Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lunelli, L., Bernabò, P., Bolner, A., Vaghi, V., Marchioretto, M., Viero, G. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (109), e53851, doi:10.3791/53851 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Поступательное машины, т.е. полисом или polyribosome, является одним из самых больших и самых сложных механизмов в цитоплазме клеток. Полисомы, образованные рибосом, мРНК, несколько белков и некодирующих РНК, представляют собой интегрированные платформы, на которых трансляционные элементы управления имеют место. Тем не менее, в то время как рибосома широко изучается, организация полисом до сих пор отсутствует полное понимание. Так много усилий требуется для того, чтобы выяснить полисом организации и любой новый механизм трансляционной управления, который может быть встроен. Атомно-силовой микроскопии (AFM) представляет собой тип сканирующей зондовой микроскопии, который позволяет приобретение 3D-изображений с разрешением наноуровне. По сравнению с методами электронной микроскопии (ЭМ), одним из главных преимуществ AFM является то, что он может получить тысячи изображений, как в воздухе, так и в растворе, что позволяет образца, который должен поддерживаться в условиях, близких физиологических условиях, без какой-либо необходимости для окрашивания и фиксации процедуры. Здесь подробный протокол для точной очистки полисом от мышиного мозга и их осаждении на слюде подложках описан. Этот протокол позволяет полисом визуализации в воздухе и жидкости с AFM и их реконструкции в виде трехмерных объектов. В дополнение к крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), предложенный метод может быть легко использован для систематического анализа полисом и изучения их организации.

Introduction

Синтез белка является наиболее энергоемким процессом в клетках 1,2. Следовательно, не удивительно , что белковые содержаний в основном контролируются на поступательными , а не транскрипционной 3,4,5 уровня. Полисом является фундаментальным макромолекулярная компонентом, который преобразует информацию мРНК в функциональных белковыми считываниями. Полисомы до сих пор признается в качестве макромолекулярных комплексов , где несколько поступательных управления сходящихся 6-13. Несмотря на сотни исследований структуры рибосом 14- 16, детальные молекулярные способность проникновения в суть динамики перевода и топология полисом обнаружена ограниченный интерес. Как следствие, организация родного polysomal рибонуклеопротеиновой комплекса и его потенциальное влияние на перевод все еще довольно неясными вопросы. Полисомы может скрыть все еще неизвестные налаженной и функциональной организации, потенциально отражая какие нуклеосом и эпигенетические ControLs представляли для поля транскрипции. Действительно, исследование этой интригующей гипотезы требует дополнительных исследований и новых технических подходов. В этой линии, структурные методы и атомно - силовой микроскопии могут плодотворно сотрудничать , чтобы раскрыть новые механизмы для контроля экспрессии генов, аналогично тому , что было достигнуто за нуклеосомой 17,18.

С момента открытия рибосомы 14-16, его структура была широко охарактеризованы в прокариот, дрожжей 19,20 21 и совсем недавно в человеческом 22, обеспечивая молекулярное описание механизмов на основе синтеза белка. Полисомы были первоначально признаны на мембране эндоплазматической сети, образуя типичные 2D геометрические организации 14. Как упоминалось ранее, полисом сборка не является объектом постоянного интереса как структуры рибосом. В прошлом полисома были изучены по существу Тгansmission ЭМ на основе методов. Только в последнее время , методы крио-ЭМ позволило 3D - реконструкция очищенных полисом из систем 23-26 перевода в пробирке, клеточные лизаты человека 27 или в клетках 28. Эти методы предложили более рафинированный информацию о рибосом-рибосома организации в полисом 23, 26-28 и предварительный молекулярный описание контактных поверхностей соседних рибосом зародышей пшеницы в полисом 24. Таким образом, крио-ЭМ томография позволяет раскрытие рибосом-рибосома взаимодействий с молекулярной подробно, но она обременена обширной постобработки и реконструкции аналитических исследований, которые требуют больших вычислительных ресурсов для обработки данных. Кроме того, чтобы получить молекулярную деталь рибосом-рибосома взаимодействий, весьма разрешены карту рибосомы требуется, и этот вид опорной рибосомы доступен только для нескольких видов. Важно отметить, что крио-ЭМ томография не в состоянии обнаружить свободную РНК. Therefруда, новые методы, необходимые для полного понимания организации перевода машин.

