어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

Developmental Biology

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Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

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Abstract

Introduction

인간의 샘플 (hiPSCs)에서 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 연구의 빠른 개발 기술입니다. 그들은 훨씬 적은 윤리적, 도덕적 결점의 1, 2와 배아 줄기 세포 (hESC의) 연구에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 hESCs는 3-5 성적으로 동일하지 않지만, hiPSCs 개발 및 질환 표현형을 모델링하는 독특한 방법을 제공하고이 질환 상태와 관련 5-8 조직 유래 될 수있다. 생성 hiPSCs 새로운 방법을 끊임없이 이식에 적합한 GMP 품질 iPSCs을 제조하고, 또한 리 프로그래밍 프로세스 6,9-11의 적시성 및 효율성을 증가시키는 방법으로, 시작하는 최적의 세포 유형을 식별하기 위해 탐색되고있다.

기도 상피 세포 알레르기 성 염증 (12)의 개발에 중요하며, 상피 immun와 상호 작용을 통해 알레르기 반응과기도 개형의 중요한 드라이버 인전자와 기질 세포. 기도 상피 기원과 천식과 같은 폐 질환의 지속성에 필수적인 역할을한다. 그러나, 낮은기도 상피 세포, 특히 건강 관리 환자와 어린이, 임상에서 얻을하기가 어렵습니다. 대기 오염 물질과 알레르기 항원에 대한 반응을 연구, 특히 여러 연구의 데이터는, 코 점막의 상피 세포가 낮은기도 상피 세포 13-20에 대한 유효하고 실질적인 프록시 있다는 전제를 지원합니다. 코 점막은 90 % 이상 섬모기도 상피 세포로 구성하고 다른 세포 / 조직 샘플링 기술보다 덜 침습적이고 같이이 코 점막 상피 세포 (NECs)를 샘플링하는 것은 쉽게, 연령 네다섯 한 어린 아이에서 수행 될 수있다 감염 20-23과 같은 부작용의 위험을 최소화과 관련. 그것은 긴 불필요한, ​​종종 고통스러운 기관지의 procedu없이 건강하고 병에 걸린 어린이 모두를 샘플링 할 수있는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다진정 작용을 필요로 입술. 이전의 연구는 천식 심각도 습관병 아형 비점막뿐만 아니라 천식 어린이로부터 취한 기관지 세포 샘플 모두에서 구별 될 수 있음을 발견하고, 두 조직 유형 간의 유전자 발현은 비 편재 유전자 (22)의 약 90 %에서 유사 24. iPSCs의 소스로, NECs 다른 자주 사용되는 세포 유형을 통해 이점을 제공합니다. 섬유 아세포는 종종 IPSC 생성을 위해 사용되지만, 이들 세포를 쉽게 피부 생검에서 배양 될 수 있지만,이 프로세스는 일반적으로 국소 마취, 절개 봉합을 필요로하고, 감염 될 위험과 관련된다. 따라서, 생검이 유형의 환자의 동의를 얻는 것은 25 어려울 수 있습니다. 섬유 아세포에 대한 한 대안은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 그러나, 소아에서 IPSC 생성을위한 충분한 혈액을 얻는 것이 어려울 수있다. 또한, 다운 스트림 액세스 포인트의 제한이있다섬유 아세포 및 혈액 세포 유래 iPSCs, 특정 세포 유형 5,26 특히 분화 능력에 대한 plications. 따라서, 상대의 접근성 및 컬렉션 다음 부작용의 낮은 위험을 주어 NECs 소아 인구에서 IPSC 생성을위한 이상적인 셀 소스를 나타낸다.

iPSCs 소설 질병 모델을 인간 개발 연구 생성 플랫폼으로 최근에 많은 주목을 받아 맞춤 치료를위한 세포의 잠재적 인 소스로했다. 이 기술의 잠재력이 실현 될 수 있기 전에, 프로그래밍 과정의 분자 토대가 설명 될 필요가 있지만, 지금이 프로토콜 내에서 설명 된 절차를기도 노출에 집중 조사 연구 해명 것임은 물론위한 플랫폼을 제공하는 iPSCs 관련된 개인화 된 의약품의 효과를 연구.

여러 연구소의 공동 작업은 generatio하게되었다코 점막을 샘플링뿐만 아니라, NECs를 배양하고, iPSCs (23)이 세포를 재 프로그램뿐만 아니라에 대한 성공적인 기술의 N. 이 문서에서는 최적의 샘플링, 배양 및 프로그래밍 환경을위한 프로토콜의 개요를 제공합니다.

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Protocol

다음 프로토콜은 기관 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 코 점막을 샘플링

참고 : 호흡기 바이러스 감염의 흔적이없는 피사체에서 샘플을 얻습니다.

  1. 참가자 방문하기 전에 15 ML 원뿔 신선한를 준비하고 2 ml의 BEGM (기관지 상피 세포 성장 배지) 플러스 20 ㎕를 멸균 펜 / 패 혈성 / Fungizone (P / S / F) (0.01 %)를 추가합니다.
  2. 열기 세포학 단지 샘플을 복용하기 전에 브러시 및 살균 브러시를 유지해야하고, 코 표면 이외의 모든 표면을 만지지 마십시오.
  3. 가만히 앉아 천장을 향해 머리를 기울 참가자를 요청합니다. 작은이 이상 불안 아이들은 그들의 손에 앉아 및 / 또는 멀리 브러시를 때리는 등 모욕적 피하기 위해 누워.
  4. 통로가 좁아 (작은 블랙홀처럼 보이는) 코의 뒤쪽에 브러시를 목표로하고 있습니다. 아래로 브러시를 밀어 브러시가 nostri에서 제거 될 때 손목을 비틀엘.
  5. 원뿔에서 브러시를 놓고 BEGM에 잠수함. 여분의 브러쉬를 잘라 튜브에 뚜껑을 교체합니다. VORTEX하지 않습니다.
    주 : 참가자 용의 경우와 동일한 방식으로했지만 제 콧 구멍에 제 브러쉬 얻었다. 양쪽 콧 구멍의 칫솔질을 얻는 것은 샘플링이 성공하는 높은 가능성이 발생합니다. 같은 콧 구멍을 샘플링 출혈이 발생할 수 가능성 샘플을 향상되지 않습니다.
  6. 따뜻한 물로 비이커를 사용하여 운송 중 가능한 37 ° C에 가까운 샘플을 보관하십시오.

2. 세포 수와 Cytospin

  1. 부드럽게 BEGM에 브러시를 교반하고 hemacytometer를 사용하여 세포 수의 샘플 10 μL를 취할. 라이브 / 죽은 얼룩의 10 μl를 추가 만 현미경으로 세포를 살고 계산합니다.
  2. 샘플의 50 μl를 타고 1X PBS 200 μL에 희석. 2 분 동안 300 rpm에서 유리 슬라이드와 스핀에 부착 cytospin 깔때기에 추가합니다. 따라와 건조 O / N 및 얼룩 슬라이드를 밀어 보자g 제조업체의 지침. 바람직하게는 어둠 속에서, O / N을 건조하도록 허용합니다.
  3. 헤마 3 얼룩 얼룩 슬라이드
    1. 각 솔루션 (; 헤마 3 솔루션 I, 핑크, 헤마 정착액, 밝은 파란색과 헤마 3 솔루션 II, 푸른 깊이)로 이동시켜 염색 접시에; 사용하지 않을 때는 커버하십시오. 슬라이드 염색 보트에 슬라이드를 삽입
    2. 딥 슬라이드는 지속적으로 30 초 동안 정착에 다음 과잉 배출 할 수 있습니다. 딥 내가 30 초 동안, 다음 과잉 배출 할 수 있도록 솔루션에 지속적으로 슬라이드. 딥은 과잉 배출 할 수 있도록 30 초 동안 지속적으로 솔루션 II에 슬라이드
    3. 물이 맑은 실행까지 탈 이온수로 씻어. 어둠 속에서 바람직하게는, O / N을 건조하도록 허용
  4. 상피 세포의 비율을 결정, 현미경 카운트 세포에서 슬라이드 봐. 샘플링이 좋은 경우 90 % 이상이어야합니다.

3. 시드 셀

주 : 적절한 인증 조직 문화의 모든 세포 배양 과정을 수행후드 무균 기술을 사용.

