Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Тонкая настройка регуляции транскрипции генов лежит в основе эмбриональных клеток решения судьбы. Здесь мы опишем иммунопреципитации хроматина, используемые для изучения эпигенетической регуляции как сердца дифференцировки стволовых клеток и развития сердца эмбрионов мыши.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Конкретная транскрипции гена является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Биологический процесс опосредуется факторами транскрипции, которые связывают геномных регуляторных областей, включая усилителями и пропагандистов сердца конститутивных генов. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергают химической модификации. Модификации гистонов дополнительно приводят к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов, в результате чего еще один уровень тонкой регуляции настройки транскрипции генов. Эмбриональные стволовые клетки (ES - клетки) резюмировать в эмбриональных телец (т.е. клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних ступенях развития сердца. Они обеспечивают в принципе достаточно материала для иммунопреципитации хроматина (CHIP), технология широко используется для идентификации генов регуляторных областей. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человека из кардиогенеза. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяютисследуя конкретные эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или брелка-секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.

Introduction

Сердце является первым органом, который будет сформирован и стать функциональным в зародыше. Сердце строится из многих клеточных клонов , которые вытекают из первого и второго полей эмбриональных сердца 1. От после оплодотворения бластоцисты стадии до форме сердца, эмбриональные клетки имеют, таким образом, чтобы принимать множество решений клеточных судеб. Транскрипции генов регулируется в во времени и пространстве-зависимым образом и является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Такой процесс опосредовано специфическими факторами транскрипции, которые связываются регуляторные области в пределах генома, включая энхансеры и промоторы генов сердечных конститутивные. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергаются модификации, такие как ацетилирование, метилирование, убиквитинилирование, и / или фосфорилирования. Модификация гистонов приводит к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов в зависимости от которой остаток лизина гистона модифицированного 2.

jove_content "> иммунопреципитации хроматина анализ (ЧИП) была создана лет назад 3 и в настоящее время является наиболее широко используемой технологией с целью выявления целей либо модифицированных гистонов или транскрипционных факторов 4. Следуя иммунопреципитации гистонов или факторов транскрипции, связанной ДНК может быть либо усиливается с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенировали. ЧИП имеет технически преодолеть более сложные гель замедляющие анализы 5. Однако ЧИП не подразумевает прямого связывания фактора транскрипции с ДНК, преимущество геля замедляющей анализа. с другой стороны, чиповых в сочетании с секвенирования ДНК открыло новую геному перспективу регуляции генов.

ES - клетки (ES - клетки) резюмировать в эмбриональных органов (то есть., Клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних стадиях развития сердца 6 и обеспечить в принципе достаточно материала для микросхеме. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человеческого Саrdiogenesis хотя их кардиогенный потенциал зависит от их эпигенетической подписи 7. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяют исследовать специфические эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Тем не менее, геном расшифрован таким образом , 8 типоспецифичной затрат времени и клеток. Эпигенетическая регуляция транскрипции генов должен быть изучен в локализованных областях. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ДНК-белок Сшивание

  1. Фикс в 15 мл пробирки заготовленные-ES - клетки (2 × 10 6 клеток для регулярного Чипа, 2 х 10 5 клеток для микрочипом), эмбриональные тельца (ЭТ) , полученные из клеток ES и эмбриональных тканей сердца расчлененный из эмбрионов мыши E9.5 (атриовентрикулярная канал, тракт оттока и желудочки) с использованием 1% формальдегида в PBS для клеток или в пермеабилизации PB2 буфере для эмбриональных тканей. Место труб на орбитальном шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение ровно 10 минут.
  2. Остановить реакцию сшивки путем добавления глицин до конечной концентрации 125 мМ и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту.

