Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En finjustering reglering av gentranskription ligger bakom embryonal cell öde beslut. Häri beskriver vi kromatin immunfällningsanalyser används för att undersöka epigenetisk reglering av både hjärt differentiering av stamceller och hjärt utveckling av musembryon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Specifik gentranskription är en viktig biologisk process som ligger bakom cell öde beslut under fosterutvecklingen. Den biologiska processen förmedlas av transkriptionsfaktorer som binder iska regulatoriska regioner inklusive förstärkare och promotorer av hjärt konstitutiva gener. DNA lindas kring histoner som utsätts för kemiska modifieringar. Modifieringar av histoner vidare leda till undertryckt, aktiveras eller rustat gentranskription, vilket kommer att ge en annan nivå av finjustering reglering av gentranskription. Embryonala stamceller (ES-celler) rekapitulera inom embryoidkroppar (dvs. cellaggregat) eller i 2D kultur de tidiga stegen av hjärt utveckling. De ger i princip tillräckligt med material för kromatin immunoprecipitation (chip), en teknik som används i stort sett för att identifiera gener regulatoriska regioner. Dessutom humana ES-celler representerar en cellmodell av kardiogenes människa. Vid senare stadier av utveckling, mus embryonala vävnader möjliggörundersöker specifika epigenetiska landskap som krävs för bestämning av cellidentiteten. Häri beskriver vi protokoll Chip, sekventiell chip följt av PCR eller Chip-sekvensering med användning ES-celler, embryoidkroppar och hjärt specifika embryonala regioner. Dessa protokoll gör det möjligt att undersöka den epigenetiska regleringen av hjärt gentranskription.

Introduction

Hjärtat är den första organ som skall bildas och för att bli funktionella i embryot. Hjärtat är byggd av flera cellinjer som uppstår från de första och andra embryonala hjärt fält 1. Från posten befruktning blastocyststadiet upp till den formade hjärta, embryonala celler har sålunda att göra många cellernas öde beslut. Gentranskription regleras i en tids- och utrymmesberoende sätt och är en viktig biologisk process som ligger bakom cell öde beslut under fosterutvecklingen. En sådan process medieras av specifika transkriptionsfaktorer som binder regulatoriska regioner inom genomet inklusive förstärkare och promotorer om hjärt konstitutiva gener. DNA lindas kring histoner som utsätts för modifikationer, såsom acetylering, metylering, ubiquitinylation, och / eller fosforylering. Histon modifiering leder till undertryckt, aktiveras eller rustat gentranskription beroende på vilken lysinresten av histon modifieras 2.

jove_content "> Kromatin immunoprecipitation assay (chip) har inrättats år sedan 3 och är för närvarande den mest allmänt använda tekniken för att identifiera mål för antingen modifierade histoner eller transkriptionsfaktorer 4. Efter immunoutfällning av histoner eller transkriptionsfaktorer, kan bundna DNA antingen amplifierades genom polymeraskedjereaktion (PCR) eller sekvenseras. ChIP har tekniskt övervinna mer utmanande gel retardation assays 5. emellertid ChIP innebär inte direkt bindning av en transkriptionsfaktor till DNA, en fördel med gel retardation assay. Å andra sidan, ChIP kombineras för att DNA-sekvensering har öppnat en ny genomet hela perspektiv på genreglering.

ES-celler (ES-celler) rekapitulera inom embryoidkroppar (dvs., Cellaggregat) eller i 2D kultur de tidiga stegen av hjärt utveckling 6 och ger i princip tillräckligt med material för chip. Dessutom humana ES-celler representerar en cellmodell av ca mänskligrdiogenesis även om deras kardiogen potential beror på deras epigenetiska signatur 7. Vid senare stadier av utveckling, mus embryonala vävnader tillåter att undersöka specifika epigenetiska landskap som krävs för bestämning av cellidentiteten. Emellertid är genomet transkriberas på ett tids- och celltyp-specifikt sätt 8. Epigenetisk reglering av gentranskription måste studeras inom lokala områden. Häri beskriver vi protokoll Chip, sekventiell chip följt av PCR eller sekvensering med hjälp av embryonala stamceller, embryoidkroppar och hjärt specifika embryonala regioner. Dessa protokoll gör det möjligt att undersöka den epigenetiska regleringen av hjärt gentranskription.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA-proteintvärbindning

  1. Fix i 15 ml rör som skördats-ES-celler (2 x 10 6 celler för normal starts, 2 x 10 5 celler för mikrochip), embryoidkroppar (EBS) som genereras från ES-celler och embryonala hjärtvävnad dissekerades från embryon E9.5 mus (atrioventrikulärt kanal, utflöde och kammare) med användning av 1% formaldehyd i PBS för celler eller i permeabilization PB2 buffert för embryonala vävnader. Placera rören på orbital skakanordning vid en hastighet av 60 varv per minut vid rumstemperatur under exakt 10 min.
  2. Stoppa tvärbindningsreaktionen genom att tillsätta glycin till en slutkoncentration av 125 mM och inkubera under 5 min vid rumstemperatur på skakapparat vid en hastighet av 60 varv per minut.