Помимо крио-ЭМ, AFM был также использован в качестве полезного инструмента для непосредственного получения изображений полисом в низших эукариот 29-33 и человека 27. По сравнению с ЭМ, AFM не требует фиксации образца или маркировки. Кроме того, измерения могут быть выполнены в почти физиологических условиях и с уникальной возможностью четко идентифицировать как рибосомы и обнаженные нити РНК 27. Визуализация отдельных полисом может быть выполнена относительно быстро, получая тысячи изображений на нано-разрешением с небольшим усилием постобработки по сравнению с обширной и тяжелой последующей обработки и анализа реконструкции требуется крио-ЭМ микроскопии. Следовательно, AFM обработки и анализа данных не нужны дорогостоящие рабочие станции и высокой вычислительной мощности. Таким образом, этот метод собирает информацию о polysomal формы, морфологические характеристики (например,высота, длина и ширина), рибосома плотности, наличие свободной РНК и число рибосом на полисом 27 с более высокой пропускной способности, чем крио-ЭМ. Таким образом, AFM представляет собой мощный и комплементарный подход к методам EM изобразить полисом 27.

Здесь мы представляем полный трубопровод от очистки к анализу данных, где AFM применяется к изображению и анализа мыши полисом мозга. Предлагаемый протокол сосредоточен на вопросах очистки и на точном осаждения полисом на слюде субстратов, которые используются для создания изображений АФМ. В дополнение к обычным анализа размеров частиц , которые могут быть легко выполнены с общим программным обеспечением , используемой AFM общности, ImageJ 34 плагин, называемый RiboPick, представлен для подсчета количества рибосом на полисом 27, 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Практика, используемые для получения тканей мыши были одобрены органом по защите животных (OPBA) Университета Тренто (Италия), протокол нет. 04-2015, согласно ст.31 Законодательного декрета нет. 26/2014. Все мыши были сохранены на модели Организма фонда Центра по интегративной биологии (CIBIO), Университет Тренто, Италия.

Внимание: Для того, чтобы избежать каких-либо деградации РНК из образцов, подготовить все буферы с использованием DEPC обработанной воды для минимизации загрязнения РНКазы.

1. Получение полисом из цельной Мозги

  1. Сбор тканей мозга (15 мин)
    1. Эвтаназии штамма дикого типа мыши C57BL / 6 с CO 2 удушья в течение 5 мин 36. Осторожно рассекают мозг из черепа 36, поместить ткани в 1,5 мл пробирку и сразу поместить его в жидкий азот. Хранить при температуре -80 ° С до использования.
  2. Приготовление лизата (30 мин)
    1. Распылите всю мозговую ткань, используяступки и пестика под жидким азотом.
    2. Передача около 25 мг порошка в микроцентрифужных трубки холодной и сразу же (во избежание размораживания пылевидного ткани) добавить 0,8 мл лизирующего буфера (см таблицу 1) и разрушить клетку с помощью пипетки вверх и вниз 25 раз быстрее.
    3. Отцентрифугировать пробирку при 12000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С, чтобы осадить клеточный дебрис.
    4. Передача супернатант в новую пробирку микроцентрифужных и держать трубку на льду в течение 15 мин.
    5. Отцентрифугировать пробирку при 12000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, чтобы осадить ядра и митохондрии.
    6. Передача супернатант в новую пробирку микроцентрифужных.
    7. Хранить надосадочную жидкость при температуре -80 ° С в течение не более 6 месяцев, или использовать его немедленно.
  3. Сахароза подготовка градиента и центрифугирования (2 ч и 30 мин)
    1. Вымойте ультрацентрифуг трубки экстенсивно с РНКазы без воды (диэтилпирокарбонатом обрабатывают водой (DEPC-вода) или коммерческих)d 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O раствор.
    2. Поместите пробирки на лед и добавляют 5,5 мл холодного 50% раствора сахарозы в нижней части каждой трубки (см таблицу 1 для растворов сахарозы). Осторожно добавьте 15% сахарозы раствор капель по капле, оставаясь близко к интерфазе, чтобы сохранить острый интерфазы до тех пор, пока трубка не будет полностью заполнена. Когда трубка полностью заполнена, закройте его резиновой пробкой, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
    3. В холодном помещении аккуратно сложить трубы горизонтально и держать ее в этом положении в течение 2 часов. По истечении этого времени, медленно выпрямить трубы обратно в вертикальное положение и поместить их на лед. Градиенты теперь готовы к использованию. В качестве альтернативы, подготовить градиент 15-50% сахарозы, используя обычный градиент прежний.
    4. В холодном помещении тщательно удалить 1,0 мл из верхней части градиента и наложения капли сахарозы по капле с цитозольного лизата (то есть, супернатант , полученный в STEр 1.2).
    5. Осторожно опустите трубки в ведра качается роторе. Центрифуга градиенты в течение 100 мин при 180000 х г при 4 ° С с использованием ультрацентрифуге.
    6. После центрифугирования, оставьте пробирки в свои ведра в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы позволить градиенты стабилизации.
  4. Сахароза градиента фракционирования (2 ч)
    1. Осторожно удалите одну Ультрацентрифуга трубку из ультрацентрифуге ротора и установите его на коллекторной устройстве с градиентом плотности фракционирования системы. Сбор 1 мл фракции мониторинга оптической плотности при длине волны 260 нм с UV / VIS детектора (смотри рисунок 1 верхняя панель). Держите собранные фракции на льду.
    2. Подготовка аликвоты 30-40 мкл фракций, представляющих интерес, держать их на льду перед хранением их при температуре -80 ° C до использования. Не используйте аликвот или фракции сахарозы , которые прошли более двух циклов замораживания-оттаивания (см рисунок 1 нижняя панель).
    </ Li>

2. Подготовка образцов для атомно-силовой микроскопии (3 ч)

  1. Используя ленту, шелушиться слюды.
  2. Вымойте слюды 3-4 раза с DEPC водой и поместить его в небольшую чашку Петри. Затем высушить поверхность с помощью воздуха.
  3. Накройте слюду с 200 мкл 1 мМ NiSO 4 и инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре.
  4. Удалите раствор никеля, а затем высушить поверхность с помощью воздуха. Выполнить все будущие шаги при 4 ° С, помещая чашку Петри с слюды на льду.
  5. Оттепель аликвоту полученного в 1.4.2 на льду и аккуратно добавьте все капли образца по капле на слюду. Использование 100-200 мкл наконечник, распространить образец на всей поверхности слюды. Инкубируйте образца на льду в течение 3 мин.
  6. Накройте падение слюда листа по каплям 200 мкл холодного буфера-AFM (см таблицу 1) и инкубировать в течение 1 часа на льду.
  7. Визуализации в жидкости
    1. Удалить тщательно Buffer-AFM и мыть слюды в 3-4 разаs с 200 мкл холодного буфера-AFM, чтобы удалить избыток сахарозы. Затем промыть слюды 3 раза холодным промывочного раствора (таблица 1), в результате чего поверхность слюды покрыта некоторыми микролитров раствора.
    2. Перейти к точке 3 (получение изображения).
  8. Визуализации в воздухе
    1. Осторожно снимите буферную AFM и мыть слюды 3-4 раза с 200 мкл холодного буфера-AFM, чтобы удалить избыток сахарозы. Затем промойте слюды 3 раза холодной промывочного раствора (см таблицу 1) и слить лишнюю воду , используя бумагу.
    2. Оставьте образец, чтобы высушить под химической капюшон с верхней части чашки Петри частично открытым. Через 2 часа, закрыть чашку Петри и хранить при комнатной температуре. Измерьте пробу через 2-3 ч, как они стабильны в течение многих лет.

3. Image Acquisition (15 мин на изображение после термической стабилизации)

Примечание: Полисомы иммобилизованные на слюде могут быть отображены в воздухе или в жидкости, используя режим переменного тока.

  1. Прикрепите слюду к держателю образца с помощью двусторонней клейкой ленты.
  2. Вставьте держатель образца на стадии AFM следующие инструкции производителя. При визуализации в жидкости, если это возможно, попытаться сохранить образец при температуре ниже 25 ° C, чтобы увеличить полисом стабильность во времени.
  3. Выберите кантилевера подходящий для работы с изображениями переменного тока и установите его на держателе наконечника следуя инструкциям изготовителя. При этом, использование кантилеверов с постоянной силой между 2-20 Н / м для работы с изображениями воздуха и около 0,1 Н / м для жидких визуализации.
  4. Отрегулируйте лазерное пятно на кантилевера и нулю квадранта сигналов детектора.
  5. Выберите подходящий частоты возбуждения и привода кантилевера с амплитудой 10-20 нм.
  6. Подход образца пока наконечник входит в зацепление с поверхностью.
  7. Выберите область сканирования 2х2 мкм, получают по меньшей мере 512x512 пикселов изображения (ширина пикселя <4 нм), выберите режим живого вычитание фона и Z масштаба 20-25 нм.
  8. Проверить тИзображением ищет наличие круглых объектов, характеризующихся высотой от 10 до 15 нм, при приобретении в воздухе и 25 и в жидкости 30 нм, когда он и ширину в интервале 25-30 нм. Регулировка уставки и обратной связи параметры, пока острые предметы не визуализируются. Фон должен появиться относительно плоский в хороших образцах, с некоторыми объектами 2-4 нм высота (см рисунок 2А и В).
  9. Если изображение выглядит хорошо (как указано в пункте 3.8), приобрести несколько (по крайней мере десять) 2х2 микрон сканирование на различных областях образца.
  10. (необязательный). При необходимости, получать изображения с высоким разрешением выбранных полисом (см рисунок 2в).
  11. Применить исправления программного обеспечения (вычитания плоскости и линии от онлайн-алгоритмы коррекции) для коррекции изображений AFM удаление произвольного наклона и дрейфующего эффекты.

4. Анализ данных (30 мин на изображение)

  1. Экспорт изображений в ImageJ (дополнительно: применять масштабный коэффициент) preferentially используя формат сжатия без потерь, например, формат TIFF (см Рисунок 3A).
  2. Используйте ImageJ макрос набор инструментов RiboPick.ijm (для копирования в подкаталоге макро / набор инструментов ImageJ) для подсчета рибосомы в полисом (рис 3B) и вычислить статистические свойства образца (рис 3C).
    1. Начало загрузки изображения с помощью <Read изображения> инструмент, который инициализирует программу.
    2. Выберите рибосомы центры со стандартным <Выбор точки> ImageJ инструмент (Shift + левый клик позволяет множественный выбор рибосом). Отметить выделенные рибосомы с <Все> рибосом инструмент. Рибосомы координаты будут отображаться в пользовательском текстовом окне.
    3. Добавьте больше рибосом к тому же полисом повторяющейся процедуре, указанной в пункте 4.2.2.
    4. Удалить отмеченные неправильно рибосомы с помощью <Отмена последнего подборщик> инструмент (начинает удаление из последнего добавленного рибосомы к первому212; в текущем полисом только).
    5. Когда полисом завершена, используйте <New> полисом инструмент. По мере того как число полисом добавляется в виде наложения на изображения, текстовое окно обновляется.
    6. Используйте кнопки <Сохранить результаты и закрыть> писать рибосома координат файл (единицы по умолчанию для изображения используются) и PNG изображение, где отборные рибосом и полисом. Исходное изображение закрывается без сохранения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сахароза градиента polysomal профилирование всего мозга мыши

Можно очистить полисом от клеточного лизата polysomal профилированием, отделяющего макромолекулы в соответствии с их веса и размера. С polysomal профилированием, цитоплазматические лизаты, полученные из культивируемых клеток или тканей, таких, как в этом примере, загружаются на линейный градиент сахарозы и с помощью ультрацентрифугирования, чтобы отделить свободную РНК из 40S и 60S субъединиц, 80S рибосом и полисом в соответствии с их коэффициентами седиментации ( На рисунке 1 верхняя панель). Оптическую плотность образца при длине волны 254 нм и сбора фракций позволяют выделение фракции сахарозы, обогащенной рибосомами или полисом с различным количеством рибосом в транскрипта. Фракции могут быть собраны, аликвоты для визуализации AFM и хранили при -80 ° С (рис 1нижняя панель).

Родные полисом от мозга мыши , наблюдаемого AFM в воздухе выявить узкие рибосом взаимодействия

Получение изображений осуществляется с использованием режима переменного тока (также известный как режим кратковременного нажатия). Эта модальность особенно хорошо подходит для получения изображения мягких образцов (например, полисом), поскольку взаимодействие зонд-образец, и соответствующие силы сдвига значительно снижается. Таким образом, и наконечник и образец сохраняются. AFM визуализация позволяет сбор данных с высоким разрешением, с точными значениями, которые зависят от различных факторов, таких как условия измерения, вид наконечника, а также свойств образца. В условиях, описанных в настоящем документе боковое разрешение около 4-6 нм и вертикальное разрешение 0,1-0,2 нм достижимы. После осаждения сахарозы аликвот на слюде, AFM содержит описания отдельных полисом, чтопоявляются как кластеры плотно упакованных рибосом (Фигура 2А, С и С). При анализе сечения (рис 2D), высота рибосомных пиков составляет около 14 нм , в соответствии с тем, что было ранее отмечено для рибосом человека в полисом после сушки на воздухе 27. От центра до центра расстояния рибосом , идентифицированных профилем линии составляет 23 нм, что согласуется с размерностью рибосом в растворе 37, 38.

Число рибосом в полисом из одной фракции показывает монодисперсных распределение

На фиг.3А сообщает типичный AFM изображение , полученное путем получения образца , адсорбированный на слюде из фракции градиента сахарозы. На вставке показан цифровой зум одного полисом, с коэффициентом увеличения, пригодного для идентификации ribosOmes в полисом. Панель В показывает то же самое изображение после идентификации рибосом с макро RiboPick. Красные круги (вставка) отмечают рибосомы и прогрессивное число (бирюзового) используется, чтобы помочь ассоциация рибосомы координат с определенной полисом. Частотное распределение числа рибосом на полисом анализировали на содержание фракции # 10 (см Figure1, нижнюю панель, что соответствует средней молекулярной массы полисом (MMW)), которая ясно показывает один пик (панель C, серые столбики). Экспериментальное распределение снабжали гауссовой кривой (черная линия), которая была центром в 5,8 рибосомы / полисом, со стандартным отклонением 1,3 рибосом / полисом.

Рисунок 1
Рисунок 1. Представитель Профиль абсорбцию градиенте сахарозы осаждении всего мозга мыши. (Верхний рАнель) А polysomal цитоплазматический лизата получали из мозга Р27 мыши и загружают на линейный градиент сахарозы (15-50% сахарозы [вес / объем]). Можно наблюдать четкие пики, соответствующие оптической плотности при длине волны 254 нм в RiboNucleoParticles (RNP), рибосомных субъединиц (40S и 60S), рибосомы (80s) и полисом. Для того, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания образцов перед нанесением AFM на слюду, удобно разделить на аликвоты и фракцию рибосом и polysomal фракции (нижняя панель) с разным количеством рибосом в стенограмме (то есть, с низким, средним и высоким -molecular весом полисома (НММ, MMW, HMW и, соответственно)). Аликвоты можно хранить при температуре -80 ° С в течение в течение двух лет.