2. лизиса клеток и хроматина Фрагментация

  1. Промыть дважды сшитых клетки ресуспендировали в 10 мл PBS 1X или эмбриональные ткани ресуспендировали в 1 мл PB2. Центрифуга при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откажитесь от супернатантов. </ Li>
  2. Добавить ингибиторы протеазы в буфер PB1 или PB2 (2 мкг / мл лейпептина, 1 мкг / мл апротинина, и 0,1 мМ ФМСФ) (таблица 1). Ресуспендируют осадок клеток или эмбриональных тканей, полученной на стадии 2.1, в 1 мл буфера PB1 или PB2 соответственно. Пипеткой вверх и вниз и ресуспендирования клеток или тканей. С помощью 1 мл шприц с иглой 21 калибра гомогенизировать клеток или ткани. Инкубируют при температуре 4 ° С (на колесе) в течение 10 мин.
  3. Спин вниз при 3000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
  4. Ресуспендируют осадок в 300 мкл соответствующих буферов SB (таблица 1) , дополненной ингибиторами протеазы в чистую пробирку (Гарантированный RNase-, DNase- и апирогенной) для предотвращения какого - либо ухудшения ДНК. Инкубируют в течение 15 30 мин на льду.
  5. Разрушать ультразвуком образцы при температуре 4 ° С для сдвига хроматина с помощью обработки ультразвуком в соответствии с программами , перечисленных в таблице 2 , для каждого материала. Отрегулируйте продолжительность обработки ультразвуком в зависимости от следующего приложения (<EM> т.е., PCR или секвенирование). Жакет размер ДНК должна быть около 500 пар оснований для ПЦР и 300 пар оснований для секвенирования.
  6. Центрифуга обрабатывали ультразвуком клеточный лизат в течение 10 мин при 6000 х г при температуре 4 ° С, передавать супернатант (хроматина) в чистую 1,5 мл трубки и выбросить осадок.
  7. Развести хроматина в растворе (супернатант буфер В) в течение 10 раз водой и оценки оптической плотности с использованием 1,5 мкл в нано-спектрофотометре. Получить концентрацию белков в мкг / мкл с использованием следующей формулы: 1,55 х OD 280 - 0,76 х OD 260.
буфер использование Состав материалы
пермеабилизирующего PB1: 5 мМ PIPES pH 8; 85 мM KCl; 0,5% NP40 Все
PB2: 15 мМ HEPES, рН 7,6, 15 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2 60 мМ KCl, 0,5% Тритон Х-100 эмбриональной ткани
В Лизис / Озвучивание SB1: 1% ДСН; 10 мМ ЭДТА; 50 мМ Трис-HCl, рН 8 ESC
SB2: 50 мМ HEPES-KOH pH7.9; 140 мм; 1mM ЭДТА; 0,1% дезоксихолат; 0,1% ДСН ЭТ
SB3: 15 мМ HEPES, рН 7,6, 15 мМ NaCl, 60 мМ КСl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA; 1% Triton-X100, 0 0,1% ДСН, 0,5% laurylsarcosine эмбриональной ткани
С буфер чИП 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА; 0,5% NP40; 1% Triton-X100. Все
D ДНК / белок Элюирование D1: 1% ДСН; 100мМ NaHCO 3
D2: 50 мМ Трис, рН 7,6 / 5 мМ ЭДТА, 15 мМ ДТТ, 2% ДСН
Е ДНК-связывающие препарат шарики Е: 20% ПЭГ 8000; 2,5 М NaCl; 10 мМ Трис-HCl, рН 8; 1mM ЭДТА

Таблица 1. ChIP буферы.

материал программа Ультразвуком
Эмбриональные стволовые клетки 15 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек
эмбриональных телец 30 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек
Эмбриональные ткани 21 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек

Таблица 2. Ультразвуком Программы.

3. иммунопреципитация иПримочки

  1. Промыть 3 раза белок А-конъюгированные бусинки буфером С. Взять 100 мкл бусин в чистой 1,5 мл пробирку и добавляют 1 мл буфера С (таблица 1). Трубку затем переносят на магнит; ждать в течение 1 мин и аспирата супернатант. Повторите дважды этап промывки.
  2. Выдержите в антителе , выработанном против модифицированных гистонов или фактора транскрипции (концентрации приведены в таблице 3) с 20 мкл промытой белка конъюгированного бусин и 1 мл буфера С , дополненной ингибиторами протеазы в чистую 1,5 мл трубки. Набор образцов на ротатор при 40 оборотах в минуту в течение по крайней мере 2 часов при температуре 4 ° С.
  3. Вымойте антитело-бусинки комплексы 3 раза с 1 мл буфера С (манипуляции описаны в разделе 3.1).
  4. Подготовьте 2 трубки, одна из которых содержит 150 мкг хроматина и антител бусинок комплексов, а другой трубки, содержащей 150 мкг хроматина и 20 мкл промытых бус; Добавить 1 мл буфера C, дополненных с ингибиторами протеазы в каждую пробиркуи инкубировать образцов на вращающемся колесе при 40 оборотах в минуту в течение ночи при температуре 4 ° С.
    Примечание: Концентрация хроматина должна быть не менее 300 мкг для иммунопреципитации фактор транскрипции или для последовательного микросхеме.
стандарт концентрация (нг / мкл) Объем (мкл) Общая концентрация ДНК (нг)
10,0 1 10,0
В 5.00 1 5.00
С 2.50 1 2.50
D 1,25 1 1,25
Е 0.625 1 0.625
F 0,3125 1 00,3125
г 0.156 1 0.156
ЧАС 0.0 1 0.0

Таблица 3. Стандарты концентрации.

4. ДНК элюирования, Перекрестная ссылка Сторнирование и протеиназы К Пищеварение

  1. Набор образцов в магнитном стойке. Восстановление супернатант, содержащий несвязанного хроматина антитела.
    Примечание: Образцы могут быть быстро замораживали в жидком азоте на этом шаге и хранили при -80 ° С. Хроматина могут быть использованы в других иммунопреципитации с другими антителами. Промыть каждый образец 3 раза по 1 мл буфера С (манипуляционных описано ранее).
  2. Элюции антитело-связанный белок путем добавления 150 мкл буфера для D1 или D2 , если последовательный чип должен быть сделан (таблица 1) к промытым ChIP материалов и инкубировать образцов в течение 20 мин при 50 ° С в нагревательном блоке.
  3. Удалить из пробиркинагревательный блок и поместить образцы в магнитной стойке, восстановить супернатант в чистую 1,5 мл трубки (сертифицированный RNase-, DNase- и пирогенов) и отказаться от бортов.
  4. Используйте супернатант для последовательного ChIP добавлением от 1 до 3 мкг второго антитела в 2 объемами буфера C или обратного сшивок добавлением 5 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию 200 мМ.
  5. Подготовьте входной образец хроматина в чистом 1,5 мл трубки (Гарантированный RNase-, DNase- и апирогенной) принимать такое же количество хроматина, как и у образца IP (150 мкг) в конечном объеме 150 мкл воды, (РНКазы ДНКазы вода). Добавьте 5 М NaCl до конечной концентрации 200 мМ. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 65 ° С.
  6. На следующий день, удалить образцы из нагревательного блока, добавляют 250 мМ ЭДТА, чтобы получить конечную концентрацию 12,5 мМ и протеиназы К, чтобы получить конечную концентрацию 250 мкг / мл в микросхеме материала и переваривают при 55 ° С в течение 2 часов в Китайской нагревательный блок.

  1. Приготовление шариков
    1. Начинают приносить бусинки при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 мин, вихревые гранулы очень тщательно. Бусинки осесть, поэтому работать быстро, когда пипеткой. Передача 1 мл шариков в чистую 1,5 мл трубки (сертифицировано RNase-, DNase- и апирогенной).
    2. Установить на магните, подождите в течение 2 - 3 мин для раствора для уточнения, сброшенных супернатанта. Удалить из магнита, добавляют 1 мл 0,5 М ЭДТА и перемешать с помощью краткого встряхиванием.
    3. Повторите шаг 5.1.2 дважды, и отбросить супернатант в конце.
    4. Удалить из магнита, добавьте 1 мл буфера Е и медленно ресуспендирования бисером. Перенесите всю смесь (шарики в буфере E) в 50 мл буфера E. Место на шейкере и дайте ему смешивать медленно при комнатной температуре в течение 1 ч.
    5. Тест ДНК-связывающий бусинки следующий протокол очистки, описанной ниже, с использованием 3 условий эксперимента: 50 мкл бус / 50 мкл ДНК (1 объем / объем): 1 100 мкл бус/ 50 мкл ДНК (2 тома / 1 объем) и 125 мкл шариков / 50 мкл ДНК (2,5 объема / 1 объем). Пусть мигрировать очищенную ДНК на агарозном геле 1,5% , чтобы проверить размер фрагментов (рис 1А).
  2. ДНК Очистка
    1. Добавить 425 мкл (2,5 объемов) ДНК-связывающим магнитных шариков для каждого образца ДНК (приблизительно 170 мкл). Ресуспендируют медленно пипетированием вверх и вниз (примерно в 10 раз) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
    2. Поместите на магнит в течение 5 мин, затем аспирата супернатант и выбросьте (на магните).
    3. Добавьте 600 мкл свежеприготовленного 80% этанола в пробирку на магнит, подождите в течение 1 мин, аспирация супернатант и выбросьте, а затем повторите предыдущий шаг еще раз.
    4. Дайте быстрый спин, в течение 5 сек (микроцентрифуге), поместите трубку на магнит и удалить последние капли этанола. Дайте высохнуть в течение 1 мин при комнатной температуре
    5. Элюции ДНК путем добавления 20 мкл ДНКазы РНКазы свободной воды. Удалить из магнита и вихрь образца.
    6. Выдержите в течение 3 мин при комнатной температуре, а затем поместить образцы на магните. Отберите элюировали ДНК в новую пробирку (сертифицированный RNase-, DNase- и без пирогенов).
    7. Запуск ДНК из входной фракции на агарозном геле 1,5% , чтобы проверить размер фрагментов ДНК (рис 1В).

6. ДНК Количественное Использование флуоресцентной детекции инструмента

  1. Серийно разбавить в воде в концентрации 1 мкг ДНК (1 т.п.н. лестничного) с получением в общей сложности 7 разведений плюс точка не-ДНК (разведений , собранные в таблице 3).
  2. Приготовьте раствор PCR Green I красителя, достаточный для всех образцов (очищенной ДНК и стандартных разведений АГ): разбавьте 10,000x зеленый краситель в буфере 1x TE.
  3. Добавляют 1 мкл каждого ДНК (ДНК очищали и стандартных разведений AH) до 10 мкл 1x смесь зеленого красителя в капиллярах кюветах следует читать в флуориметре при 488 нм. Для анализа не-ДНК, используют 1 мкл буфера 1x TE.
  4. строитькалибровочную кривую с использованием графического программного обеспечения и определения относительных концентраций в диапазоне образцов ДНК в нг / мкл. Затем ДНК готов для ПЦР или сделать библиотеки секвенирования.

7. ПЦР

  1. Выбор праймеров
    1. Дизайн праймеров, представляющие интерес для допросить геномных областей, представляющих интерес. Дизайн праймеров для амплификации усиливающие областей генов с использованием генома браузера УСК. Расширители далее предсказаны с использованием H3K4me1 или р300 Обломок-9 SEQ данных , имеющихся в наборе данных GEO.
  2. ПЦР
    1. Реакции Запуск ПЦР в течение 45 циклов (8 сек 95 ° С, 8 сек 60 ° С, 8 сек 72 ° C) с использованием ПЦР в реальном времени Термоциклер в 25 мкл смеси зеленого красителя, 2 нг ДНК, и смешать праймер 0,5 мкл (20 мкМ раствор) 10.
  3. Анализ обогащения
    1. Подсчитайте Абсолютное обогащение , предполагая , что не более чем 1% от нуклеосом иммунопреципитировали 11.
    2. ConsideR геномный, как обогащенный, если 10 образцов нг IP показывают большее обогащение по сравнению с 0,1 нг входной ДНК.
    3. Экспресс результаты как кратное увеличение обогащения над необогащенных области после нормализации на входе и корректировки с неспецифическим контрольным образцом.
    4. Рассмотрим входной ДНК быть разбавлен 100 (коэффициент разбавления или DF).
    5. Нормализация вход , используя следующее уравнение 2 -ΔCt х 100%, где -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input х DF].
    6. Настройка управления с помощью следующего уравнения (& Delta; CТ [IP] -ΔCt [NS]), где NS является неспецифическим образца (без антитела IP или IgG IP).
    7. Вычислить кратное обогащение образца как 2 -ΔΔCt. Файл, включая все этапы расчетов с формулами, в которых только каждый образец ПЦР можно ввести облегчит анализ результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фигура 1А иллюстрирует первый получение шариков ДНК-связывающих и контроля качества с использованием ДНК разных размеров (1 кб зачёт). 0ne, 2 и 2,5 объема (от 1 до 3) из бисера добавляли к одному объему образца для очистки высоких и низких фрагментов ДНК размером молекул.

Фигуры 1 В, С, D являются типичными примерами гелей ДНК из всей обработанной ультразвуком ДНК , извлеченной из ЭС клеток мыши, эмбриональных телец или сердечной эмбриональной области (объединенном 25 E9.5 желудочки), соответственно.

Когда ES клетки дифференцируются в сторону судьбы клеток сердца, они транзитом сначала через mesendodermal, а затем состояние мезодермы. Такой путь развития включает в себя этап, посредством которого эпителиальные клетки должны пройти epithelio-мезенхимальных перехода

фигура 2

Дифференциация гены имеют двухвалентные домены в ES клетках 12. Их 5 'UTR области, близкие к их промоутеров действительно заняты как H3K4me3 хроматина активирующий марки и H3K27me3, вытесненного знака. Эти метки изменяются , когда клетки сталкиваются с проблемой морфогенов таких , как BMP2 7. Эти знаки, однако, различно в зависимости от ЭС клеток линии человекаS , вероятно , из - за оригинального бластоцисты они получают от даже тогда , когда недифференцированные (рисунок 3).

Протоколы, описанные выше, пригодны для ChIP секвенирование даже начиная с низкого количества материала; Эксперименты проводились ChIP из хроматина , извлеченной из AVC, OFT и желудочки эмбрионов мыши E9.5 для того , чтобы раскрыть новые гены и усилители играют определенную роль в определении идентичности этих специфических сердечных областей. На рисунке 4 показано 2 геномных областей миокарда генов желудочек E9.5 мыши обогащены ацетилированного H3K27 и одного кардиостимулятора-специфического (то есть., не желудочков) ген не обогащается ацетилированного H3K27.

Рисунок 1
Рисунок 1. Электрофорез данных: ДНК-связывающие Бисер Проверка и Ультразвуком Validation. (А) ДНК очищают с помощью ДНК-связывающих бусин, 1 объем бусин / 1 объем ДНК (1) и 2 объемов бусин / 1 объем ДНК (2) и 2,5 объем бусин / 1 объем ДНК (3). Размер фрагментов ДНК , полученных после того, как обратного поперечную сшивку входных фракций ЭС клеток мыши (В), эмбриональных тельцах (С), и эмбриональной сердечной ткани (D). Образцы были выполнены на 2% агарозе гелей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. ЧИП анализа данных. (A) Обогащение H3K27ac эпигенетической метки на E-кадгерина Усилители / промотор (A - E регионы) (B) Обогащение H3K4me1, H3K36me3 и H3K9me2 epige.магнитные метки на Twist / Усилители промотора (AC областей). Геномные области усиливаются кПЦР для измерения обогащения гистонов против ввода следующего микросхеме. Результаты являются средством ± SEM из 3 экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Последовательное микросхеме. Хроматина экстрагировали из 4 -х линий клеток ES человека и ЧИП проводили последовательно с использованием анти H3K4me3 , а затем анти-H3K27me3 антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. генов Nkx2.5 и Tbx5 , обогащенных модифицированного гистона и одной геномной области Shox2 ЭКС-специфического гена не обогащается и не выражен в желудочке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetics стала важной областью исследований в области биологии развития. Как генетическая программа активируется в эмбриональных клетках, чтобы позволить клеткам приобретать определенную идентичность в эмбриональном линии был в течение длительного времени является ключевым вопросом для биологов развития.

ЧИП был широко использован в течение последних лет, и в сочетании с секвенирования ДНК следующие улучшения разрешения секвенирования. Это стало мощным средством для того, чтобы исследовать в геноме широкий зависимым способом эпигенетической ландшафт клеток или специфических эмбриональных и взрослых тканей. Кристаллодержателя анализа буферы и условия обработки ультразвуком были значительно улучшены, чтобы позволить анализы для небольшого количества биологического материала. Это включает в себя конкретные регионы эмбриональных сердец, полученных микродиссекции или путем FACS отсортированных клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок-репортер. Действительно ЧИП проводили на популяции гетерогенных клеток 13 14 можетпривести к ошибочным результатам, которые трудно интерпретировать. Эпигенетическом подписи метки очень точно клеток популяции. Эта подпись придает им определенный потенциал дифференциации и определяет их судьбу. Таким образом, важно работать с очищенными населения (сортируется) клеток или вскрытых эмбриональных тканей.

Мы описали выше надежных протоколов для достижения этих целей. Мы использовали эти протоколы для Обломок-PCR, чиповых на чипах 7, 10 или брелка-секвенирования (рисунок 4, рукопись в процессе подготовки). Причина лежит робастности на пермеабилизирующего и лизис клеток буферов, которые были оптимизированы, чтобы обеспечить полную ячейку и ядерной лизиса и эффективную хроматина ультразвуковую обработку. Протоколы, таким образом, могут быть использованы для небольшого количества эмбриональных тканей.

Ограничения этих протоколов присущи микросхеме. Более конкретно, пространственное разрешение не очень высока с размерами ДНК около 500 п.о.. Каккогда - либо, она позволяет исследовать динамику бивалентных доменов в дифференциации клеток ES 7 и выявить различия в обогащении модифицированных гистонов на генных EMT регуляторных областей в дикого типа или клеток ген-мутировали. (Рисунок 2). Глубокое секвенирование ДНК иммунопреципитации (рисунок 4) частично преодолевает это ограничение.

Обогащение конкретной области генома следующего иммунопреципитации фактора транскрипции, не указывает точно, что фактор напрямую связывается с ДНК. Это может быть только частью сложного завода связывается с ДНК. Это важный момент, чтобы быть в курсе о. В отличие от этого, гель заторможенность анализ может быть использован для решения вопроса.

Имея в руках технологии в сочетании с глубоким секвенирования позволяет контролировать широкий геном геномные области, занятые транскрипции факторов или конкретной марки гистонов. Технология улучшается и позволяет допрашивать только СМАпопуляции клеток Л.Л. 15. Таким образом, она открывает новые возможности в динамике конкретных эпигенетических ландшафтов во время эмбрионального развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics