भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और ऊतकों के हृदय भेदभाव के Epigenetic विनियमन

Developmental Biology

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Summary

जीन प्रतिलेखन के ठीक ट्यूनिंग विनियमन भ्रूण सेल भाग्य निर्णय underlies। इस के साथ साथ, हम chromatin immunoprecipitation स्टेम कोशिकाओं और माउस भ्रूण की हृदय विकास के दोनों हृदय भेदभाव के epigenetic विनियमन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया assays का वर्णन है।

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Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

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Abstract

विशिष्ट जीन प्रतिलेखन एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है कि भ्रूण के विकास के दौरान सेल भाग्य के फैसले के पीछे भी है। जैविक प्रक्रिया प्रतिलेखन कारक हैं जो enhancers और हृदय विधान जीनों के प्रमोटरों सहित जीनोमिक विनियामक क्षेत्रों बाँध द्वारा मध्यस्थता है। डीएनए histones कि रासायनिक संशोधनों के अधीन हैं चारों ओर लपेटा जाता है। histones का संशोधन आगे, दमित सक्रिय या तैयार जीन प्रतिलेखन के लिए नेतृत्व इस प्रकार जीन प्रतिलेखन के ठीक ट्यूनिंग विनियमन का एक और स्तर पर लाने। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते कोशिकाओं) embryoid निकायों (यानी, सेल समुच्चय) हृदय के विकास के प्रारंभिक चरणों के भीतर या 2 डी संस्कृति में पुनरावृत्ति। वे क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के लिए सिद्धांत पर्याप्त सामग्री में प्रदान करते हैं, एक तकनीक मोटे तौर पर जीन विनियामक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। इसके अलावा, मानव ES कोशिकाओं कार्डियोजेनेसिस की एक मानव कोशिका मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। विकास के बाद के चरणों में, माउस भ्रूण के ऊतकों के लिए अनुमतिविशिष्ट epigenetic सेल पहचान के निर्धारण के लिए आवश्यक परिदृश्य की जांच। इस के साथ साथ, हम चिप, अनुक्रमिक चिप के प्रोटोकॉल पीसीआर या चिप अनुक्रमण ते कोशिकाओं, embryoid निकायों और हृदय विशिष्ट भ्रूण क्षेत्रों का उपयोग करके किया वर्णन है। इन प्रोटोकॉल हृदय जीन प्रतिलेखन के epigenetic विनियमन की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।

Introduction

दिल पहला अंग का गठन किया जाना है और भ्रूण में कार्यात्मक बन गया है। दिल में कई सेल प्रजातियों कि पहले और दूसरे भ्रूण दिल क्षेत्रों 1 से उठता से बनाया गया है। से पोस्ट-निषेचन ब्लास्टोसिस्ट आकार का दिल करने के लिए मंच, भ्रूण कोशिकाओं इस प्रकार कई सेल भाग्य का निर्णय करना है। जीन प्रतिलेखन एक समय और अंतरिक्ष पर निर्भर ढंग से विनियमित और एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है कि भ्रूण के विकास के दौरान सेल भाग्य के फैसले के पीछे भी है। इस तरह की एक प्रक्रिया विशिष्ट प्रतिलेखन कारक हैं जो enhancers और हृदय विधान जीनों के प्रमोटरों सहित जीनोम के भीतर विनियामक क्षेत्रों बाँध द्वारा मध्यस्थता है। डीएनए histones कि इस तरह के एसिटिलीकरण, मेथिलिकरण, ubiquitinylation, और / या फोस्फोराइलेशन के रूप में संशोधनों के अधीन हैं चारों ओर लपेटा जाता है। हिस्टोन संशोधन, दमित सक्रिय या तैयार जीन के आधार प्रतिलेखन जिस पर हिस्टोन के लाइसिन अवशेषों 2 संशोधित किया गया है की ओर जाता है।

jove_content "> chromatin immunoprecipitation परख (चिप) को 3 साल पहले स्थापित किया गया है और आदेश या तो संशोधित histones या 4। प्रतिलेखन कारक histones या प्रतिलेखन कारक के immunoprecipitation के बाद के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए वर्तमान में सबसे मोटे तौर पर तकनीक का इस्तेमाल किया है, बाध्य डीएनए हो सकता है या तो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) से परिलक्षित या अनुक्रम। चिप तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण जेल मंदता assays 5 को दूर किया है। हालांकि चिप डीएनए, जेल मंदता परख के लिए एक लाभ के लिए एक प्रतिलेखन कारक के बंधन सीधा मतलब यह नहीं है। दूसरी ओर, चिप पर डीएनए अनुक्रमण के लिए संयुक्त जीन विनियमन पर एक नया जीनोम चौड़ा परिप्रेक्ष्य खोल दिया है।

ES कोशिकाओं (ते कोशिकाओं) embryoid शरीर के भीतर पुनरावृत्ति (यानी।, सेल समुच्चय) या 2 डी संस्कृति हृदय विकास 6 के प्रारंभिक चरणों में और चिप के लिए पर्याप्त सामग्री सिद्धांत में प्रदान करते हैं। इसके अलावा, मानव ES कोशिकाओं सीए की एक मानव कोशिका मॉडल का प्रतिनिधित्वहालांकि उनके हृदयजनित संभावित rdiogenesis उनकी epigenetic हस्ताक्षर 7 पर निर्भर करता है। विकास के बाद के चरणों में, माउस भ्रूण के ऊतकों विशिष्ट epigenetic सेल पहचान के निर्धारण के लिए आवश्यक परिदृश्य की जांच के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, जीनोम एक समय और सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से 8 में लिखित है। जीन प्रतिलेखन के Epigenetic विनियमन स्थानीय क्षेत्रों के भीतर का अध्ययन किया जाना है। इस के साथ साथ, हम चिप, अनुक्रमिक चिप के प्रोटोकॉल पीसीआर या अनुक्रमण ते कोशिकाओं, embryoid निकायों और हृदय विशिष्ट भ्रूण क्षेत्रों का उपयोग करके किया वर्णन है। इन प्रोटोकॉल हृदय जीन प्रतिलेखन के epigenetic विनियमन की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

1. डीएनए प्रोटीन पार से जोड़ने

  1. 15 मिलीलीटर ट्यूब में फिक्स काटा-ES कोशिकाओं (नियमित रूप से चिप के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं, माइक्रोचिप के लिए 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं), embryoid निकायों (ईबीएस) ES कोशिकाओं और भ्रूण दिल ऊतकों से उत्पन्न E9.5 माउस भ्रूण से विच्छेदित (एट्रियोवेंट्रीकुलर नहर, बहिर्वाह पथ और वेंट्रिकल) कोशिकाओं के लिए या भ्रूण के ऊतकों के लिए permeabilization PB2 बफर में पीबीएस में 1% formaldehyde के प्रयोग से। ठीक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 60 आरपीएम की गति कक्षीय प्रकार के बरतन पर ट्यूबों रखें।
  2. 125 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लाइसिन जोड़कर पार से जोड़ने प्रतिक्रिया बंद करो और 60 आरपीएम की गति कक्षीय प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।

2. सेल और chromatin विखंडन

  1. दो बार 10 में resuspended पार से जुड़े कोशिकाओं को धो लें मिलीलीटर पीबीएस 1x या भ्रूण के ऊतकों 1 मिलीलीटर PB2 में resuspended। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र। supernatants त्यागें। </ Li>
  2. प्रोटीज अवरोधकों PB1 या PB2 (2 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin, 1 माइक्रोग्राम / एमएल Aprotinin, और 0.1 मिमी PMSF) (तालिका 1) बफर करने के लिए जोड़ें। क्रमशः बफर PB1 या PB2 के 1 मिलीलीटर में सेल गोली या 2.1 कदम से भ्रूण ऊतक Resuspend। Pipet और नीचे और कोशिकाओं या ऊतकों resuspend। कोशिकाओं या ऊतक homogenize करने के लिए एक 21 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस (एक पहिया पर) 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3,000 XG पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. संबंधित एसबी बफ़र्स (तालिका 1) एक स्वच्छ ट्यूब में प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक के 300 μl में गोली Resuspend (प्रमाणित RNase-, DNase-, और pyrogen मुक्त) किसी भी डीएनए के क्षरण को रोकने के लिए। बर्फ पर 15 से 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने Sonicate क्रोमेटिन प्रत्येक सामग्री के लिए 2 तालिका में सूचीबद्ध कार्यक्रमों के अनुसार एक sonicator का उपयोग कर वंचित करने के लिए। (अगले आवेदन के आधार पर sonication अवधि को समायोजित <उन्हें> यानी, पीसीआर या अनुक्रमण)। Sheared डीएनए आकार पीसीआर के लिए 500 बीपी और अनुक्रमण के लिए 300 बीपी के आसपास होना चाहिए।
  6. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 6000 XG पर 10 मिनट के लिए सेल lysate sonicated, एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (क्रोमेटिन) हस्तांतरण और गोली त्यागें।
  7. पानी के साथ 10 बार के लिए समाधान में क्रोमेटिन (सतह पर तैरनेवाला बफर बी) पतला और एक नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 1.5 μl का उपयोग कर ऑप्टिकल घनत्व का आकलन करें। 0.76 x 260 आयुध डिपो - 1.55 x आयुध डिपो 280: माइक्रोग्राम / μl में प्रोटीन निम्न सूत्र का उपयोग की एकाग्रता प्राप्त करते हैं।
बफर उपयोग रचना सामग्री
permeabilization PB1: 5 मिमी पाइप पीएच 8; 85 मीटरएम KCl; 0.5% NP40 सब
PB2: 15 मिमी HEPES पीएच 7.6, 15 मिमी NaCl, 4 मिमी MgCl2 60 मिमी KCl, 0.5% ट्राइटन X-100 भ्रूण ऊतक
बी सेल / Sonication SB1: 1% एसडीएस; 10 मिमी EDTA; 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8 ESC
SB2: 50 मिमी HEPES-कोह pH7.9; 140 मिमी, 1 मिमी EDTA; 0.1% deoxycholate; 0.1% एसडीएस ईबीएस
SB3: 15 मिमी HEPES pH7.6, 15 मिमी NaCl; 60 मिमी KCl, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी EGTA; 1% ट्राइटन-X100, 0 .1% एसडीएस, 0.5% laurylsarcosine भ्रूण ऊतक
सी चिप बफर 150 मिमी NaCl; 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5; 5 मिमी EDTA; 0.5% NP40; 1% ट्राइटन-X100। सब
डी डीएनए / प्रोटीन क्षालन डी 1: 1% एसडीएस; 100मिमी 3 NaHCO
डी 2: 50 मिमी Tris पीएच 7.6 / 5 मिमी EDTA, 15 मिमी डीटीटी, 2% एसडीएस
डीएनए बाध्यकारी मोती तैयारी ई: 20% खूंटी 8000; 2.5 एम NaCl; 10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8; 1 मिमी EDTA

तालिका 1 चिप buffers।

सामग्री sonication कार्यक्रम
भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 30 सेकंड पर के 15 चक्र और 30 सेकंड रवाना
embryoid निकायों 30 सेकंड पर 30 चक्र और 30 सेकंड रवाना
भ्रूण के ऊतकों 30 सेकंड पर 21 चक्र और 30 सेकंड रवाना

तालिका 2 Sonication कार्यक्रम।

3. Immunoprecipitation औरwashes

  1. बफर सी के साथ 3 बार एक प्रोटीन संयुग्मित मोती धो लें। एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मोतियों की 100 μl ले लो और बफर सी (तालिका 1) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब तो एक चुंबक पर स्थानांतरित किया है; 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और सतह पर तैरनेवाला aspirate। धोने कदम दो बार दोहराएँ।
  2. बफर सी के 1 मिलीलीटर 20 धोया प्रोटीन की μl एक संयुग्मित माला और एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक के साथ संशोधित histones या प्रतिलेखन कारक (3 टेबल में सूचीबद्ध सांद्रता) के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए 40 rpm पर एक रोटेटर पर नमूने निर्धारित करें।
  3. धो एंटीबॉडी मोती बफर सी के 1 मिलीलीटर (हेरफेर 3.1 में वर्णित) के साथ 3 बार परिसरों।
  4. तैयार 2 ट्यूब, एक से युक्त 150 क्रोमेटिन और एंटीबॉडी मोती परिसरों की माइक्रोग्राम और अन्य ट्यूब धोया मोतियों की 150 क्रोमेटिन की माइक्रोग्राम और 20 μl युक्त; बफर सी के 1 मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक जोड़ेंऔर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 40 rpm पर एक घूर्णन पहिया पर नमूने सेते हैं।
    नोट: क्रोमेटिन की एकाग्रता कम से कम 300 माइक्रोग्राम प्रति एक प्रतिलेखन कारक या अनुक्रमिक चिप के लिए immunoprecipitate करने के लिए होना चाहिए।
मानक एकाग्रता (एनजी / μl) मात्रा (μl) कुल डीएनए एकाग्रता (एनजी)
10.0 1 10.0
बी 5.00 1 5.00
सी 2.50 1 2.50
डी 1.25 1 1.25
0.625 1 0.625
एफ 0.3125 1 00.3125
जी 0.156 1 0.156
एच 0.0 1 0.0

तालिका 3. मानक सांद्रता।

4. डीएनए क्षालन, पार से लिंक उलटा और proteinase कश्मीर पाचन

  1. चुंबकीय रैक में नमूने निर्धारित करें। अनबाउंड एंटीबॉडी क्रोमेटिन युक्त सतह पर तैरनेवाला की वसूली।
    नोट: नमूने जल्दी से उस कदम पर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। क्रोमेटिन अन्य एंटीबॉडी के साथ अन्य immunoprecipitation assays में इस्तेमाल किया जा सकता है। बफर सी के 1 मिलीलीटर (हेरफेर से पहले वर्णित) के साथ प्रत्येक नमूना 3 बार धोएं।
  2. बफर डी 1 डी 2 या के 150 μl जोड़कर एंटीबॉडी बाध्य प्रोटीन Elute यदि अनुक्रमिक चिप चिप धोया सामग्री के लिए (तालिका 1) के लिए किया जाना है और एक हीटिंग ब्लॉक में 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
  3. से ट्यूबों निकालेंहीटिंग ब्लॉक और चुंबकीय रैक में डाल नमूने, एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (प्रमाणित RNase-, DNase-, और pyrogen मुक्त) में सतह पर तैरनेवाला की वसूली और मोती त्यागें।
  4. एक अनुक्रमिक चिप बफर सी के 2 संस्करणों में दूसरा एंटीबॉडी की 3 ग्राम को 1 जोड़ने के लिए सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें या 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 5 एम NaCl जोड़कर Crosslink रिवर्स।
  5. एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में क्रोमेटिन का एक इनपुट नमूना तैयार (प्रमाणित RNase-, DNase-, और pyrogen मुक्त) पानी की 150 μl के अंतिम मात्रा में आईपी नमूना (150 माइक्रोग्राम) के रूप में क्रोमेटिन का एक ही राशि लेने (RNase DNase मुक्त पानी)। 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5M NaCl जोड़ें। 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने सेते हैं।
  6. अगले दिन, हीटिंग ब्लॉक से नमूने को हटाने की 12.5 मिमी और proteinase कश्मीर अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए चिप सामग्री में 250 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त और 2 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर पचाने में 250 मिमी EDTA जोड़ने हीटिंग ब्लॉक।

  1. मोतियों की तैयारी
    1. कम से कम 30 मिनट, भंवर के लिए बहुत अच्छी तरह से मोती कमरे के तापमान पर मोती लाने के लिए शुरू करो। मोती बसने, इतनी तेजी से काम जब pipetting। साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण मोती के 1 मिलीलीटर (RNase-, DNase-, और pyrogen मुक्त प्रमाणित)।
    2. 3 मिनट के समाधान को स्पष्ट करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें - चुंबक पर सेट करें, 2 के लिए प्रतीक्षा करें। चुंबक से निकालें, 0.5 एम EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें और संक्षिप्त vortexing द्वारा मिश्रण।
    3. दोहराएँ कदम 5.1.2 दो बार, और अंत में सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. चुंबक से निकालें, बफर ई के 1 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे धीरे मोती resuspend। एक प्रकार के बरतन पर बफर ई प्लेस के 50 मिलीलीटर में पूरे मिश्रण (बफर ई में मोती) स्थानांतरण और यह 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे मिश्रण।
    5. टेस्ट डीएनए बाध्यकारी मोती 3 प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग कर नीचे वर्णित शुद्धि प्रोटोकॉल के बाद: मोती के 50 μl / डीएनए (1 मात्रा / 1 मात्रा) के 50 μl, मोतियों की 100 μl/ डीएनए के 50 μl (2 संस्करणों / 1 मात्रा) और मोतियों की 125 μl / डीएनए के 50 μl (2.5 संस्करणों / 1 मात्रा)। एक 1.5% agarose जेल पर शुद्ध डीएनए विस्थापित टुकड़े (चित्रा 1 ए) के आकार की जाँच करने के लिए करते हैं।
  2. डीएनए शुद्धि
    1. डीएनए के 425 μl (2.5 मात्रा) प्रत्येक डीएनए नमूना (लगभग 170 μl) के लिए चुंबकीय मोती बाध्यकारी जोड़ें। नीचे (लगभग 10 बार) ऊपर pipetting और धीरे-धीरे Resuspend और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. चुंबक पर 5 मिनट के लिए रखें, फिर सतह पर तैरनेवाला aspirate और (चुंबक पर) त्यागें।
    3. चुंबक पर ट्यूब के लिए ताजा बना 80% इथेनॉल के 600 μl जोड़ें, 1 मिनट, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए प्रतीक्षा करें और त्यागने और उसके बाद एक बार फिर पिछले चरण को दोहराएँ।
    4. एक त्वरित स्पिन दे दो, 5 सेकंड (microfuge) के लिए, चुंबक पर ट्यूब जगह और इथेनॉल के अंतिम बूंदों को हटा दें। आरटी पर 1 मिनट के लिए सूखी
    5. DNase RNase मुक्त पानी के 20 μl जोड़कर डीएनए Elute। चुंबक से निकालें और नमूना भंवर।
    6. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेते हैं और फिर चुंबक पर नमूने रखें। एक नया ट्यूब में महाप्राण eluted डीएनए (RNase-, DNase-, और pyrogen मुक्त प्रमाणित)।
    7. डीएनए टुकड़े (चित्रा 1 बी) के आकार की जाँच करने के लिए एक 1.5% agarose जेल पर इनपुट अंश से डीएनए चलाएँ।

6. डीएनए मात्रा एक प्रतिदीप्ति पता लगाने साधन का उपयोग कर

  1. क्रमानुसार पानी 1 माइक्रोग्राम डीएनए (1 केबी सीढ़ी) में पतला 7 dilutions प्लस एक नहीं, डीएनए बिंदु (3 टेबल में एकत्र हुए dilutions) की कुल देने के लिए।
  2. पीसीआर Green में डाई की एक समाधान तैयार है, सभी के नमूने (शुद्ध डीएनए और मानक dilutions एएच) के लिए पर्याप्त: 1x ते बफर में ग्रीन डाई 10,000 पतला।
  3. केशिकाओं cuvettes में 10 μl 1x हरे रंग के मिश्रण करने के लिए प्रत्येक डीएनए नमूने (शुद्ध डीएनए और मानक dilutions एएच) के 1 μl जोड़े 488 एनएम तरंगदैर्ध्य पर एक fluorimeter में पढ़ा जा सके। कोई डीएनए परख के लिए, 1x ते बफर के 1 μl का उपयोग करें।
  4. निर्माणएक अंशांकन वक्र एक ग्राफिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और एनजी / μl में डीएनए नमूनों की श्रृंखला के लिए रिश्तेदार सांद्रता का निर्धारण। डीएनए तो पीसीआर के लिए तैयार है या अनुक्रमण पुस्तकालयों बनाने के लिए।

7. पीसीआर

  1. प्राइमरों का चयन
    1. ब्याज की डिजाइन प्राइमरों ब्याज की जीनोमिक क्षेत्रों से पूछताछ करने के लिए। डिजाइन प्राइमरों UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग जीन की बढ़ाने क्षेत्रों बढ़ाना। Enhancers आगे H3K4me1 या P300 चिप seq भू डेटा सेट में 9 डेटा उपलब्ध का उपयोग कर भविष्यवाणी कर रहे हैं।
  2. पीसीआर
    1. 45 चक्र (8 सेकंड 95 डिग्री सेल्सियस, 8 सेकंड 60 डिग्री सेल्सियस, 8 सेकंड 72 डिग्री सेल्सियस), 25 μl हरे रंग के मिश्रण, 2 एनजी डीएनए, और 0.5 μl प्राइमर मिश्रण में एक वास्तविक समय पीसीआर thermocycler प्रयोग करने के लिए भागो पीसीआर प्रतिक्रियाओं (20 माइक्रोन के शेयर समाधान) 10।
  3. संवर्धन के विश्लेषण
    1. निरपेक्ष संवर्धन यह सोचते हैं कि nucleosome की ज्यादा से ज्यादा 1% 11 immunoprecipitated थे गणना।
    2. विचार केआर जीनोमिक यदि 10 एनजी आईपी नमूने एक बड़ा संवर्धन दिखाने के लिए जब इनपुट डीएनए के 0.1 एनजी की तुलना में समृद्ध है।
    3. एक्सप्रेस गुना इनपुट और एक गैर विशिष्ट नियंत्रण नमूने के साथ समायोजन करने के लिए सामान्य बनाने के बाद एक गैर-समृद्ध क्षेत्र में संवर्धन में वृद्धि के रूप में परिणाम है।
    4. गौर इनपुट डीएनए 100 (कमजोर पड़ने कारक या डीएफ) से पतला होना चाहिए।
    5. सीटी [DF एक्स इनपुट] - निम्न समीकरण का उपयोग 2 -ΔCt x 100%, जहां -ΔCt = सीटी [आईपी] इनपुट मानक के अनुसार।
    6. निम्न समीकरण का उपयोग नियंत्रण समायोजित (ΔCt [आईपी] -ΔCt [एन एस]) जहां एन एस गैर विशिष्ट नमूना (कोई एंटीबॉडी आईपी, या आईजीजी आईपी) है।
    7. 2 -ΔΔCt के रूप में नमूने के गुना संवर्धन की गणना। फार्मूले के साथ गणना के सभी चरणों, जिसमें केवल एक पीसीआर नमूना परिणामों के विश्लेषण की सुविधा होगी प्रवेश किया जा सकता सहित एक फ़ाइल।

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Representative Results

चित्रा 1 ए पहली डीएनए बाध्यकारी माला और गुणवत्ता के विभिन्न आकारों (1 KB सीढ़ी) के डीएनए का उपयोग नियंत्रण की तैयारी को दिखाता है। 0ne, 2 और 2.5 मात्रा (1 से 3) मोती का नमूना उच्च और निम्न आणविक आकार डीएनए टुकड़े को शुद्ध करने की एक मात्रा में जोड़ा गया था।

आंकड़े 1 बी, सी, डी पूरे sonicated माउस ES कोशिकाओं, embryoid निकायों या एक हृदय भ्रूण क्षेत्र (जमा 25 E9.5 निलय) से निकाले गए डीएनए, क्रमशः से डीएनए जैल के विशिष्ट उदाहरण हैं।

ते कोशिकाओं को एक mesendodermal और फिर एक mesodermal राज्य के माध्यम से पहली बार एक हृदय सेल भाग्य की ओर से अंतर है, वे पारगमन। इस तरह के एक विकास यात्रा में एक कदम है जिसके द्वारा उपकला कोशिकाओं एक epithelio-mesenchymal संक्रमण से गुजरना है शामिल

चित्र 2

भेदभाव जीन ES कोशिकाओं 12 में द्विसंयोजक डोमेन विशेषता है। अपने 5 'UTR उनके प्रमोटरों के करीब क्षेत्रों वास्तव में दोनों H3K4me3 एक क्रोमेटिन सक्रिय मार्क और H3K27me3, एक दमित मार्क के कब्जे में हैं। ये निशान संशोधित कर रहे हैं जब कोशिकाओं BMP2 7 के रूप में इस तरह के morphogens ने चुनौती दी है। ये निशान हालांकि रहे हैं चर मानव ES कोशिकाओं लाइन पर निर्भर करता हैमूल ब्लास्टोसिस्ट वे भी जब अविभाजित से निकाले जाते हैं (चित्रा 3) की वजह से होने की संभावना है।

प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित चिप अनुक्रमण भी सामग्री का एक कम राशि से शुरू करने के लिए उपयुक्त हैं; चिप प्रयोगों एवीसी से निकाला क्रोमेटिन से प्रदर्शन किया गया, बार बार और उपन्यास जीन और इन विशिष्ट हृदय क्षेत्रों की पहचान को परिभाषित करने में एक भूमिका निभा enhancers उजागर करने के क्रम में E9.5 माउस भ्रूण की निलय। चित्रा 4 शो में मायोकार्डियल जीन की 2 जीनोमिक क्षेत्रों E9.5 माउस वेंट्रिकल एक Acetylated H3K27 द्वारा और एक पेसमेकर-विशिष्ट के समृद्ध (यानी।, वेंट्रिकुलर नहीं) जीन Acetylated H3K27 से समृद्ध नहीं।

आकृति 1
चित्रा 1. वैद्युतकणसंचलन डाटा: डीएनए बाध्यकारी मोती जाँच हो रही है और sonication वैलidation। (ए) डीएनए डीएनए बाध्यकारी मोती द्वारा शुद्ध, मोती डीएनए के / 1 मात्रा की 1 मात्रा (1) और मोती डीएनए के / 1 मात्रा के 2 संस्करणों (2) और मोतियों की 2.5 मात्रा डीएनए के / 1 मात्रा (3)। माउस ES कोशिकाओं (बी) के इनपुट भिन्न, embryoid निकायों (सी) के रिवर्स Crosslink के बाद प्राप्त डीएनए टुकड़े के आकार, और भ्रूण हृदय के ऊतकों (डी)। नमूने 2% agarose वैद्युतकणसंचलन जैल पर चलाए जा रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. चिप डेटा विश्लेषण। (ए) H3K27ac epigenetic निशान के ई cadherin enhancers / प्रमोटर पर संवर्धन (ए - ई क्षेत्रों) (बी) H3K4me1, H3K36me3 और H3K9me2 epige के संवर्धन।ट्विस्ट enhancers / प्रमोटर पर netic चिह्न (एसी क्षेत्रों)। जीनोमिक क्षेत्रों qPCR द्वारा परिलक्षित कर रहे हैं हिस्टोन संवर्धन चिप निम्नलिखित इनपुट बनाम को मापने के लिए। परिणाम 3 प्रयोगों से ± SEM के साधन हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. अनुक्रमिक चिप। Chromatin 4 मानव ते सेल लाइनों से निकाला गया था और चिप विरोधी H3K4me3 और फिर विरोधी H3K27me3 एंटीबॉडी का उपयोग क्रमिक रूप से प्रदर्शन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4। जीन Nkx2.5 और Tbx5 संशोधित हिस्टोन और Shox2 पेसमेकर विशिष्ट जीन में से एक जीनोमिक क्षेत्र समृद्ध और न वेंट्रिकल में व्यक्त नहीं में समृद्ध के जीनोमिक क्षेत्रों से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एपिजेनेटिक्स विकास जीव विज्ञान में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गया है। कैसे एक आनुवंशिक प्रोग्राम भ्रूण कोशिकाओं में सक्रिय है एक भ्रूण वंश के भीतर एक विशिष्ट पहचान प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति के लिए लंबे समय के लिए विकासात्मक जीव के लिए एक महत्वपूर्ण सवाल किया गया है।

चिप मोटे तौर पर पिछले साल के भीतर इस्तेमाल किया और अनुक्रमण के समाधान में सुधार के बाद डीएनए अनुक्रमण के लिए संयुक्त किया गया है। इस क्रम में विस्तृत निर्भर तरीके कोशिकाओं या विशिष्ट भ्रूण और वयस्क ऊतकों की epigenetic परिदृश्य एक जीनोम में जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन गया है। चिप परख बफ़र्स और sonication की स्थिति बहुत जैविक सामग्री की छोटी राशि के लिए assays अनुमति देने के लिए सुधार किया गया है। यह भ्रूण microdissection द्वारा या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त संवाददाता FACS हल कोशिकाओं द्वारा प्राप्त दिल के विशिष्ट क्षेत्रों में शामिल हैं। दरअसल चिप विषम सेल आबादी 13 14 कर सकते हैं पर प्रदर्शनभ्रामक परिणाम है कि व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए नेतृत्व। epigenetic हस्ताक्षर के निशान बहुत सही आबादी सेल। यही कारण है कि हस्ताक्षर करने के लिए उन्हें भेदभाव का एक विशिष्ट क्षमता प्रदान करता है और उनके भाग्य का निर्धारण करता है। यह शुद्ध (हल) सेल आबादी या विच्छेदित भ्रूण के ऊतकों के साथ काम करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है।

हम आदेश में इन लक्ष्यों को प्राप्त करने में मजबूत प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है। हम चिप 7, 10 या चिप अनुक्रमण (चित्रा 4, तैयारी में पांडुलिपि) पर चिप पीसीआर, चिप के लिए इन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। मजबूती के लिए कारण permeabilization और सेल बफ़र्स कि एक पूरा सेल और परमाणु सेल और कुशल क्रोमेटिन sonication सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है पर देता है। प्रोटोकॉल इस प्रकार भ्रूण के ऊतकों की छोटी राशि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इन प्रोटोकॉल की सीमाएं चिप के लिए निहित हैं। अधिक विशेष रूप से, स्थानिक संकल्प 500 बीपी के आसपास डीएनए आकार के साथ बहुत अधिक नहीं है। किस तरहकभी यह ते कोशिकाओं 7 फर्क में द्विसंयोजक डोमेन की गतिशीलता की जांच करने के लिए और जंगली प्रकार या जीन उत्परिवर्तित कोशिकाओं में जीन EMT विनियामक क्षेत्रों पर संशोधित histones के संवर्धन में मतभेद प्रकट करने के लिए हमें की अनुमति देता है। (चित्रा 2)। Immunoprecipitated डीएनए (चित्रा 4) की गहरी अनुक्रमण आंशिक रूप से इस सीमा पर काबू।

एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र एक प्रतिलेखन कारक के निम्नलिखित immunoprecipitation के संवर्धन सुनिश्चित करें कि कारक सीधे डीएनए बांधता के लिए संकेत नहीं है। यह केवल डीएनए के लिए बाध्य जटिल कारखाने का हिस्सा हो सकता है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु के बारे में जागरूक किया जा रहा है। इसके विपरीत, जेल मंदता परख सवाल का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

गहरी अनुक्रमण के साथ संयुक्त हाथों में प्रौद्योगिकी वाले जीनोम चौड़ा एक प्रतिलेखन कारक हैं या एक विशिष्ट हिस्टोन मार्क के कब्जे में जीनोमिक क्षेत्रों की निगरानी के लिए अनुमति देता है। तकनीक में सुधार और केवल SMA पूछताछ के लिए अनुमति देता हैटू सेल आबादी 15। यह इस प्रकार भ्रूण विकास के दौरान विशिष्ट epigenetic परिदृश्य की गतिशीलता में नए रास्ते खोलता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

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References

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