  1. 소 피부 콜라겐 (BDC)와 코트 판, 유형 1. 49.5 ㎖의 1X PBS에 희석 3 ㎎ / ㎖ BDC의 0.5 ML을 추가합니다. 몇 판을 사용할 경우 더 적은을 준비합니다. 코트 2 시간 동안 37 ° C에서 T25의 2 ml의 BDC와 플라스크 및 멸균 후드 O에 품어 / N 또는 필요한 경우.
  2. 배양 후, 남아있는 액체를 대기음. 멸균 후드에서 30 분 동안 자외선에 플라스크를 노출. 하지만 1 개월까지 4 °에서 C에 대한 저장소 플라스크, 세포를 파종하기 전에 C를 RT로 가져 또는 37 °.
  3. 시드 할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 BEGM에 브러시와 세포를 유지합니다. 조심스럽게 휙 원뿔 내부 브러시,하지만 소용돌이하지 않습니다.
    1. 플레이트 T25 플라스크에 7 × 10 5 세포. 이하이 있으면 작은 컨테이너 6 웰 플레이트 중 하나와 같은 잘 사용한다. 이 크기의 플레이트는 약 3 × 10 5 세포를 필요로한다.
      참고 :이 많은 세포가없는 경우, 계속하지 않는 것이 좋습니다.
  4. 멸균 후드 아래, 튜브 및 GE에서 브러시을ntly 코팅이 긁히지 않도록주의하면서, 코팅 된 플라스크의 표면에 브러시를 회전 할 수 있습니다. 적절한 생물 학적 용기에 브러시를 폐기하십시오.
  5. 천천히 원뿔에서 그리고 T25 플라스크에 BEGM에 남아있는 세포를 피펫. 현미경으로 세포를 관찰한다. 부유 세포의 숫자가 관찰되며이 단계 (도 3a)에서 허용되는 코 일부 파편이있을 수있다.

4. 세포 배양

  1. 세포를 파종 한 후,이를 중단없이 48 시간 (그림 3)에 안주 할 수 있습니다. 48 시간 후, 천천히 그리고 부드럽게 2 ml의 따뜻한 BEGM 및 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Fungizone (P / S / F) 20 μl를 추가합니다.
    참고 : 미디어의 원래 2 ml에 대기음하지 마십시오.
  2. 파종 후 4 번째 날, 신중하게 모든 액체를 대기음, 신선한 4 ㎖로 교체 BEGM 플러스 1X 펜 / 연쇄상 구균이 (fungizone가 더 이상 필요하지 않습니다) 가온. 이틀 미디어를 변경하고 연결에 대한 세포를 평가, 표준, 성장과 합류. 세포에 도달하면 ~ 80 %의 합류, 일반적으로 2-3 주 내에, 그들은 계대 할 준비가 된 것입니다.
  3. 하나 T25 플라스크 (약 2.5 × 10 6 세포 때 합류) 세 T25 플라스크 또는 1 T75 플라스크에 계대 수 있습니다. 제 1 통로 후, 세포는 약 3 일 합류에게 도달 튼튼하고 건강해야한다.

5.과 Passaging 세포

  1. 부드럽게 접시에서 미디어를 대기음. 약 4 분 동안 인큐베이터에있는 접시와 장소 T25 플라스크 당 1 ml의 0.05 % 트립신 솔루션을 추가하거나 세포를 플레이트에서 분리 될 때까지. 세포마다 2 분의 분리의 수준을 확인하고 이상 10 분에 트립신을 두지 마십시오.
  2. 효소를 중화 5 ㎖의 트립신 중화 솔루션 (TNS), 또는 혈청 함유 미디어를 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 플라스크 장소에서 모든 액체 및 세포를 제거합니다.
  3. 5 분 동안 200 XG (감속 가속도 0 0)에서 원심 분리 세포 펠렛을 얻었다. 기음 superna새로운 플라스크에 필요한 볼륨 S BEGM에서 + P / 중대장과에 resuspend 세포 (T75 플라스크에 대한 T25 플라스크 4 ml의 10 ㎖)
  4. (2.1) 전술 한 바와 같이 라이브 / 죽은 얼룩 세포 수를 수행합니다. 코팅 된 플라스크에 BEGM 세포의 적절한 금액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 상기 상세한 유지 또는 용액 당 0.5 × 106 세포의 농도로 배지 (70 % BEGM, 20 % FBS와 10 % DMSO)를 동결 cryopreserve.

iPSCs 6. 재 프로그래밍

참고 : iPSCs를 생성하기 전에 생성과 인간 iPSCs의 사용을 규제하는 모든 기관 규정 준수를 보장합니다. 배양 배지는 통상적으로 항생제를 함유하지 않는 멸균 기술은 IPSC 배양에 특히 중요하다. NECs 건강 표시하고 견고 성공적인 프로그래밍에 대한 증식있는 것이 중요합니다.

  1. 판 6 잘 조직 배양 플레이트의 웰 당 5 × 10 5 NECs. 24 시간 후, 폴리 브렌 추가BEGM에 매체 인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 발현 렌티 바이러스 입자를 첨가하여 8 μg의 / ㎖ 및 형질 도입 NECs 최종 농도. 5 ~ 27의 감염 (MOI)의 다양성을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다.
    1. MOI를 결정하는 것과, 농축 - 렌티 바이러스 스톡의 희석액을 제조하고 이들로 희석 HT1080 세포를 형질 도입. HT1080 세포에서 발현 dTomato 제 명백하게 검출 후 dTomato 양성 세포 / 희석 각 셀의 작은 덩어​​리의 수를 기록하여 "형질 도입 단위 용액 /"의 수를 계산한다.
      참고 : 일반적으로 너무 높은 희석 (모든 dTomato 긍정적이다) 너무 낮은 (없음 또는 양성 세포의 커플)이있을 것이다.
    2. 세포의 분리 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 확인되는 희석에서 득점을 수행합니다. 적절한 희석 인자 단위 / ㎖ 열 변환 수를 보정함으로써 역가를 결정한다. MOI는 수의 비율의 바이러스 입자 (27)의 수를 셀 형질.
      참고 : 각 dTomato 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 하나의 바이러스 입자에서 발생하는 가정한다.
  2. 약 3 시간 후 전달 매체를 제거하고 신선한 BEGM로 교체합니다. 제도적 승인 절차를 사용하여 렌티 바이러스 함유 미디어를 폐기하십시오. 3 일간 인큐베이터에 형질 NECs를 돌려줍니다.
  3. 3 일에, 신선한 BEGM와 미디어를 교체 한 다음 다른 3 일간 배양한다. 기음 미디어는 1X PBS로 세포를 씻어 잘 1 ml를 0.05 % 트립신 솔루션을 추가 보냈다. 트립신과 통로 세포 (섹션 5) 위의 기록으로. 조심스럽게 4 ml의 BEGM + P / S에 뜨는 및에 resuspend 세포를 대기음. 세포를 준비하는 경우 (다음 단계 참조) BDC 코팅 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 계대 또는 MEF 배양에 첨가 될 수있다.
  4. MEF 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 4 일에 () +/- Thiazovivin (SPT를 수행 단계 6.6를 참조)도 6의 2 웰 (1 ㎖ / 잘) 0.1 % 젤라틴 용액을 추가합니다. 다음에하루는 불 활성화 MEFs에 28 병을 해동.
  5. MEF 미디어 (DMEM + 1 배 NEAA + 10 % DFCS) 10 ㎖로 MEFs에 배치합니다. 5 분 200 XG에 스핀 펠렛합니다. MEF 미디어를 Resuspend. 대기음 6 웰 플레이트에서 젤라틴과 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 웰 당 1.87 × 10 5 MEFs에 추가합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, 또는 24 시간의 최소.
  6. BEGM의 양도 2 ㎖를 이전에 코팅 된 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 당 세포를 형질 도입 및 / N을 O를 품어 함유. 다음날 4 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 표준 hESC의 미디어 웰 당 2.5 ㎖로 교체 BEGM. 신선한 hESC의 매체와 세포를 공급 +/- SPT를 매일 10 일 동안
    참고 : NECs (23)에 대한 효율성과 프로그래밍의 반응 속도를 향상시키기 위해 작은 분자 (SB431542, PD0325901 및 Thiazovivin (SPT) 칵테일)의 칵테일을 추가 할 수 있습니다.
  7. 십일 후, SPT없이 hESC의 미디어를 사용하여 매일 먹이를 계속합니다. hESC의 같은 식민지 때까지 매일 문화를 피드(그림 5A, P0 식민지)를 나타납니다. 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체 : 높은 핵으로 추정 iPSCs을 품고 식민지를 확인합니다.
  8. hESC의 같은 형태를 가진 수동 소비세 및 전송 식민지 공급 장치가없는 시스템에서 별도의 선으로 문화와 확​​장을 위해 우물을 분리합니다. 절제 식민지는 이러한 조건에 빠르게 적응해야한다.
    1. 도금 절제 식민지 후이 이산 추정 IPSC 라인은 지금 통로 1 (P1)으로 간주됩니다. 매일 mTeSR1와 피드 문화. 통로 및 표준 절차를 사용하여 IPSC 라인을 확장합니다. P1의 식민지들은 계대되어야하는 크기에 도달하는 것은 일주일에 며칠이 걸릴 수 있습니다.