фигура 2
Рисунок 2. Изображения полисом мозга с помощью врезки-Mode атомно - силовой микроскопии. (А) Пример АСМ - изображения MMW поли мозгаСомс после поглощения на слюду с использованием линейного серого цветовую гамму. (В) То же изображение , показанное в (А) изображен с использованием различный Z-диапазонов для цветовой шкалы: 0-0,5 нм серого для фона, 0,5-2 нм и 2-10 нм желтый для рибосом. В этом случае лучше визуальный контраст получается и для объектов с низким и высоким Z радиуса действия. (С) Увеличение типичного MMW полисом с профилем поперечного сечения (пунктирная белая линия). (D) , высота профиля двух рибосом , определенных поперечного сечения профиля в (С) показывает рибосом высоту 14 нм. Это значение согласуется с тем, что наблюдалось ранее в AFM для рибосом человека в полисом 27.

Рисунок 3
Рисунок 3. Пример подсчета количества рибосом на полисом в MMW полисом мозга. (А) АФМ изображение , которое представисентов на вход ImageJ макроса, RiboPick. (В) После того, как вручную выбирать каждый рибосомы за полисом, знаки RiboPick в изображении положения каждого рибосом (красные кружки). (С) Полученное число рибосом на полисом могут быть нанесены в качестве распределения , которые могут быть установлены с кривой Гаусса. Число полисом, рассмотренных в данном примере 164, получают из 9 независимых изображений. Фитинг с кривой Гаусса возвращает среднее значение популяции полисом во фракции MMW (# рибосомы / полисом 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99).

<TR>
буфер Состав заявка
лизирующего буфера 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 Приготовление лизата (1,1)
10 мМ NaCl
10 мМ MgCl 2
1% Triton-X100
1% Na-дезоксихолат
0,4 Ед / мл РНКазы Ингибитор
1 мМ ДТТ
0,2 мг / мл циклогексимида
5 ед / мл ДНКазы I
50% раствор сахарозы 50% (вес / объем) сахарозы в Сахароза подготовка градиента (1.2)
100 мМ NaCl
10 мМ MgCl 2
10 мМ Трис / HCl, рН 7,5
15% раствор сахарозы 15% (вес / объем) сахарозы в Сахароза подготовка градиента (1.2)
100 мМ NaCl
10 мМ MgCl 2
10 мМ Трис / HCl, рН 7,5
Никель Решение 1 мМ NiSO 4 Подготовка образца для атомно-силовой микроскопии (2)
Buffer-AFM 100 мМ NaCl Подготовка образца для атомно-силовой микроскопии (2)
10 мМ MgCl 2
100 мкг / мл циклогексимида
10 мМ Hepes
3% (вес / объем) сахарозы, рН = 7,4
промывочный раствор DEPC-вода Подготовка образца для атомно-силовой микроскопии (2)
100 мкг / мл циклогексимида

Таблица 1. Буферы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По мере того как структура ДНК была доказана, чтобы иметь первостепенное значение для описания процесса транскрипции и как организация хроматина продвинули наше понимание транскрипционный контроль экспрессии генов, необходимо проанализировать организацию и структуру полисом, чтобы улучшить правдивой понимание перевода и его регулирование.

С помощью описанного протокола, оптимальная плотность полисом мягко иммобилизованных на плоскую поверхность, подходит для получения изображения AFM получается. Используя эти условия, с удобным подготовленных образцов, около 50 полисом в час могут быть приобретены, готовы для дальнейшего анализа и определения характеристик. Кроме того, высушенные образцы, хранящиеся при комнатной температуре оказались пригодны для работы с изображениями после более одного года.

Для того, чтобы успешно получить полисом изображений с нашим протоколом, есть некоторые важные шаги: использовать ткани, которые были надлежащим образом быстро замораживали сразу после того, как dissectioN и хранили при -80 ° С для минимизации деградации РНК; использовать буфер для лизиса, содержащего циклогексемида и РНКазы ингибиторов, чтобы избежать диссоциации рибосом от мРНК; для выполнения всех инкубацию на льду во время осаждения образца на слюду; и при подготовке пробы для AFM изображений на воздухе, чтобы тщательно промыть образец на слюде с буферами и РНКазы свободной воды в присутствии циклогексемида. Последний пункт особенно важен. Если изображение содержит гладкие поверхности приблизительно на правильной высоте, но 100-1000 нм в ширину, это явный признак плохо промытого образца (часто рибосомы / полисом можно по-прежнему наблюдаются как слабые, внедренные объекты). Способ решить эту проблему, нужно повторить процедуру промывки, но это обычно не смягчать проблемы на уже высушенного образца. В этом случае стоит еще раз, начиная с новой аликвоты.

Учитывая разрешение AFM, этот метод для изучения полисом не может разрешить STRUCтурные детали рибосомных интерфейсов в полисом. На самом деле, AFM является дополнительным и более простой подход к крио-ЭМ, что представляет собой эффективную и надежную технику, приобретать и анализировать тысячи полисом, и лучше понять общую организацию рибосом в полисом. Важно отметить, что этот протокол имеет уникальное преимущество идентификации нитей , совместимых с РНК 27. Это та же процедура может быть использована для любого образца polysomal, полученной из любой биологической ткани или клеточной линии. Что еще более важно он также может быть успешно использован для получения информации транскрипта конкретного использованием ин витро системах перевода, как это недавно продемонстрировано Лория и его сотрудниками 35. Эта методика откроет путь для нескольких экспериментов, чтобы получить понимание кинетики полисом формирования или изменения в организации полисом в различных клеточных или тканевых условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cycloheximide Sigma 01810 Prepararation of lysate
DNAseI Thermo Scientific 89836 Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor Life technologies EO-0381 Prepararation of lysate
DEPC Sigma 40718 Prepararation of lysate
Triton X100 Sigma T8532 Prepararation of lysate
DTT Sigma 43815 Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate Sigma D6750 Prepararation of lysate
Microcentrifuge  Eppendorf 5417R Prepararation of lysate
Sucrose Sigma S5016 Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima LE-80K Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter SW 41 Ti Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube Beckman Coulter 331372 Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System  Teledyne Isco 67-9000-176 Sucrose gradient fractionation
AFM Asylum Research Cypher Polysome visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  2. Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59, (1), 48-62 (1995).
  3. Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
  4. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  5. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
  6. Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145, (3), 383-397 (2011).
  7. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
  8. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  9. Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54, (1), 147-155 (2014).
  10. Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9, (4), 1256-1264 (2014).
  11. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (36), E3815-E3824 (2014).
  12. van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15, (1), R6 (2014).
  13. Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34, (14), 1905-1924 (2015).
  14. Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1, (1), 59-68 (1955).
  15. McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45, (9), 1437-1447 (1959).
  16. Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2, (197), 430-435 (1963).
  17. Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (47), 20317-20322 (2010).
  18. Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32, (33), 8390-8396 (1993).
  19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, (5481), 905-920 (2000).
  20. Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102, (5), 615-623 (2000).
  21. Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334, (6062), 1524-1529 (2011).
  22. Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497, (7447), 80-85 (2013).
  23. Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
  24. Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
  25. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42, (14), 9461-9469 (2014).
  26. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43, (1), 618-628 (2015).
  27. Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208, (5), 581-596 (2015).
  28. Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
  29. Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378, (5), 363-372 (1997).
  30. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46, (6), 503-506 (1997).
  31. Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
  32. Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
  33. Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  35. Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. (2015).
  36. Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
  37. Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
  38. Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics