Name: Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e Ex Vivo Avaliação da migração celular Epicárdica derivado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a isolar células epicárdicas primárias de embriões de camundongo usando ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração celular ex vivo. Este método auxilia pesquisadores a estudar transição epitélio-mesenquima e motilidade em biologia cardíaca.

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EMS foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [número de concessão R01HL120919]; a American Heart Association [número de concessão 10SDG4350046]; Universidade de Rochester prêmio CTSA do NIH [número de concessão UL1 TR000042]; e os fundos de inicialização do Aab CVRI. MAT foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia da Med Into--Grad Iniciativa Howard Hughes Medical Institute; e um Prêmio de Serviço Institucional Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa do NIH [número de concessão GM068411].

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Recursos Animais da Universidade de Rochester. 1. epicárdica Conseqüência Cultura Ensaio (Figura 1A) <ol><li> preparativos <ol><li> Prepare 5 ml de meio A para o isolamento de células do epicárdio primária suplementando o meio 199 (M199) com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep). </li><li> Pré-aquecido meio A e 100 mL de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE) num banho de água a 37 ° C. </li><li> Permitir lâminas de câmara revestidas com colagénio a aquecer até à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionar 100 ul de meio A a cada poço da câmara de corrediça e rodar cuidadosamente para revestimento uniformemente a superfície do colagénio. Repita o procedimento para 8-12 poços. Remova a mídia depois de câmaras de revestimento. </li><li> Aliquota pré-aquecido HBSS em duas placas de 10 cm2 contendo 50 ml de cada vez de HBSS. </li></ol></li><li> Isolar embrionárias Corações de Dam gravida em 11,5 dias post coitum (DPC).30 <ol><li> Anestesiar rato com 0,5 mL de 13 mg / ml de cetamina / 0,88 mg / ml de cocktail de xilazina em 1x de Dulbecco tamponada com fosfato salino (DPBS) através de injecção intraperitoneal. Confirmar anesthetization adequada usando um teste toe pitada. Uma pitada suave é suficiente para determinar se o mouse é sensível. Qualquer movimento ou pata retirar indica que o animal não está suficientemente anestesiados para fazer a cirurgia. Eutanásia por deslocamento cervical. </li><li> Coloque o rato que enfrenta o lado ventral para cima e pulverizar o abdômen com 70% de etanol para reduzir a contaminação pelo cabelo. </li><li> Comprimir a pele com uma pinça e cortar uma incisão lateral no abdômen com uma tesoura cirúrgica. Segure a pele firmemente e puxe para além de indicações para a cabeça ea cauda de oposição. </li><li> Comprima o peritoneu com uma pinça e cortado com uma tesoura para expor a cavidade abdominal. </li><li> Remova cuidadosamente a decídua cortando ao longo da mesométrio. Transferir a decidua dissecados para pré-aquecido HBSS no primeiro10 cm 2 prato. </li><li> Separe a decídua pelo corte entre embriões. </li><li> Transferir um embrião para a segunda placa de 10 cm2 com HBSS pré-aquecido sob um microscópio de dissecação. Remova cuidadosamente o tecido e saco vitelino extraembryonic, então decapitar o embrião. </li><li> Beliscar a parede torácica com uma pinça e rasgar o tecido distante na linha média, expondo a cavidade torácica. </li><li> Coloque a pinça por trás do coração. Segure a via de saída e puxe o coração longe do embrião. Separar o trato pulmonar e pulmões do coração, se ainda ligado. </li></ol></li><li> Transferir o coração a um único poço da lâmina revestida de colagénio e coloque-o lado dorsal para baixo (Figura 1B). Repetir passos 1.2.7-1.3 para cada embrião. </li><li> Uma vez que todos os corações foram transferidas para poços individuais, incubar a corrediça câmara durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir a adesão suficiente para a matriz de colagénio. </li><li> cuidadosamente adicionar20-50 mL de pré-aquecido meio de explante A volta de cada coração. Importante: Não adicione o meio demasiado depressa ou a um nível acima do coração, caso contrário corações pode soltar-se o substrato de colágeno. </li><li> Cultura os corações a 37 ° C, 5% de CO 2 durante cerca de 24 h, para permitir crescimento do epicárdio. Nota: excrescências podem ser observadas tão cedo quanto 3-4 horas de cultura (Figura 1C) e consiste principalmente de células de mesotélio que exibem morfologia de paralelepípedo, com a contaminação de células mesenquimais mínima (Figuras 1D, E). Os resultados representativos foram adquiridos utilizando um microscópio de dissecção equipado com uma câmara. </li></ol> 2. A ablação genética e indução de EMT em epicárdicas excrescências Cuidado: Pega adenovírus com cuidado de acordo com as diretrizes de biossegurança aprovados. <ol><li> Preparar 15 ml de meio B (M199 suplementado com 1% FBS e 1% de Pen / Strep) e pré-aquecido a 37 ° C num banho de água. </li><li> Para excisãoalelos floxed, prepare explante meio B suplementado com 2,5 x 10 4 ufc / ml de adenovírus que expressam Cre recombinase (Ad / CRE) ou vírus controle. Nota: sobreexpressão mediada adenoviral de genes candidatos pode também ser levada a cabo para avaliar o ganho de fenótipos funcionais. títulos virais deve ser determinada pelo utilizador final. </li><li> Remova cuidadosamente corações empobrecido-epicárdio de culturas de crescimento usando uma pinça. corações de transferência para tubos de 1,5 ml com 800 ul de Trizol e armazenar a -80 ° C para posterior isolamento do ARN e análise de expressão génica. </li><li> Lavar cada poço com DPBS para eliminar as células do sangue e excesso de detritos celulares. </li><li> Adicionar 500 ul de explante meio B, suplementado com adenovírus (es) a cada cultura de crescimento e incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Para a indução de EMT, remova o material e encher com 37 ° C explante meio B, suplementado com factor de crescimento de transformação recombinante (TGF) -β1 [10 ng / ml] ou veículo (h 4mMácido ydrochloric (HCl) contendo 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA)). Explantes de cultura para uma 24 horas adicionais a 37 ° C, 5% de CO 2. Proceda com gene / proteína analisa expressão ou imunocitoquímica, conforme detalhado nos protocolos subsequentes. Nota: A indução de EMT epicárdica foi estimulada com várias concentrações de TGF-β1 variando de 0,5 ng / mL - 10 ng / ml 26,31-33. Concentrações mais elevadas de ligando pode resultar na ligação não específica a todos os receptores de TGF-β. A concentração de TGF-β1 deve refletir os objetivos experimentais específicos. </li></ol> Análise Expression 3. Gene de epicárdicas excrescências <ol><li> corações empobrecido-epicárdio descongelamento previamente armazenadas em Trizol (2.2). </li><li> Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 800 mL Trizol temperatura ambiente para explante culturas. </li><li> Incubar corações empobrecido-epicárdio e culturas EPDC em Trizol por 5 min a temperatu quarto<html> ré. Pipeta cima e para baixo dez vezes para homogeneizar a amostra lisadas. Nota: Os corações pode exigir mais de pipetagem para homogeneizar completamente. </li><li> Transferir os lisados ​​para tubos de 1,5 ml e completar o isolamento de RNA total acordo com as instruções do fabricante. Adicionam-se 10 ug de glicogénio antes da precipitação para aumentar o rendimento de ARN. Um explante dado irá produzir cerca de 0,5-1,0 ug de ARN. </li><li> Remover o ADN contaminante, com a ADNase I e a transcrição reversa mRNA de 0,5 ug acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Validar a pureza de explantes e / ou indução de EMT com transcrição reversa quantitativa do epicárdio (qRT) -PCR 34 utilizando SYBR Green e os marcadores descritos na Tabela 1. Os níveis de ARNm Normalizar a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e calcular a expressão relativa usando o 2 - método ΔΔCt 35. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2A. </li></ol>title &quot;&gt; 4. análise de proteínas de epicárdicas excrescências <ol><li> Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 10 ul de tampão de lise proteína arrefecido com gelo (Tris 50 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético pH 8,0, 1% de Triton X-100, cocktail 1x inibidor da protease) a cada câmara bem e coloque a lâmina Secção de gelo. Cortar cerca de ¼ do fundo em uma ponta da pipeta P200 e usar a parte restante para raspar as células fora do slide. Pipeta cima e para baixo para as células do epicárdio lisar e transferência para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Sonicate explantes lisadas em baixa (160 W) durante 5 min em um banho de água gelada com 30 ciclos seg ON e OFF. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 10 minutos a 10000 xg, 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína de 36. Nota: A explante dada vai render até 1,5 ug de proteína total. Descobrimos que pooling explantes de dois corações umd carga de proteína de 2 ug por poço é suficiente para detectar o músculo liso α-actina (ACTA2) e GAPDH 9. A detecção de outras proteínas alvo podem exigir reunindo múltiplas amostras de explante tal como determinado pelo utilizador final. </li></ol> 5. Imunocitoquï¿½ica de epicárdicas excrescências <ol><li> Remova a mídia da cultura de explantes e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Suavemente adicionar 500 uL de paraformaldeído a 4% (v / v) ou de metanol arrefecido em gelo a cada poço e corrigir explantes durante 5 min à temperatura ambiente ou 10 min a -20 ° C, respectivamente. Fix acordo com as especificações de anticorpo, tal como recomendado pelo fabricante. </li><li> Remover fixador e lavar cada poço com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Permeabilizar as células com 500 ul de 0,1% (v / v) de Triton X-100 em DPBS durante 5 min. </li><li> Remoção da solução de permeabilização e enxaguar com DPBS três vezes por 5 min. </li><li> Bloquear as células com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatu quartoré. </li><li> Continuar com coloração de anticorpo primário acordo com as recomendações do fabricante e as condições óptimas como determinado pelo utilizador final. </li><li> Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Aplicar anticorpo secundário por instruções do fabricante e contrastante com um corante nuclear apropriado. </li><li> Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Remover paredes deslizantes câmara de acordo com as instruções do fabricante e adicionar meio de montagem aquoso directamente para as células. Coloque uma lamela sobre as células e selar com unha polonês. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2B - 2D utilizando microscopia confocal invertido. </li></ol> 6. Cultura Ensaio Ex Vivo (Figura 3A) <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar 12 ml de meio de cultura ex vivo usando um (1: 1) mistura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM): M199 suplementado com 10%FBS e 1% de Pen / Strep. </li><li> Em um banho de água a 37 ° C, pré-aquecido ex vivo meio de cultura e 100 ml de HBSS. </li><li> Alíquotas de 1 ml meio de pré-aquecida em 8-12 poços de uma placa de 24 poços. </li><li> Transferência de HBSS pré-aquecido a duas 2 placas de 10 cm, contendo 50 ml de cada vez. </li></ol></li><li> Isolar rato corações embrionárias em HBSS (como descrito em 1.2) a partir de vacas prenhes em 12,5 dpc. </li><li> Transferir cada coração para um único poço da placa de 24 poços contendo meio de cultura ex vivo. Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave manualmente ou utilizando uma plataforma de agitação para evitar a adesão. proceder imediatamente para o passo 7.1. </li></ol> 7. Epicárdica Labeling e EMT Indução em culturas ex vivo <ol><li> Para identificar o epicárdio, prepare-se 12 ml de meio de cultura C 37 ° ex vivo suplementado com 3,0 x 10 6 ufc / ml de Ad / GFP. Para ablação direccionada de alelos floxed, transferência de 6 ml de umad / GFP suplementado meio de cultura para um novo tubo de 15 ml. Adicionar Ad / Cre ou controlar adenovírus a uma concentração final de 1,5 x 10 6 pfu / ml. Nota: O ganho de função análises também pode ser levada a cabo com a entrega de genes mediada por adenovírus apropriado. </li><li> Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000. </li><li> Adicionar cuidadosamente meio de cultura suplementado com adenovírus (es) a cada poço. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas com agitação suave. </li><li> Para a indução de EMT, preparar 12 ml de 37 ° C ex vivo meio de cultura contendo 10 ng / ml de TGF-β1 e ml de factor de crescimento de 20 ng / derivado de plaquetas (PDGF) ou -BB veículo (HCl 4 mM contendo 1 mg / ml de BSA ). </li><li> Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000. Lave os corações com 1 ml de DPBS. </li><li> Retire os DPBS e encher os corações com a cultura ex vivo medium contendo TGF-β1 e PDGF-BB ou veículo. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave. </li></ol> 8. A crioconservação e imuno-histoquímica de culturas ex vivo <ol><li> Preparar os corações para a criopreservação. <ol><li> Remover o meio de cultura e lava-se duas vezes com corações DPBS arrefecido com gelo. </li><li> Adicionar 1 mL de 4% (v / v) de paraformaldeído a cada coração e fixar durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Remover o fixador e lava-se duas vezes com DPBS corações. Transferir os corações para poços frescas com 1 ml de 10% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave. </li><li> transferir cuidadosamente corações para novos poços com 18% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Transferir cada coração a uma cryomold contendo meio de congelamento de tecidos. congelar imediatamente blocos usando azoto líquido e armazenar a -80 &amp; #176; C. </li></ol></li><li> Seção corações em 5 mm, utilizando um criostato e colocar secções de tecido em lâminas de microscópio carregados positivamente. Loja desliza a -80 ° C até à coloração. </li><li> Realizar imuno-histoquímica em secções de detecção da membrana basal sub-epicárdico. <ol><li> Descongelar as lâminas durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Reidratar as seções por lavagem duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave. </li><li> secção permeabilizar com 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave. </li><li> Seque o DPBS excesso e definir a região de coloração com uma caneta rotulagem hidrofóbica. secções de bloco com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova o bloco e aplicar anticorpo colágeno tipo IV (ColIV, 1: 200) diluído em bloco. Incubar durante a noite a 4 ° C numa câmara com humidade controlada. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em DPBS durante5 min com balanço suave. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário conjugado com fluorescência (1: 500) e DAPI (1: 5000) em DPBS e aplicam-se as lâminas. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Escolha um anticorpo secundário apropriado com um comprimento de onda de emissão e de excitação distinta da GFP. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em PBS durante 5 min com agitação suave. Mount slides com meio de montagem. </li></ol></li></ol> 9. Imagem e Quantificação de culturas ex vivo <ol><li> Ter uma imagem de usuário cego e quantificar secções coradas. Imagem pelo menos cinco secções de tecido não-consecutivos de um dado coração em 4-5 locais arbitrários ao longo do epicárdio (extremidade do coração), utilizando um microscópio de fluorescência confocal ou na 40X. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3B usando microscopia confocal invertido. </li><li> contagem manual do número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Identificar migrando EPDC como GFP pocélulas sitive localizados dentro ou fora da membrana basal subepicárdico ColIV. Determinar a percentagem de migração de células de GFP, como o número de células positivas para GFP migrar sobre o número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3C-D, utilizando microscopia confocal invertido. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui destacamos métodos detalhados para isolar células do epicárdio primária por conseqüência e controlar a migração EPDC em ex vivo culturas cardíacos. Para as culturas conseqüência, o tempo apropriado para remover o coração empobrecido-epicárdio varia ligeiramente entre os experimentos. A monitorização periódica dos explantes após uma incubação durante a noite é recomendado para avaliar a extensão da excrescência do epicárdio e para extrair o coração diante de fibroblastos aparecer. Para garantir a pureza, co...

O epicárdio é uma única camada de células mesoteliais que reveste o coração e impactos cardíaca desenvolvimento, maturação e reparação. Através de uma troca altamente coordenada de sinais parácrinos, o diálogo íntimo entre o miocárdio e epicárdio é indispensável para o crescimento cardíaco e a formação de não-miócitos cardíacos linhagens 1. Células derivadas de epicárdio (EPDC) emergir a partir de um subconjunto de células do epicárdio através de um epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) 2, invadem o espaço subepicárdico e miocárdio subjacente, e se diferenciam em grande parte, em células murais vasculares coronárias e fibroblastos cardíacos, e para uma menor extensão, células endoteliais e cardiomiócitos 3-9. Os mecanismos que regulam EMT epicárdico e EPDC invasão têm sido atribuídas à acção coordenada de vários ligandos, incluindo as moléculas segregadas 10-13, receptores da superfície das células e moléculas de adesão, 14,15 mentoLators de polaridade apical-basal, 16,17, 18,19 GTPases pequenas, e factores de transcrição 2,20,21. Enquanto muitos dos efectores moleculares de migração EPDC ter sido definida, uma melhor compreensão dos sinais fisiológicos que estimulam EPDC mobilização no embrião pode acelerar o desenvolvimento de estratégias para manipular este processo no adulto para melhorar a reparação cardíaca. Estudos destinadas a identificação de novos reguladores de EPDC mobilização dependem de purificação desta população de células ou traçando a migração de células do epicárdio individuais. Um ou uma combinação de genes marcadores, incluindo WT1, Tcf21, Tbx18, e / ou ALDH1A2, é vulgarmente utilizada para identificar o epicárdio fetal 1. No entanto, a utilização destes marcadores para controlar a migração EPDC não é óptima quanto a expressão de marcadores do epicárdio diminui ao longo do desenvolvimento do coração e é muitas vezes perdida quando as células do epicárdio submetidos a transdifdiferen- em células mesenquimais. A aplicação do sistema Cre / loxP, em conjunto com os repórteres de rastreamento de linhagem, tem sido útil na rotulagem permanentemente o epicárdio e seus descendentes durante o desenvolvimento do coração e após a lesão isquêmica no adulto 7,22,23. Várias linhas de Cre-restrito do epicárdio foram geradas e são amplamente usadas para rotular EPDC e para o gene condicional estratégias de exclusão 1. Estes estudos levaram à caracterização de várias linhagens do epicárdio, e a identificação de mediadores críticos de EPDC motilidade e diferenciação. No entanto, evidências acumuladas também sugere o epicárdio é uma população heterogênea de células progenitoras 4,24,25. Deste modo, apenas um subconjunto de células do epicárdio vai ser alvo utilizando um determinado condutor de Cre. A fim de marcar todo o epicárdio independentemente da especificidade de Cre, um número de laboratórios utilizaram cul excrescênciasistemas tura ou ex vivo métodos de cultura de órgão para isolar fielmente ou marcar as células do epicárdio sem depender da expressão genética de uma linhagem marcadores 26-28. Para ex vivo estudos de migração, corações embrionárias são isoladas antes da EMT epicárdio e cultivadas em meio suplementado com uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Esta abordagem permite a marcação eficiente de todo o epicárdio ao invés de um subconjunto de células, a recombinação mediada por Cre. Culturas cardíacos são subsequentemente expostas a indutores conhecidos de EMT para estimular a mobilização de EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo são complementadas por análises in vitro Culturas de explantes do epicárdio, que são uma abordagem particularmente útil para explorar mecanismos detalhados condução migração EPDC. Aqui, descrevemos métodos para isolar as células do epicárdio primárias para estudos in vitro de epicardiai EMT, bem como um sistema de cultura de órgãos ex vivo para análises de EPDC motilidade. Recentemente, demonstrou a utilidade e robustez deste método pelo geneticamente modulando o factor relacionado com myocardin transcrição (MRTF) / factor de resposta do soro (SRF) eixo sinalização para manipular a migração baseado em actina de EPDC 9. Enquanto nossos resultados destacam uma via de sinalização necessária para regular a migração EPDC, estes métodos são adequados para desvendar os mecanismos que coletivamente orquestram a migração EPDC e diferenciação. Além disso, o ex vivo sistemas de cultura de explante e poderia ser implementado em telas funcionais para identificar novos reguladores de EPDC mobilização para aplicações terapêuticas em regeneração cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Hyclone Médio Eagle Modificado da Dulbecco</td><td>&nbsp;</td><td>SH3002201</td><td>Solução</td></tr><tr><td>salina balanceada DMEM Hanks '</td><td>Hyclone</td><td>SH3003102</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Hyclone</td><td>SH3025301</td><td>M199</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3002802</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gêmeos&nbsp;</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FBS Solução de Penicilina/Estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td><td>Corning</td><td>354557</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-well Placas</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Equipado com Leica KL300 LED pode ser fonte</td></tr><tr><td>Miscroscópio</td> <td>confocalOlympus</td><td>1X81</td><td>Equipado com laser muli-argon 405/488/515, laser FV10-MCPSU 405/440/635, laser 559, e lâmpada de mercúrio</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento transformador beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>100-B-001</td><td>TGF-&beta; 1</td></tr><tr><td>Fator de crescimento derivado de plaquetas BB</td><td>R& D Systems</td><td>220-BB-010</td><td>PDGF-BB</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>15596-026</td><td>Cuidado, material perigoso</td></tr><tr><td>Kit TURBO sem DNA</td> Life <td>Technologies</td><td>AM1907</td><td>DNaseI</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>Life Technologies</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde</td><td>BioRad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Goat-anti-rabbit 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-rabbit 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-mouse 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Camundongo anti-músculo liso alfa actina, Cy3-conjugado&nbsp;</td>Anticorpo monoclonal <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>, clone 1A4</td></tr><tr><td>Tumor anti-Wilms de camundongo 1 (WT1)</td><td>Life Technologies</td><td>MA1-46028</td><td>anticorpo monoclonal, clone 6F-H2</td></tr><tr><td>Coelho anti-ZO1</td><td>Life Technologies</td><td>40-2200</td><td>anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>Coelho anti-colágeno tipo 4</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato&nbsp;</td><td>Meio</td> de montagem fluorescente <td>DAPI</td>da Life Technologies <td>D1306</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído a 16% Ciências de</td><td>Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td>PFA diluído a 4% em DPBS. Cuidado, material perigoso</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Meio de congelamento de tecidos</td><td>Triângulo Biomedical Sciences</td><td>TFM-B</td><td></td></tr><tr><td>Pap caneta</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microtomo descartáveis&nbsp;</td>Lâminas de microscópio <td>Sakura Finetek</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td>carregadas positivamente, 25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cryostat&nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de base descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

epicárdio conseqüência cultura ensaio e<em&gt; ex vivo</em&gt; avaliação da migração celular epicárdica derivado

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Uma única camada de linhas de células do epicárdio do coração, proporcionando factores parácrinos que estimulam a proliferação de cardiomiócitos e que contribui directamente progenitores cardiovasculares durante o desenvolvimento e a doença. Embora um certo número de factores têm sido implicados na célula (EPDC) mobilização derivado do epicárdio, os mecanismos que regem a sua migração e diferenciação subsequente são mal compreendidos. Aqui, apresentamos in vitro e as estratégias ex vivo para estudar EPDC motilidade e diferenciação. Em primeiro lugar, descreve-se um método de obtenção de células do epicárdio primárias por cultura excrescência do coração embrionário do rato. Nós também introduzir um protocolo detalhado para avaliar a migração tridimensional de EPDC marcado num sistema de cultura de órgãos. Nós fornecemos provas usando essas técnicas que deleção genética dos fatores de transcrição relacionados com myocardin no epicárdio atenua a migração EPDC. Esta abordagem serve como uma plataforma para avaliar modificadores candidatos da EPDCbiologia e pode ser utilizado para desenvolver telas genéticos ou químicas para identificar novos reguladores de EPDC mobilização que possam ser úteis para a reparação cardíaca.

O epicárdio pode ser eficazmente isolados utilizando um ensaio de cultura de crescimento, tirando partido da sua localização exterior e explorando a plasticidade do desenvolvimento e do comportamento migratório intrínseca de EPDC. Corações embrionárias murinas são isolados em E11.5 antes EMT epicárdico e o lado dorsal para baixo cultivadas em lâminas de câmaras revestidas com colagénio 26 (Figura 1A, B). corações explantados continuará a se contrair; No entant...

Aqui, descrevemos métodos para isolar células epicárdicas primárias de camundongos por um ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração funcional de células derivadas de epicárdio (EPDC) usando um sistema de cultura cardíaca ex vivo. Esses protocolos são adequados para identificar moduladores genéticos e químicos da transição epicárdica epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade.

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Os objetivos gerais do método de cultura de crescimento e do ensaio de migração ex vivo são isolar culturas primárias de células epicárdicas para estudar transições epiteliais para mesenquimais e avaliar a migração funcional de células derivadas de epicárdios, respectivamente. A principal vantagem dessas técnicas é que elas facilitam o isolamento de culturas primárias do epicárdio e o teste dos comportamentos intrínsecos das células progenitoras derivadas do epicárdio. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de estratégias para manipular a biologia celular derivada do epicárdio na medicina regenerativa cardíaca.Na preparação de isolamentos de células epicárdicas, a câmara revestida de colágeno pré-aquecido desliza à temperatura ambiente e adiciona 100 microlitros de meio A por poço. Remova a mídia após revestir as câmaras, garantindo que não haja mídia acumulada. Para isolar células epicárdicas primárias, primeiro colha embriões de camundongos 11,5 dias após o coito.Use uma pinça para beliscar a parede torácica dos embriões e rasgar o tecido na linha média, expondo a cavidade torácica. Em seguida, coloque a pinça atrás do coração e segure o trato de saída. Afast

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas...

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Estudos de desenvolvimento no rato são dificultados pela inacessibilidade do embrião durante a gestação. Para promover a cultura de longo prazo do coração embrionário em fases tardias da gestação, foi desenvolvido um protocolo no qual o coração excisado é cultivada num Matrigel semi-sólido, diluída.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

O epicárdio é uma fonte essencial de células progenitoras cardiovasculares multipotentes e fatores parácrinos necessários para o desenvolvimento e regeneração cardiovascular. Descrevemos aqui um método para cultivar células epicárdicas embrionárias de camundongos.

Cultura in vitro de células epicárdicas De Coração embrionárias de camundongos

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

O epicárdio desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na reparação do coração, fornecendo células e fatores de crescimento da parede miocárdica. Aqui, descrevemos um método de cultura primária Epicárdica células de origem humana que permite o estudo e a comparação de suas características de adultas e de desenvolvimento.

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

Apresentamos três simples ensaios in vitro - o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia - que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Modelos in vitro de angiogênese coronariana podem ser utilizados para a descoberta dos mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana. Culturas in vitro explantam tecidos sinus venosos e endocárdios mostram crescimento robusto em resposta ao VEGF-A e apresentam um padrão semelhante de expressão COUP-TFII como in vivo.

Modelo In Vitro de Angiogênese Coronariana

Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Aprenda a isolar células epicárdicas primárias de embriões de camundongo usando ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração celular ex vivo. Este método auxilia pesquisadores a estudar transição epitélio-mesenquima e motilidade em biologia cardíaca.

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