)।

  1. वयस्क C57BL / 6 चूहों में प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। भोजन और पानी यथेच्छ के उपयोग के साथ एक मानक वातावरण में सदन चूहों। इस पत्र में, उम्र के 3 और 4.5 महीने के बीच महिला C57BL / 6 चूहों का उपयोग करें। हालांकि, इस प्रोटोकॉल पुरुषों और अलग अलग उम्र के चूहों, साथ ही अन्य माउस उपभेदों, ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों सहित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
  2. जाग चूहों संज्ञाहरण और microbead इंजेक्शन से पहले में आधारभूत IOP उपाय के एक calibrated पलटाव टनमीटर का उपयोग कर। कॉर्निया पर proparacaine हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद लागू करें।
    1. धीरे कान के बीच त्वचा धारण करके माउस को नियंत्रित। benchtop पर माउस इतनी जगह है कि पशु आरामदायक है और आंखों के लिए पहुंच रहे हैं। कार्निया सतह पर सीधा टनमीटर पकड़ो और एक प्राप्त करने के लिए आंख प्रति लगातार दस रीडिंग के कम से कम तीन सेट लेIOP औसत। जाग चूहों में IOP के मापने IOP पर संज्ञाहरण से संबंधित प्रभाव बायपास करने के लिए पसंद किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, IOP 3.4 कदम के बाद anesthetised चूहों में मापा जा सकता है।
  3. एक शेयर माउस कॉकटेल संज्ञाहरण 20 मिलीग्राम / एमएल ketamine, 2 मिलीग्राम / एमएल xylazine, और 0.4 मिलीग्राम / एमएल acepromazine से बना मिश्रण तैयार करें।
  4. कॉकटेल मिश्रण (शरीर के वजन के 1 μl / छ) की intraperitoneal प्रशासन द्वारा माउस में संज्ञाहरण प्रेरित। एक इंजेक्शन संवेदनाहारी कॉकटेल के उपयोग के गैस anesthetics भर में पसंद किया जाता है (उदाहरण के लिए, isoflurane) जब माउस सिर से निपटने के रूप में पशु एक साँस लेना नकाब से जुड़ा नहीं है, क्योंकि यह लचीलापन देता है। इसके अलावा, अब वसूली एक इंजेक्शन संवेदनाहारी के साथ आवश्यक अवधि कि microbeads पूर्वकाल कक्ष में वापस dislodging बिना iridocorneal कोण पर बसा है।
  5. प्रति buprenorphine subcutaneously के शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम 0.05 मिलीग्राम प्रशासन।
  6. एक tropicamide ey साथ आंख का इलाजई छात्र फैलाव प्रेरित करने के लिए छोड़ देते हैं। murine पूर्वकाल कक्ष के छोटे आकार के कारण, पुतली आसानी से इंजेक्शन के दौरान स्थिति और Microneedle की उन्नति कल्पना करने के लिए फैली हुई किया जाना चाहिए।
  7. contralateral आंख (संयुक्त राष्ट्र संचालित) पर सामयिक मरहम लागू प्रक्रिया के दौरान कॉर्निया के सूखने से बचने के लिए।
  8. microsyringe पंप के इंजेक्शन विधानसभा के लिए एक साफ Microneedle संलग्न। पशु पार संक्रमण से बचने के लिए हर ऑपरेशन के बाद Microneedle बदलें।
  9. 1 व्यक्ति: ऑपरेटिंग मंच को anesthetised माउस स्थानांतरण। माइक्रोस्कोप के तहत, यह सुनिश्चित करें कि पुतली पूरी तरह फैली हुई है और नेत्र की मांसपेशियों को आराम कर रहे हैं कि वहां न तो कोई आंख आंदोलन है। आँख आंदोलनों के अभाव इंजेक्शन के दौरान स्थिरता सुनिश्चित करता है। धीरे आंख शोषक swabs का उपयोग करने से tropicamide आंख बूंद पोंछे।
  10. व्यक्ति 2: ऊपर और नीचे pipetting द्वारा चुंबकीय microbead समाधान मिश्रण।
  11. microsyringe पंप का प्रयोग, तुरंत माइकर लोडoneedle homogenized चुंबकीय microbead समाधान (2.4 x 10 6 मोती) के 1.5 μl के साथ (खंड 1 में तैयार)। सुनिश्चित करें कि हवा के बुलबुले Microneedle की नोक पर अनुपस्थित रहे हैं। बाद Microneedle भरी हुई है, बाहर ले जाने के लिए इतना है कि चुंबकीय microbead समाधान के लिए एक सजातीय निलंबन में रहता है के रूप में जल्दी संभव के रूप में 3.12 3.13 करने के लिए कदम।
  12. एक 45 डिग्री के कोण पर लोड Microneedle, किनारी के पूर्व रिश्तेदार रखा स्थिति। 1 व्यक्ति: आंख प्लास्टिक संदंश का उपयोग कर समर्थन करते हैं। सुनिश्चित करें कि Microneedle और प्लास्टिक संदंश के बीच कोण लगभग 90 डिग्री है।
  13. व्यक्ति 2: लोड microneedle के साथ, धीरे कॉर्निया पंचर इतना है कि Microneedle की नोक पूर्वकाल कक्ष में प्रवेश करती है। सुनिश्चित करें कि लोड Microneedle पंचर दौरान किनारी के लिए एक 45 डिग्री के कोण रिश्तेदार पर बनी हुई है। लेंस या आईरिस के साथ किसी भी संपर्क से बचें। सुनिश्चित करें कि Microneedle पीछे कक्ष में प्रवेश नहीं करता। 1 व्यक्ति: आंख का समर्थन करना जारीप्लास्टिक संदंश का उपयोग।
  14. 1 व्यक्ति: माउस सिर चलती के बिना, आंख के बगल में चुंबक जगह है, विपरीत microneedle टिप करने के लिए, पूर्वकाल कक्ष में चुंबकीय मोतियों को आकर्षित करने और कॉर्निया की भीतरी सतह के साथ मोती के संपर्क कम से कम। व्यक्ति 2: microsyringe पंप का प्रयोग, पूर्वकाल कक्ष में चुंबकीय मनका समाधान के 1.5 μl इंजेक्षन। microbead समाधान 15 से 30 सेकंड की अवधि में इंजेक्ट किया जाता है। 1 व्यक्ति: इंजेक्शन की पूरी अवधि के दौरान microneedle टिप करने के लिए चुंबक विपरीत पकड़ जारी है।
  15. व्यक्ति 2: एक बार मोतियों की पूरी मात्रा इंजेक्ट किया गया है, धीरे-धीरे आंख से Microneedle वापस ले लें। 1 व्यक्ति: microbeads की भाटा से बचने के लिए, एक अतिरिक्त 30 से 60 सेकंड के लिए आंख के बगल में चुंबक धारण करके पूर्वकाल कक्ष की ओर चुंबकीय मोतियों को आकर्षित करने के लिए जारी है।
  16. 1 व्यक्ति: चुंबक का उपयोग करना, iridocorneal कोण करने के लिए मोती आकर्षित करती हैं। सुनिश्चित करें कि मोती एक समान रूप से वितरित अंगूठी फार्मपूर्वकाल कक्ष की परिधि के आसपास। इस कदम के दौरान, कॉर्निया के लिए मोती को आकर्षित करने के रूप में वे संपर्क पर कॉर्निया की भीतरी सतह के लिए छड़ी करने के लिए एक प्रवृत्ति है से बचें।
  17. एक एंटीबायोटिक आंख की गिरावट के साथ संचालित आंख के इलाज के संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए।
  18. माउस पूरी तरह से जाग (~ 3 से 4 घंटा) जब तक एक गर्मी पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दें। माउस इतनी जगह है कि संचालित आंख के ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ रहा है। इस स्थिति गुरुत्वाकर्षण शक्ति से कॉर्निया की भीतरी सतह के लिए इंजेक्शन मोतियों का संचय नहीं कर पाएगा। इसके अलावा, इस स्थिति के संक्रमण के रूप में संचालित आंख किसी भी बिस्तर और / या अन्य सामग्री है कि पिंजरे में मौजूद हो सकता है के साथ संपर्क में नहीं होगा के लिए क्षमता में कमी होगी। घटना है कि एक जानवर संकट का कोई संकेत नहीं दिखाता में, buprenorphine की अतिरिक्त खुराक के रूप में की जरूरत है प्रशासन।
  19. चूहों IOP माप लेने से पहले कम से कम 2 दिन के लिए प्रक्रिया से उबरने के लिए अनुमति दें। IOP उपाय 3.2 में वर्णित है। मोनीटो IOP कम से कम सप्ताह में एक बार या अधिक बार, के रूप में की जरूरत है, और दिन के एक ही समय में circadian संबंधी उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए।
  20. IOP माप के लिए, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में संचालित माउस से contralateral आंख का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, अक्षत, गैर संचालित या दिखावा संचालित चूहों के रूप में भोले नियंत्रण से माप का उपयोग करें।