7. 문화 iPSCs 유지

  1. 피드 및 일일 문화를 평가합니다. 수동 소비세 지역은 멸균 유리 피펫 또는 마이크로 피펫 팁으로 긁어에 의해 명백한 차별화를 전시. 매일 수확 후 미디어를 변경합니다.
  2. 통로 세포 approxima 후tely 4 일마다 : 부드럽게 흡인 미디어, 6 웰 플레이트 (하프 공급 볼륨)의 웰 당 1 ml의 따뜻한 스파 아제 (Dispase) (1 ㎎ / ㎖)을 추가 한 후 약 4 분 동안 37 ° C에서 품어. 식민지의 가장자리는 식민지 주위에 흰색 테두리처럼 보이는, 리프트 시작합니다. 조심스럽게 스파 아제 (Dispase)를 대기음 및 예열 DMEM / F12와 함께 배를 씻는다.
  3. 2 ml의 mTeSR1를 추가하고 판에서 식민지를 들어 올릴 셀 리프터를 사용합니다. 식민지가 작은 클러스터로 분할 될 때까지 부드럽게 세포를 씹다에 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 또는 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다.
    1. 생존 후속 증식 차선 바와 같이, 매우 작은 클러스터 또는 단일 셀의 제조 피. 콜로니를 다시 도금하면, 1 : 4 내지 1 : 6 분할 최적 콜로니 밀도를 유지한다. 부드럽게 판에서 식민지와 미디어를 제거하고 새로운, 마트 리겔 코팅 된 웰에 추가 할 수 있습니다.

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Representative Results

코 전정 불리는 코 초기 부분, 연골 조직 (29)으로 둘러싸인 영역이다. 브러쉬 코 밸브 (소공의 internum 또는 비공 뒷면에서 본 "블랙홀") 이상, 코이 영역을지나 원활하게 진행해야하고, 시료 비갑개 (도 1)로부터 얻어진다. 비강 비갑개은 코 (29)의 표면적을 증가 샘플링 그들에게 최적 위치를 결정 뼈 구조이다. 이 지역은 또한 밀접하게 하부기도의 라이닝과 유사한 환경 노출에 대한 면역 반응 또한 활성화되어 혈관 점막 조직에 의해 줄 지어있다.

올바른 조직을 샘플링 재 프로그램 된 세포가 상피 세포임을 보장합니다. 이것은, 또한 배양 세포를 관찰하여 초기 셀 카운트 및 cytospin 의해 평가 될 수있다. 그만큼cytospin가 한 번, 스핀 다운 건조하고, 염색, 시료의 구성을 보여줍니다. 대부분의 샘플은 한 라운드 핵으로, 기둥과 솜털이있는 상피 세포로 구성. 그들이 함께 뭉쳐 볼 수 있습니다 코에서 직접 촬영 때 헤마 3 얼룩 키트와 함께, 그들은 종종 (그림 2) 어두운 보라색 핵을 가진 밝은 파란색 색상을 염색합니다. 비강 세포 샘플은 초기 배양에서 미디어 변경 시간 코에서 세포 유형의 혼합과 파편하지만, 상피 세포는 우세한 (도 3A, B)이된다. 상피 세포가 합류로 성장하고있다, 그들은 핵이 큰 갓 깨진 된 달걀, 모양과 중심에 위치한 셀 (그림 3B)에 나누어 준비로 세포질은 "청하는"스트레칭의 일종이다 있습니다. 세포가 함께 성장, 그들은 축구 모양의 이상에 가지고 가고, (접시에 꼭 함께 그림에 맞게 시작3C).

세포가 형질 도입되면, 그들은. 핵에 tdTomato 형광 마커를 표현하는 것입니다 그들은 형질 도입 된 이후에 시야, 형광 및 두 이미지가 합병으로, 4 셀을 보여줍니다. 아니 모든 세포 마커를 발현하므로하지 모든 세포는 형질 도입되었지만, 각 웰은 약 90 %의 형질 도입 효율성을 가져야하며 이것은 일부 세포 MEFs에의 도금 후에 다 능성을 달성 할 가능성을 증가시킬 것이다.

공동 배양 MEFs에와 세포 등이 식민지를 형성하기 시작하면, 그들은 점차 tdTomato을 표현 중지됩니다. 그러나,이 콜로니 형성의 가장 지시 아니다. 콜로니 형성의 가장 표시 시각 확인한다. 만능의 '황금 표준 "입니다 hESC의 식민지는 주로 원형이며 larg의 많은 작고 둥근 세포로 구성되어있다즉 핵 및 세포질 비율이 높은 핵. 각 셀은 주로 핵으로 구성 나타납니다, 그리고 다른 세포 소기관 명확하게 표시되지 않습니다. 표준 공급 장치가없는 상태에서 IPSC 식민지 수확, 문화에 따라, 새로 형성된 IPSC 식민지 훨씬 자신의 hESC의 대응과 같아야하고,도 5b에서와 같이 각각의 세포는 hESC의 표현형과 거의 동일하다.

이용 iPSCs이 실험에서 코 점막 상피 세포 (NEC-iPSCs)에서 발생하기 전에 새로운 라인의 품질을 평가하는 것이 좋습니다. 이것은 일반적 핵형, 다 능성 마커의 발현 및 3 배아 배엽 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 각각에 iPSCs 분화 능력의 평가를 포함한다. 분화 능력은 여러 가지 방법으로 시험 할 수 있지만, 현재 가장 엄격한 분석은 기형 분석 2,23,30이다. 같은 전사와 같은보다 포괄적 인 분석 및 에피 지노믹스 프로파일은 염색체 이상이 23 재 프로그래밍에 의해 도입 여부를 결정하는데 유용하다.

그림 1
그림 1. 비갑개. 샘플링 운동과 샘플링 대상, 하 비갑개가, 검은 색 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. Cytospin. 샘플의 대부분은 일단 섬모와 다른에서 둥근 핵으로 긴 기둥입니다 상피 세포로 구성되어 있습니다. 레즈에서 직접 샘플링 할 때 그들은 종종 함께 응집되어있다. 화살표는 각각의 상피 세포를 나타냅니다."https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
샘플 수집 및 도금 직후 문화 그림 3. 주요 코 점막 상피 세포. (A) 부동 세포와 파편. (B) 세포 일일 후 계대된다. 세포 형태가 일치하고, 문화는 주로 코 점막 상피 세포, 10 배 배율 및 (C) 5 배 배율로 구성되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
NECs 그림 4. 형질 도입. 세포 벡터를 채택하고 적색 형광 마커 tdTomato를 표시 한 형질 도입된다. 가 능성 상태를 향해 진행으로이 마커는 퇴색한다. (A) 형질 세포의 밝은 필드 이미지입니다. (B) 형질 세포의 형광 이미지입니다. (C) 오버레이 밝은 필드 및 형광 이미지 (패널 A와 B)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. IPSC 세포와 같은 식민지를 줄기. (A)가 MEFs에에 성장, 식민지 대부분 가장자리에 둥근없이 분화에 작은을 보여줍니다. (B) 개별 세포는 큰 핵으로 작은 원형 세포, 전형적인 hESC의 같은 형태를 보여줍니다.5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

코 점막 상피 세포 (NECs)는기도 질환 연구를위한 액세스 플랫폼, 그리고 NEC-iPSCs 질병 개발, 치료 및 치료 1,31,32을 탐구하는 흥미로운 수단을 제공합니다. NECs 쉽게 스트레스 또는 잠재적으로 유해한 절차 6,23없이 얻을 수있다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜에 설명 된대로 코 점막의 샘플링은 스트레스를 덜하고 더 나은 어린이를위한 채혈보다 인식이 나타납니다. 따라서,이 방법은기도 질환 연구에 특히 소아 환자 집단에서 유용하고 관련이있을 수 있습니다. NECs의 또 다른 장점은 문화에 한 번, 상피 세포는 미디어와 문화 조건으로 선택하고 균일하게된다는 것이다. 이는 혈액 세포로 복합 조직을 사용하는 것보다 유리하고 쉽게 transcriptomic 및 후생 유전 학적 방법을 사용하여 IPSC 라인 얻어진 세포 기원의 영향을 평가한다.

언제비점막 샘플링, 대부분의 상피 세포가 검색되도록 현미경 (도 2)에 따라 cytospin를 보면 알 수 있듯이 코 정확한 면적을 샘플링하는 것이 중요하다. 올바른 샘플링은 ≥90 % 상피 세포를 얻을 것입니다. 이는 건강한 환자 샘플들을 획득하고, 얻어진 샘플을 도금 셀 수를 최대화하기 위해 적절하게 회수되도록하는 것이 중요하다. 프로토콜 (섹션 1.5)에 기재된 비틀림 운동은 브러시 가능한 코 표면의 정도와 접촉하는 것을 보장한다. 이물질이 하나의 얼굴로 향하고 때 하나의 머리를 설정하는 자연 반사이다. 따라서, 자신의 아이가 고개 또는 변 또는 멀리 당긴다 할 경우에는 샘플링 빠르고 정확하게 발생하는 것이 필수적이다. 이러한 기술을 사용하여 프로토콜의 모든 다른 단계의 효율을 증가시키고, 성공적으로 프로그래밍 가능성을 결정한다. 아이를 요구누워, 심지어 그들 아래에 손을 배치하거나 부모 나 형제가 자신의 손을 잡고이 여전히 거짓말을하고 부드럽고 고통 샘플 수집을 보장 할 수 있도록 격려하는 좋은 방법입니다.

최근, 몇 가지 다른 샘플링 기법은 편안함 용이성 및 샘플 결과 평가 셀 함량 및 조성물뿐만 아니라 RNA와 DNA에 기초하여 33을 산출 하였다. 이 그룹은 폴리 에스테르 면봉 대 세포학 브러시로 샘플링을 검토 한 결과, 그들은 비갑개뿐만 아니라 적극적으로 콧 구멍 주위 브러시 또는 면봉을 소용돌이에 의해 전방 콧 구멍을 모두 샘플링. 그것은 가장 RNA 수율을 수득했고, 가장 섬모 상피 세포로 구성되어 있지만, 폴리 에스테르 면봉에 비해 브러시 비갑개 샘플링이 다소 불편이었다. 이 프로토콜에서 제안 된 방법에 따라서 호흡기도를 연구하기위한 방법으로 비강 상피 세포를 채취 가장 안정적인 방법으로 검증상피.

샘플 획득되면이를 37 ° C로 유지되어야한다. 가장 효과적인 방법 중 하나는 참가자를 충족하기 위해 준비하는 동안 안전한 전송을위한 스티로폼 용기에보다 큰 37 ° C 네슬레 그것에 물 비커를 가온한다. 샘플이 수집 직전에 온도가 약 37 ℃로 가져되도록 시원한 물을 추가하고, 미디어 원뿔 튜브를 추가합니다. 브러시 원뿔형 튜브에 첨가 될 때, 수조 즉시 튜브를 되돌아가되는 세포가 될 때까지 튜브가 규제 37 ℃로 수조에 넣어되어야 가리 실험실로 복귀 할 수있을 때까지 보관 문화 플라스크에 접종. 모든 점에서, 멸균 기술은 문화에 외국 에이전트를 도입 피하기 위해 사용되어야한다.

세포 배양에 넣을 때 샘플 사이 변화의 상당한 양이 관찰되었다. 이 변화는 기증자 소스 모두에서 줄기뿐만 아니라 듯샘플 품질 자체. 샘플의 품질을 향상하기위한 한 가지 방법은 각 비공에서 하나의 브러쉬 나 참가자 당 두 개의 브러시를 얻을 수있다. 세포를 계대대로 신선한 샘플을 파종 한 후, 그리고 세포의 상태는 재 프로그램 될 적합 확인하기 위해 정기적으로 모니터링해야한다. 에 가장 적합한 후보를 만드는 세포 배양에 걸릴 빠르게 증식 사람입니다. 이것은 특정 공여자 세포는 다른 세포보다 더 강력한 이유 공지 아니지만 이러한 샘플링시의 연령, 코의 크기 및 도너의 건강과 같은 요인에 기인 할 수있다. 시료 수율 거의 세포 또는 세포의 수가 적은 일단 도금 부착하면 샘플 합류로 성장할 가능성이있다. 어려움을 겪고 문화가 합류에 도달 않으면 세포는 약한 경향이 많은 세포를 계대 동안 죽는다. 샘플이 유형들이 있다는 사실은 세포가 신속하고 견고하게 확산하는 것이 필수적이므로, 프로그래밍을위한 매우 불량한 후보와가장 빠른 통로 번호로 형질 도입. 이 너무 얇은 기증자의 변화, 가난한 샘플링, 또는 계대 배양에 의한인지, 천천히 성장하고 세포를 형질하지 않는 것이 좋습니다. 프로그래밍이 가난한 세포 배양으로 시도하면 결실을 진행 않을 수 있습니다.

전달을위한 셀을 준비하는 준비하기 위해 가장 어려운 프로토콜의 한 부분이다. 5 × 105 세포의 증식, 2 × 105에 기초하여 전달을 위해 제안 된 특정 환자 샘플에서이 의존 할 수있다. 따라서 이상적인 숫자를 얻기 위해 세포 수를 변화 도금 몇 우물을 필요로 할 수있다.

이 프로토콜은 샘플링의 용이성뿐만 아니라 상대적으로 쉽게 및 기본 세포 배양을 설정하는 타임 라인, 더 지속 가능하고 다양한 연구 기회에 대한 IPSC 라인에 그 차 세포​​ 배양의 후​​속 프로그램을 다시 만들뿐만 아니라 간략하게 설명합니다. 전체병원에서 문화 이산 iPSCs의 설립에 대한 과정은 약 3 개월 소요되며, 프로그래밍 시간을 단축하기위한 새로운 방법은 6,34,35을 개발되고있다. 이 필드는 빠르게 iPSCs 1 차 세포​​를 변환하고,이어서 관심의 특정 세포 및 조직 유형에 iPSCs를 차별화하는 데보다 효율적이고 완전한 방법을 찾기 위해 진화하고있다. 그러나, 호흡기 질환에 대한 중요한 조직 분화 프로토콜, 예컨대 폐 상피로 여전히 36-38 일을하고있다.

NECs에서 iPSCs를 생성하는 세포의 간단하고 상대적으로 고통 분리의 장점이있다. 또한, NEC-iPSCs 악용 할 수있는 다른 조직 유형으로부터 유래 iPSCs 위에 이점을 제공하는 것이 가능하다. 증거가 마우스와 인간 iPSCs가 자신의 체세포의 전사 및 후생 유전 학적 기억을 품고 있음을 나타냅니다하지만 이후 IPSC 차별화에 IPSC의 후성 유전학의 영향은 완전히 이해되지 않습니다원점이 선택적으로 다른 운명 5,26 제한 동안 공여체 세포 유형과 연관된 계통으로 분화 호의있다. 때문에 원산지 조직의 중요성, 그리고 더 나은 이해하기 위해 조직 특이 후생 유전 학적 마크 39-45의 유지에 특히 관련이 영향 iPSCs의 기능적 특성, IPSC 라인이보다 명확하게하기 위해 연구해야 할 방법 기원의 조직에 미치는 영향. NEC에서 파생 된 iPSCs 원산지 (23)의 그들의 조직의 후생 유전 학적 메모리의 유지를 나타내는 유전자 메틸화 서명을 항구 것을 그것은 이전에 표시되었습니다. 이전 연구보다 쉽게​​ 섬유 아세포 또는보다 혈액 세포로 분화되는 원래 혈구 후성 메모리를 나타내는 혈액 세포 유래 iPSCs을 나타낸 것처럼 NEC-iPSCs에 유지 이러한 후성 메모리는 호흡기 세포로 다 능성 줄기 세포의 분화에 유익 할 수있다 (B100)를 부족한 평활근에서 유래 iPSCsD 셀 고유의 후생 유전 학적 메모리 5,26. 모델링 폐 질환 IPSC 유래기도 세포의 거대한 잠재력 감안할 때 NECs는 호흡기 세포 / 조직으로의 분화 iPSCs 최적의 세포 유형을 표시할지 여부를 연구하는 것이 중요 할 것이다. 또한,이 메모리는 안정적으로 유지 공여 세포의 질환 상태에 대한 프로그래밍 염색체 위치에 강한 후보자를 나타낼 수있다. iPSCs를 변환하는 프로토콜이 인접하고 말초 폐 세포 유형은 36-38을 개발, 이러한 NEC-iPSCs는 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭포 성 섬유증, 및 많은 다른 사람과 같은 폐 발달에 환경에 미치는 영향을 연구의 모델링기도 질환에서 우위를 가질 수있다 및 항상성.

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Acknowledgments

저자는 다 능성 줄기 세포 시설 신시내티 아동 병원에서 공 촛점 이미징 코어를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) 및 2U19AI70235 (GKKH)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

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