4. रेटिना का आकलन नाड़ीग्रन्थि सेल सोमा और एक्जॉन जीवन रक्षा

  1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) तुरंत ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) के बाद की intracardial इंजेक्शन द्वारा नेत्र उच्च रक्तचाप के अधीन चूहों छिड़कना।
  2. 4.1 में वर्णित के रूप में बरकरार, गैर संचालित चूहों छिड़कना और उन्हें रिहाई नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल करते हैं। संचालित चूहों से contralateral आंखों के उपयोग RGC अस्तित्व का आकलन करने के लिए है क्योंकि चोट के बाद contralateral आँखों में परिवर्तन 15,16 सूचित किया गया है और डेटा की व्याख्या उलझाना कर सकते हैं सिफारिश नहीं है। वैकल्पिक रूप से, उपयोग दिखावा संचालित आँखों 1 के साथ इंजेक्शननियंत्रण के रूप में बीएसएस की .5 μl।
  3. microscissors का प्रयोग, ध्यान थैली से अलग करने के लिए आंख के आसपास संयोजी ऊतक काटा। ऑप्टिक तंत्रिका सिर के स्तर पर इसे काटने से आँख से ऑप्टिक तंत्रिका अलग करें।
  4. एक 30 जी सुई का प्रयोग, आंख में लगानेवाला समाधान के प्रवेश की अनुमति देने के कॉर्निया में एक छेद बना। 4% पीएफए ​​में आंख की जगह और अतिरिक्त निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. (मेगावाट: 214 जी / मोल) एक समाधान 2% पीएफए ​​और 0.1 एम सोडियम cacodylate में 2.5% glutaraldehyde युक्त ऑप्टिक तंत्रिका की जगह और अतिरिक्त निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।

5. पर RGC सोमा घनत्व की मात्रा फ्लैट पर चढ़कर Retinas

नोट:। निम्नलिखित प्रक्रिया द्वारा नडाल-Nicolas एट अल 17 एक प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और रेटिना फ्लैट आरोह के मस्तिष्क के विशिष्ट homeobox / POU डोमेन प्रोटीन 3 ए (Brn3a) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग RGCs की मात्रा का ठहराव की रूपरेखा। वैकल्पिक मेथलेबलिंग RGCs के लिए ओडीएस भी कई splicing (RBPMS) या Fluorogold या DiI साथ प्रतिगामी लेबलिंग के साथ शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ immunohistochemistry सहित इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, पूरे किनारी के साथ एक चीरा बनाने तक कॉर्निया आसानी से खिसकाते द्वारा आंख के पूर्वकाल हिस्से को हटा दें। कॉर्निया और लेंस निकालें। ध्यान ओरा सेराटा और ऑप्टिक तंत्रिका के साथ कटौती करने से आंख से रेटिना अलग।
  2. ऑप्टिक तंत्रिका स्पष्ट रूप से चार रेटिना quadrants चित्रित करने की दिशा में रेटिना की परिधि से समान दूरी पर चार छोटे चीरों बनाने के द्वारा एक रेटिना फ्लैट माउंट तैयार करें। एक छोटा सा ब्रश का प्रयोग, धीरे रेटिना से किसी भी शेष शीशे को हटा दें। जितना संभव हो उतना शीशे हास्य को हटाने के लिए एक साफ और मजबूत प्रतिरक्षाऊतकरसायन संकेत प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. ध्यान से एक 48 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 युक्त थाली करने के लिए रेटिना हस्तांतरण इतना है कि रेटिना हैमुक्त अस्थायी। यकीन नाड़ीग्रन्थि सेल परत ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
  4. -70 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति की थाली 15 मिनट के लिए रखें। रेटिना, आगे Permeabilize पीबीएस में ताजा 2% ट्राइटन X-100 में दो बार धोने से विगलन के बाद।
  5. 0.5 माइक्रोग्राम / पीबीएस युक्त 2% ट्राइटन X-100 और 2% सामान्य गधा सीरम के साथ मिलीलीटर - 0.3 Brn3a एंटीबॉडी पतला। धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर झटकों हे / एन द्वारा Brn3a प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में रेटिना सेते हैं। रेटिना पूरी तरह से हर समय समाधान के 150 से 200 μl में डूब जाना चाहिए।
  6. 2 माइक्रोग्राम / पीबीएस युक्त 2% ट्राइटन X-100 के साथ मिलीलीटर के लिए गधा विरोधी बकरी आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और कोमल झटकों के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए इस समाधान में रेटिना सेते हैं। रेटिना पूरी तरह से हर समय एंटीबॉडी समाधान में डूब जाना चाहिए। photobleaching को रोकने के लिए बचे हुए चरणों के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संस्कृति की थाली को कवर किया।
  7. एक ब्रश का प्रयोग, ध्यान एक स्लाइड करने के लिए रेटिना हस्तांतरण इतना है कि ऊतक स्थिति के रूप में के रूप में फ्लैट झूठअसंभव। 10 मिनट के लिए शुष्क हवा। विरोधी फीका बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट।
  8. जांच करना एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे रेटिना फ्लैट आरोह। रेटिना चतुर्थ भाग प्रति तीन गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में Brn3a सकारात्मक RGCs की संख्या यों के रूप में वर्णित किया है। 18

ऑप्टिक तंत्रिका पार वर्गों पर RGC axons की मात्रा 6.

  1. 4.5 कदम से ऑप्टिक तंत्रिका लीजिए और (Oso 4, 254.23 मेगावाट जी / मोल) 2 घंटे के लिए 2% आज़मियम tetroxide में सेते हैं।
    सावधानी: अपने उच्च विषाक्तता के कारण, आज़मियम tetroxide उचित प्रयोगशाला पोशाक के साथ एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  2. 15 मिनट प्रत्येक के लिए बढ़ती इथेनॉल की सांद्रता (50%, 70%, 90%, 95%, और 100%) में डुबो कर ऑप्टिक तंत्रिका निर्जलीकरण।
  3. निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग epoxy राल तैयार: 15.72 मिलीलीटर ट्वीट-812, succinic एनहाइड्राइड dodecenyl 6.45 मिलीलीटर, 7.83 मिलीग्राम nadic मिथाइल एनहाइड्राइड, 0.45 मिलीग्राम DMP-30।
  4. क्रमिक रूप से बना समाधान में ऑप्टिक तंत्रिका सेते0: 1, 1: 1, 0.75: 0.25 और 1: प्रोपलीन आक्साइड को epoxy राल के निम्नलिखित अनुपात (मेगावाट 58.08 जी / मोल) 0। ऑप्टिक तंत्रिका एक हे / एन अवधि के लिए आरटी पर प्रत्येक समाधान में incubated है।
  5. एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए 100% epoxy राल (6.4 से अंतिम चरण) 60 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड में ऑप्टिक नसों को सेते हैं।
  6. एक microtome का उपयोग करते हुए अर्ध-पतली ऑप्टिक तंत्रिका पार वर्गों (0.75 माइक्रोन) उत्पन्न करता है।
  7. 1% toluidine नीले रंग के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पार वर्गों दाग।
  8. वर्णित 19 के रूप में प्रत्येक ऑप्टिक तंत्रिका खंड के पांच गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में RGC एक्सोन यों।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित वयस्क चूहों के पूर्वकाल कक्ष में चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन IOP के एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ऊंचाई में हुई। एक सप्ताह प्रक्रिया के बाद, IOP 10 ± 0.6 मिमी पारा (मतलब ± SEM), contralateral आँखों में औसत आधारभूत IOP से, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त आँखों में वृद्धि हुई 19 के लिए ± 0.5 मिमी पारा (छात्र टी -Test; *** पी <0.001, एन = 12, 1 टेबल, चित्रा 2)। IOP उसके बाद स्थिर हो और कम से कम 6 सप्ताह के सबसे लंबे समय तक समय बिंदु इस अध्ययन में जांच के लिए 20 मिमी पारा की औसत से ऊंचा बने रहे। औसत शिखर सर्जरी के बाद 2, 3, और 6 सप्ताह में microbead इंजेक्शन आँखों में IOP 25 मिमी पारा था। इलाज चूहों के विशाल बहुमत के निरंतर उच्च IOP विकसित की है, इसलिए इस प्रोटोकॉल microbeads का एक दूसरा इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है।

इस मॉडल में RGC नुकसान का आकलन करने के लिए समय पाठ्यक्रम, RGC सोमा थेपहले Brn3a, एक RGC विशिष्ट मार्कर 17 के साथ immunostaining द्वारा मात्रा। Brn3a पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या आंख का उच्च रक्तचाप के शामिल होने के बाद 1, 2, 3 और 6 सप्ताह में फ्लैट मुहिम शुरू की रेटिना पर मात्रा निर्धारित किया गया था। हालांकि एक महत्वपूर्ण IOP ऊंचाई के रूप में जल्दी के रूप में 1 सप्ताह microbead इंजेक्शन के बाद पता चला था, RGC सोमा का कोई महत्वपूर्ण घटाने की प्रक्रिया (चित्रा 3) के पहले 2 हफ्तों के भीतर मनाया गया। पर्याप्त RGC मौत (22%), तथापि, 3 सप्ताह में स्पष्ट किया गया था (2430 ± 67 RGCs / 2 मिमी, मतलब ± SEM, N = 12) और 6 सप्ताह (2,350 ± 74 RGCs / 2 मिमी, एन = 10) पोस्ट आंख का उच्च रक्तचाप की प्रेरण, संयुक्त राष्ट्र संचालित चूहों (3,141 ± 49 RGCs / 2 मिमी, एन = 23) (एनोवा, पी <0.001) से बरकरार नियंत्रण आँखों की तुलना में।

रोग और RGC axons की अध: पतन मोतियाबिंद का एक प्रमुख विशेषता है। इसलिए, axonal नुकसान से microbead इंजेक्शन के बाद 3 और 6 सप्ताह में जांच की गई थीऑप्टिक तंत्रिका पार वर्गों toluidine नीला (चित्रा 4) के साथ दाग में RGC axons की मात्रा का ठहराव। RGC एक्सोन का एक बड़ा नुकसान (25%) 3 सप्ताह में मनाया गया (28,401 ± 702 एक्सोन / तंत्रिका, SEM ± मतलब है, एन = 5) और 6 सप्ताह (29,426 ± 948 एक्सोन / तंत्रिका, एन = 6) microbeads के इंजेक्शन के बाद संयुक्त राष्ट्र के संचालित आंखों से बरकरार ऑप्टिक नसों की तुलना में (39,467 ± 137 एक्सोन / तंत्रिका, एन = 4) (एनोवा, पी <0.001)। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों कि माउस पूर्वकाल कक्ष में चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए होता है और IOP ऊंचाई कि RGC सोमा और अक्षतंतु अध: पतन में परिणाम निरंतर प्रदर्शित करता है।

OHT सर्जरी के बाद का समय एन मतलब IOP (एमएमएचजी) ± SEM पीक IOP (एमएमएचजी)
contralateral आंख का रोग डिfference contralateral आंख का रोग
1 सप्ताह 12 10 ± 0.4 19 ± 0.5 9 ± 0.6 12 ± 0.4 22 ± 0.6
2 सप्ताह 13 11 ± 0.5 20 ± 0.8 9 ± 0.5 12 ± 0.9 25 ± 0.7
3 सप्ताह 10 11 ± 0.8 20 ± 0.7 10 ± 0.9 13 ± 0.2 25 ± 0.9
6 सप्ताह 12 12 ± 0.5 20 ± 0.6 9 ± 0.7 13 ± 0.5 24 ± 0.6

Murine चुंबकीय Microbead Occlusi में intraocular दबाव की तालिका 1 ऊंचाईमॉडल पर। जाग मादा में C57 बीएल / 6 चूहों, IOP एक calibrated पलटाव टनमीटर का उपयोग कर मापा गया था। संचालित आंखों के एक सप्ताह के बाद सर्जरी में पता चला IOP में वृद्धि हुई है कि प्रक्रिया के बाद कम से कम छह सप्ताह के लिए ऊंचा बना रहा दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1. कदम ग्लूकोमा की murine चुंबकीय Microbead आड़ मॉडल में शामिल कार्यप्रवाह। कदम-दर-कदम सभी के दौरान, पहले प्रदर्शन प्रक्रियाओं की रूपरेखा, और सर्जरी के बाद। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
Murine चुंबकीय Microbead आड़ मॉडल में intraocular दबाव में चित्रा 2. बढ़ाएँ। जाग मेंमहिला C57 बीएल / 6 चूहों, IOP एक calibrated पलटाव टनमीटर का उपयोग कर मापा गया था। microbead इंजेक्शन आँखों के IOPS काफी एक सप्ताह के बाद सर्जरी (एनोवा, पी <0.001) पर उठाया गया। IOPS काफी कम से कम 6 सप्ताह (एनोवा, पी <0.001) के लिए इंजेक्शन चूहों के contralateral आंख के सापेक्ष बुलंद रहे। (बरकरार: N = 12; 1 सप्ताह: N = 12, 2 सप्ताह: N = 13, 3 सप्ताह: N = 10, 6 सप्ताह: N = 12)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Murine चुंबकीय Microbead आड़ मॉडल। RGCs में रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल मौत microbead इंजेक्शन के बाद बरकरार नियंत्रण रेटिना (ए) और 3 और 6 सप्ताह में glaucomatous रेटिना में Brn3a का उपयोग कर फ्लैट पर चढ़कर रेटिना के immunostaining द्वारा कल्पना थे प्रेरित करने के लिएआंख का उच्च रक्तचाप (OHT) (बी, सी)। स्केल सलाखों: 20 माइक्रोन। (डी) मात्रात्मक विश्लेषण की पुष्टि की है कि microbead इंजेक्शन प्रक्रिया आंखों पर नियंत्रण की तुलना में बाद 3 और 6 सप्ताह में महत्वपूर्ण RGC सोमा नुकसान हुआ। अक्षत, गैर glaucomatous C57 / BL6 चूहों में RGC सोमा का घनत्व संदर्भ (सफेद सलाखों, 100% अस्तित्व) के रूप में दिखाया गया है। = 6 n, 2 सप्ताह: एन = 6, 3 सप्ताह: N = 12, 6 सप्ताह: N = 10, एनोवा, *** पी <;: मूल्यों SEM (बरकरार ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं 1 सप्ताह N = 23 0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Murine चुंबकीय Microbead आड़ मॉडल। RGC एक्सोन में axonal अध: पतन में toluidine नीले रंग के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पार वर्गों के धुंधला द्वारा कल्पना थेmicrobead इंजेक्शन के बाद 3 और 6 सप्ताह में बरकरार नियंत्रण (ए) और glaucomatous रेटिना आंख का उच्च रक्तचाप (OHT) (बी, सी) प्रेरित करने के लिए। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन। (डी) मात्रात्मक विश्लेषण की पुष्टि की है कि microbead इंजेक्शन प्रक्रिया आंखों पर नियंत्रण की तुलना में बाद 3 और 6 सप्ताह में महत्वपूर्ण RGC अक्षतंतु नुकसान हुआ। अक्षत, गैर glaucomatous C57 / BL6 चूहों में RGC एक्सोन के घनत्व संदर्भ (सफेद सलाखों, 100% अस्तित्व) के रूप में दिखाया गया है। मान ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं (बरकरार: N = 4; 3 सप्ताह: N = 5, 6 सप्ताह: N = 6, एनोवा, *** पी <0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत वीडियो तकनीक कैसे चुंबकीय microbeads की intracameral इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए प्रभावी ढंग से और reproducibly चूहों में IOP ऊंचाई के लिए प्रेरित करने के बारे में विस्तृत कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करता है। निरंतर IOP वृद्धि हुई है कि अतिरिक्त इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है और नेत्र उच्च रक्तचाप induction.Elevated IOP के पहले 3 सप्ताह के भीतर detectable RGC सोमा और अक्षतंतु घटाने को बढ़ावा देता में इस प्रक्रिया का परिणाम मनुष्यों में मोतियाबिंद के विकास के लिए एक बड़ा जोखिम कारक है। इसलिए, यह एक महत्वपूर्ण murine आंख का उच्च रक्तचाप पर निर्भर मोतियाबिंद मॉडल आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए क्षमता है।

एक आम पूर्वकाल कक्ष में microbeads के इंजेक्शन के साथ जुड़े दोष यह इंजेक्शन साइट के माध्यम से भाटा मनका के लिए जब सुई वापस ले लिया है, जो अक्सर जलीय बहिर्वाह और वृद्धि की परिवर्तनशीलता का केवल आंशिक रुकावट में परिणाम से संबंधित है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, कई महत्वपूर्ण संशोधनों को लागू किया गया। एफआइआर टी, एक Facetted उठाव के साथ एक साफ, तेज कांच Microneedle से सावधान तैयारी microbeads के सफल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है। एक ठीक से तैयार Microneedle नाजुक सतह नेत्र करने के लिए दबाव के कम से कम आवेदन के साथ कॉर्निया की नियंत्रित और चिकनी प्रवेश सक्षम बनाता है। छोटे कार्निया पंचर microbeads की backflow रोकता है। इसके अलावा, ठीक Microneedle ऐसे आईरिस और लेंस के रूप में हानिकारक पास संरचनाओं, जो गैर-रोग से संबंधित सूजन में परिणाम सकता है के जोखिम को कम करता है। दूसरे, दौरान और इंजेक्शन के बाद सामरिक नेत्र क्षेत्रों के लिए एक हाथ में चुंबक के आवेदन के लिए इस तकनीक का एक और महत्वपूर्ण पहलू है। इंजेक्शन के दौरान, चुंबक जब Microneedle वापस ले लिया है microbeads के पूर्वकाल चैम्बर रोकने भाटा के चुंबकीय microbeads आकर्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, चुंबक तो जलीय हास्य बहिर्वाह ब्लॉक करने के लिए iridocorneal कोण करने के लिए microbeads निर्देशित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

तम्बू "> अक्सर microbead रोड़ा मॉडल में एक और समस्या का सामना करना पड़ा है कि दोहराया मनका इंजेक्शन अक्सर IOP ऊंचाई 10,11। यह iridocorneal कोण से साथ समय है। एक हाथ में चुंबक के संयोजन dislodging microbeads का नतीजा हो सकता है निरंतर प्राप्त करना आवश्यक हो जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है, और माउस की स्थिति के बाद operatively बहुत परिणाम में सुधार। इंजेक्शन anesthetics, जो लचीलापन प्रक्रिया के दौरान सिर ले जाने और एक लंबी पोस्ट ऑपरेटिव वसूली अवधि की आवश्यकता के लिए अनुमति का उपयोग करते हैं, के पक्ष में है। प्लेसमेंट की संचालित नेत्र शल्य चिकित्सा के बाद कुछ घंटों के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ माउस iridocorneal कोण पर microbeads के निपटारे के लिए योगदान देता है और पूर्वकाल कक्ष में वापस dislodging का खतरा कम हो जाती है।

यह सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन मोतियों की संख्या अपेक्षाकृत संगत है अंतर-पशु रूपों को कम से कम करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। चूंकि microbeads ख बसाottom ट्यूब की, यह पूरी तरह से microbead समाधान homogenize और एक समय पर ढंग से microneedle में उचित मात्रा को वापस लेने के लिए आवश्यक है। पूर्वकाल कक्ष में कम मोती इंजेक्शन जलीय हास्य जल निकासी संरचनाओं की अधूरी रुकावट है, जो गरीब या चर IOP ऊंचाई में परिणाम की संभावना है हो सकता है। ध्यान से, हालांकि microbead इंजेक्शन का परम उद्देश्य IOP तरक्की की है, सावधानी से लिया जाना चाहिए जब जाग चूहों से IOP माप पीक मूल्यों इस अध्ययन (~ 25 एमएमएचजी) की रिपोर्ट में की तुलना में अधिक है। अत्यंत उच्च IOPS इस्कीमिक नुकसान के जोखिम को बढ़ाने के लिए और भी जानवर को दर्द का कारण हो सकती है। IOP की ऊंचाई कई कारकों सर्जरी की सफलता का आकलन करने के लिए एक के रूप में माना जाना चाहिए। जैसे, प्रक्रिया के परिणाम IOP ऊंचाई, RGC सोमा मौत, और अक्षतंतु नुकसान सहित कई मापदंडों के आधार पर लगाया जाना चाहिए।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सबसे microbeads सफल परिणाम में यद्यपिLy कोण पर बसने से, इस मॉडल का एक संभावित सीमा यह है कि उन मोतियों कि पूर्वकाल कक्ष में तैरते रहते हैं कॉर्निया के माध्यम से लाइव रेटिना इमेजिंग, साथ ही electrophysiological या व्यवहार assays जो प्रकाश के प्रभावी पारित होने की आवश्यकता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए जब इस microbead रोड़ा मॉडल का उपयोग कि IOP ऊंचाई और बाद में RGC अध: पतन की हद तक उम्र और ऑपरेशन माउस [4] के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ बदलता रहता है। इसलिए, IOP ऊंचाई की हद और RGC अध: पतन के समय प्रत्येक विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस लाइन और / या आयु सीमा के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।

इस मॉडल की एक विशेषता यह है कि microbead इंजेक्शन, और महत्वपूर्ण RGC मौत के बाद पहले तीन हफ्तों के दौरान RGC मौत का क्रमिक नुकसान में ऊंचा IOP परिणाम प्रक्रिया के बाद 3 सप्ताह में पाया जाता है। इसलिए, इस मॉडल जल्दी और / या सूक्ष्म परिवर्तन है कि इस विकास में घटित की परीक्षा में सक्षम बनाता हैisease, पूर्व RGC सोमा और अक्षतंतु नुकसान प्रकट करने के लिए। RGC मौत में एक उल्लेखनीय वृद्धि 3 और 6 सप्ताह के बीच आंख का उच्च रक्तचाप के शामिल होने के बाद नहीं मनाया गया। सफल के बावजूद 25 3 और 6 सप्ताह के बीच% और इन बिंदुओं पर समय IOP ऊंचाई निरंतर - वास्तव में, RGC सोमा और अक्षतंतु नुकसान ~ 22 पर स्थिर बने रहे। निरंतर IOP की एक लंबी अवधि के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल / 6 चूहों, जो अन्य माउस उपभेदों की तुलना में अधिक RGC क्षति के लिए प्रतिरोधी हो दिखाई देते हैं C57BL में होने के अतिरिक्त RGC घटाने के लिए आवश्यक हो सकता है। 5 अतिरिक्त संशोधनों, मनका आकार का समायोजन सहित और अतिरिक्त इंजेक्शन, बाद में समय बिंदुओं पर RGC नुकसान का अध्ययन करने की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल जल्दी pathophysiological परिवर्तन है कि मामूली RGC neurodegeneration जो शुरुआत और मानव मोतियाबिंद के शुरू में प्रगति के लिए प्रासंगिक हैं के साथ संबंध स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए आदर्श है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1,000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 ml Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 ml PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25

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References

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