2. Cell Lysis och Kromatin Fragmentering

  1. Tvätta två gånger tvärbundna cellerna resuspenderades i 10 ml PBS 1x eller embryonala vävnader återsuspenderades i 1 ml PB2. Centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C. Kasta supernatanterna. </ Li>
  2. Lägg proteashämmare att buffra PB1 eller PB2 (2 | ig / ml leupeptin, 1 | ig / ml Aprotinin och 0,1 mM PMSF) (tabell 1). Resuspendera cellpelleten eller embryonal vävnad från steg 2,1 i 1 ml buffert PB1 eller PB2 respektive. Pipett upp och ner och suspendera cellerna eller vävnaderna. Använda en 1 ml spruta med en 21 gauge nål för att homogenisera celler eller vävnad. Inkubera vid 4 ° C (på ett hjul) under 10 min.
  3. Centrifugera ner vid 3000 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
  4. Återsuspendera pelleten i 300 | il av respektive SB buffertar (tabell 1) kompletterat med proteashämmare i ett rent rör (certifierat RNase-, DNase- och pyrogenfri) för att förhindra DNA-nedbrytning. Inkubera i 15 till 30 min på is.
  5. Sonikera proverna vid 4 ° C för att klippa kromatinet med hjälp av en ultraljuds enligt program som anges i tabell 2 för varje material. Justera ultraljudsbehandling varaktighet beroende på nästa program (<em> dvs PCR eller sekvensering). Klippt DNA storlek bör vara cirka 500 bp för PCR och 300 bp för sekvensering.
  6. Centrifug sonikerad cellysatet i 10 min vid 6000 xg vid 4 ° C och överför supernatanten (kromatin) i ett rent 1,5 ml rör och kasta pelleten.
  7. Späd kromatin i lösning (supernatant buffert B) under 10 gånger med vatten och bedöma den optiska densiteten med användning av 1,5 | j, l i en nano-spektrofotometer. Fastställ koncentrationen av proteiner i mikrogram / ​​l, enligt följande formel: 1,55 x OD 280 till 0,76 x OD 260.
Buffert Utnyttjande Sammansättning material
en permeabilisering PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 Alla
PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCl, 0,5% Triton X-100 embryonal vävnad
B Lysis / Sonikering SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 ESC
SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7,9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% deoxicholat; 0,1% SDS EB
SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% laurylsarkosin embryonal vävnad
C ChIP-buffert 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. Alla
D DNA / protein Eluering D1: 1% SDS; 100mM NaHCOs 3
D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E DNA bindande kulorna beredning E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA

Tabell 1. CHIP buffertar.

Material sonikering programmet
Embryonala stamceller 15 cykler av 30 sek och 30 sek OFF
embryoidkroppar 30 cykler av 30 sek och 30 sek OFF
embryonala vävnader 21 cykler av 30 sek och 30 sek OFF

Tabell 2. ultraljudsbehandling program.

3. Immunoutfällning ochtvättar

  1. Tvätta 3 gånger Protein A-konjugerad pärlor med buffert C. Ta 100 pl pärlor i ett rent 1,5 ml rör och tillsätt 1 ml av buffert C (tabell 1). Röret överförs sedan på en magnet; vänta i 1 minut och aspirera supernatanten. Upprepa två gånger tvättsteget.
  2. Inkubera antikropp framkallad mot modifierade histoner eller transkriptionsfaktor (koncentrationer som anges i tabell 3) med 20 pl tvättat protein A konjugerade pärlor och 1 ml buffert C kompletterat med proteashämmare i ett rent 1,5 ml rör. Ställa proverna på en rotator vid 40 varv per minut under minst 2 h vid 4 ° C.
  3. Tvätta antikropps pärlor komplex 3 gånger med 1 ml buffert C (manipulation som beskrivs i 3.1).
  4. Förbered 2 rör, en innehållande 150 mikrogram av kromatin och antikropps pärlor komplex och den andra rör som innehåller 150 mikrogram av kromatin och 20 pl tvättade pärlor; Tillsätt 1 ml buffert C kompletterat med proteashämmare till varje röroch inkubera proverna på ett roterande hjul vid 40 varv per minut över natten vid 4 ° C.
    OBS: Koncentrationen av kromatin måste vara minst 300 pg till immunoprecipitera en transkriptionsfaktor, eller för sekventiell ChIP.
Standard koncentration (ng / | il) Volym (il) Total DNA-koncentration (ng)
en 10,0 1 10,0
B 5,00 1 5,00
C 2,50 1 2,50
D 1,25 1 1,25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
G 0,156 1 0,156
H 0,0 1 0,0

Tabell 3. Standarder koncentrationer.

4. DNA Eluering, Cross-link Återföring och proteinas K Digestion

  1. Ställa samplen i den magnetiska rack. Återvinna supernatanten innehållande obunden antikropp kromatin.
    NOTERA: Prov kan snabbt fryses i flytande kväve vid det steget och lagrades vid -80 ° C. Kromatin kan användas i andra immunfällningsanalyser med andra antikropp. Tvätta varje prov 3 gånger med 1 ml buffert C (manipulation beskrivits tidigare).
  2. Eluera antikroppsbundna proteinet genom att tillsätta 150 pl buffert D1 eller D2 om sekventiell chip måste göras (tabell 1) till tvättade CHIP material och inkubera proverna under 20 minuter vid 50 ° C i ett värmeblock.
  3. Ta bort rören frånvärmeblocket och placera prov i den magnetiska rack, återhämta supernatanten i ett rent 1,5 ml rör (certifierad RNase-, DNase- och pyrogenfri) och kassera pärlorna.
  4. Använda supernatanten för en sekventiell ChIP sätta 1 till 3 ^ g av den andra antikroppen i 2 volymer buffert C eller omvänd tvärbindning genom tillsats av 5 M NaCl för erhållande av en slutkoncentration av 200 mM.
  5. Förbereda en ingångs prov av kromatin i ett rent 1,5 ml rör (certifierat RNase-, DNase- och pyrogenfri) tar samma mängd kromatin som den för den IP-prov (150 ^ g) i en slutlig volym av 150 | il vatten (RNas DNas fritt vatten). Lägga 5M NaCl till en slutlig koncentration av 200 mM. Inkubera proverna över natten vid 65 ° C.
  6. Nästa dag, ta prover från värmeblocket, tillsätt 250 mM EDTA för att erhålla en slutlig koncentration av 12,5 mM och proteinas K för att erhålla en slutlig koncentration av 250 | ig / ml i spånmaterialet och smälta vid 55 ° C under 2 h i värmeblock.

  1. Framställning av pärlor
    1. Börja med att sätta kulorna vid rumstemperatur under åtminstone 30 min, vortex pärlorna mycket noggrant. Pärlor bosätta sig, så arbeta snabbt vid pipettering. Överföring 1 ml pärlor i ren 1,5 ml rör (certifierad RNase-, DNase- och pyrogenfri).
    2. Beläget på magnet, vänta 2-3 minuter för lösningen att förtydliga, kassera supernatanten. Ta bort från magneten, tillsätt 1 ml av 0,5 M EDTA och blanda genom kortvarig virvling.
    3. Upprepa steg 5.1.2 två gånger, och kassera supernatanten vid slutet.
    4. Ta bort från magneten, tillsätt 1 ml buffert E och långsamt resuspendera kulorna. Överföra hela blandningen (kulor i buffert E) i 50 ml buffert E. Placera på en skakanordning och låt den blanda långsamt vid rumstemperatur under 1 timme.
    5. Test-DNA-bindande kulorna efter reningsprotokollet som beskrivs nedan med hjälp av 3 experimentella betingelser: 50 pl pärlor / 50 pl DNA (1 volym / 1 volym), 100 pl pärlor/ 50 pl DNA (2 volymer / 1 volym) och 125 pl pärlor / 50 pl DNA (2,5 volymer / 1 volym). Låt migrera renat DNA på en 1,5% agarosgel för att kontrollera storleken av fragmenten (Figur 1A).
  2. DNA Purification
    1. Lägg 425 ul (2,5 volymer) av DNA-bindande magnetiska pärlor till varje DNA-prov (ca 170 l). Resuspendera långsamt genom att pipettera upp och ner (ca 10 gånger) och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
    2. Placera på magnet i 5 minuter, sedan aspirera supernatanten och kassera (på magneten).
    3. Lägg 600 pl nybakade 80% etanol till röret på magneten, vänta en minut, aspirera supernatanten och kassera och sedan upprepa föregående steg igen.
    4. Ger en snabb dragning för 5 sek (mikrofug), placera röret på magneten och avlägsna de sista dropparna av etanol. Låt torka i 1 min vid RT
    5. Eluera DNA genom att tillsätta 20 | il DNas RNas-fritt vatten. Ta bort från magneten och skaka provet.
    6. Inkubera i 3 min vid rumstemperatur och sedan placera prover på magneten. Aspirera eluerade DNA i ett nytt rör (certifierat RNase-, DNase- och pyrogenfri).
    7. Köra DNA: t från inmatningsfraktionen på en 1,5% agarosgel för att kontrollera storleken av DNA-fragment (figur 1B).

6. DNA kvantifiering med hjälp av en fluorescensdetektion Instrument

  1. Seriellt späda i vatten 1 ug DNA (1 kb stege) för att ge en totalt 7 späd plus en no-DNA punkt (späd samlats i tabell 3).
  2. Bered en lösning av PCR Green I färgämne, tillräcklig för alla prover (renat DNA och standardspäd AH): späd 10000 det gröna färgämnet i 1x TE buffert.
  3. Tillsätt 1 l av varje DNA-prov (renat DNA och standardspäd AH) till 10 l 1x grön färg mix i kapillärer kyvetter att läsas i en fluorimeter vid 488 nm våglängd. För icke-DNA-analys, använd 1 pl av 1 x TE-buffert.
  4. Byggaen kalibreringskurva med en grafisk mjukvara och bestämma de relativa koncentrationerna till intervallet av DNA-prover i ng / | il. DNA är sedan klar för PCR eller för att göra sekvense bibliotek.

7. PCR

  1. Urval av primers
    1. Design primers av intresse att förhöra iska regionerna av intresse. Konstruktions primrar för att amplifiera förstärkarregioner av gener med hjälp av UCSC genomet webbläsare. Förstärkare är vidare förutsägas med hjälp H3K4me1 eller p300 Chip-punkter 9 data tillgängliga i GEO datamängd.
  2. PCR
    1. Kör PCR-reaktioner för 45 cykler (8 sek 95 ° C, 8 sek 60 ° C, 8 sek 72 ° C) med användning av en realtids-PCR thermocycler i 25 | j, l grönt färgämne mix, 2 ng DNA och 0,5 | il primer mix (20 ^ M stamlösning) 10.
  3. Analys av anrikning
    1. Beräkna Absolut anrikning förutsatt att högst 1% av nukleosomen immunutfälldes 11.
    2. Consider iska som berikas om 10 ng IP prover visar en större anrikning jämfört med 0,1 ng input DNA.
    3. Uttrycka resultaten som faldig ökning av anrikning över en icke-berikad region efter normalisering till ingången och justering med en icke-specifik kontrollprov.
    4. Överväga den ingående DNA som skall spädas med 100 (spädningsfaktor eller DF).
    5. Normalisera ingångs med följande ekvation 2 -ΔCt x 100%, där -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
    6. Justera kontroll med hjälp av följande ekvation (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) där IK är den icke-specifika prov (ingen antikropp IP, eller IgG IP).
    7. Beräkna faldig anrikning av provet som två -ΔΔCt. En fil med alla steg i beräkningar med formler där endast varje PCR-prov kan matas in kommer att underlätta analysen av resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A illustrerar först framställningen av DNA-bindande pärlor och kvalitetskontroll med hjälp av DNA från olika storlekar (1 kb stege). 0ne, 2 och 2,5 volymer (1 till 3) av pärlor tillsattes till en volym av provet att rena med hög och låg molekylstorlek DNA-fragment.

Figurerna 1 B, C, D är typiska exempel på DNA-geler från hel sonikerad DNA extraherat från mus-ES-celler, embryoidkroppar eller en hjärtembryo region (poolade 25 E9.5 ventriklarna), respektive.

När ES-celler differentierar mot en hjärtcell öde, de reser först genom en mesendodermal och sedan en mesodermala tillstånd. En sådan utvecklings resan inkluderar ett steg genom vilket epitelceller måste genomgå en epithelio-mesenkymala övergång

figur 2

Differentiering gener har bivalenta domäner i ES-celler 12. Deras 5 'UTR områden nära deras promotorer faktiskt upptas av både H3K4me3 en kromatin aktiveringsmärke och H3K27me3, en undertryckt märke. Dessa märken ändras när cellerna utmanas av morfogener sådana som BMP2 7. Dessa märken är dock varierar beroende på den mänskliga ES-celler linjeär sannolikt på grund av den ursprungliga blastocysten de härrör från även när odifferentierade (Figur 3).

Protokollen beskrivna ovan är lämpliga för spånsekvense även utgående från en liten mängd material; ChIP experiment utfördes från kromatin utvinns ur AVC, OFT och ventriklar av embryon E9.5 mus för att avslöja nya gener och förstärkare spelar en roll i att definiera vilka dessa specifika hjärt regioner. Figur 4 visar 2 iska regioner av hjärt gener i den E9.5 musen ventrikeln berikas av en acetylerad H3K27 och en pacemaker specifika (dvs., inte ventrikulära) genen inte berikas av acetylerade H3K27.

Figur 1
Figur 1. Elektrofores Data: DNA-bindande pärlor Kontroll och Sonication Valsolideringen. (A) DNA renades genom DNA-bindande kulor, en volym av pärlor / 1 volym av DNA (1) och 2 volymer av pärlor / 1 volym av DNA (2) och 2,5 volym av pärlor / 1 volym av DNA (3). Storleken av DNA-fragment erhållna efter omvänd tvärbindning av ingångs fraktioner av mus-ES-celler (B), embryoidkroppar (C), och embryonala hjärtvävnad (D). Proverna kördes på 2% agaroselektrofores geler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Chip dataanalys. (A) Anrikning av H3K27ac epigenetiska märke på E-cadherin förstärkare / promotor (A - E regioner) (b) Berikning av H3K4me1, H3K36me3 och H3K9me2 epige.tiska märken på Twist förstärkare / promotor (AC regioner). Iska regioner förstärks av qPCR att mäta histon anrikning vs input efter chipet. Resultaten är medelvärden ± SEM från 3 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Sekventiell chip. Kromatin extraherades från 4 humana ES-cellinjer och chip utfördes sekventiellt med användning av anti H3K4me3 och sedan anti-H3K27me3 antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. generna Nkx2.5 och Tbx5 berikade i den modifierade histon och en genomregion av Shox2 pacemaker-specifik gen inte berikat och uttrycks inte i kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetik har blivit ett viktigt forskningsområde i utvecklingsbiologi. Hur ett genetiskt program aktiveras i embryonala celler för att tillåta cellerna att förvärva en viss identitet inom en embryonal härstamning har varit under lång tid en viktig fråga för utvecklings biologer.

Chip har i stort sett används i de senaste åren och kombineras för att DNA-sekvensering efter förbättring i upplösning av sekvensering. Detta har blivit en kraftfull teknik för att undersöka i en genomet bred beroende sätt den epigenetiska landskap celler eller specifika embryonala och vuxna vävnader. Chipet analysbuffertar och sonication villkor har förbättrats avsevärt för att möjliggöra analyser för liten mängd biologiskt material. Detta inkluderar specifika regioner i embryonala hjärtan som erhållits genom microdissection eller genom FACS-sorterade celler som uttrycker en fluorescerande reporterprotein. Faktiskt ChIP utförs på heterogena cellpopulationer 13 14 burkleda till missvisande resultat som är svåra att tolka. De epigenetiska signatur märken mycket noggrant cellpopulationer. Denna signatur ger dem en viss potential differentiering och bestämmer deras öde. Det är därför viktigt att arbeta med renade (sorterade) cellpopulationer eller dissekeras embryonala vävnader.

Vi har beskrivit ovan robusta protokoll för att uppnå dessa mål. Vi har använt dessa protokoll för Chip-PCR, chip på chip 7, 10 eller Chip-sekvensering (Figur 4, manuskript under utarbetande). Anledningen till robusthet lägger på permeabilization och cellys buffertar som har optimerats för att säkerställa en fullständig cell och nukleära lys och effektiv kromatin ultraljudsbehandling. Protokollen kan således användas för liten mängd av embryonala vävnader.

Begränsningar av dessa protokoll är inneboende chip. Mer specifikt är den rumsliga upplösningen inte särskilt hög med DNA-storlekar runt 500 bp. Hurnågonsin, gör det möjligt för oss att undersöka dynamiken hos bivalenta domäner i differentierande ES-celler 7 och avslöja skillnader i anrikning av modifierade histoner på EMT gen regulatoriska regioner i vild typ eller gen-muterade celler. (Figur 2). Djup sekvensering av immunoprecipiterade DNA (Figur 4) övervinner delvis denna begränsning.

Anrikning av en specifik genomisk region efter immunoutfällning av en transkriptionsfaktor indikerar inte säkert att faktorn binder direkt DNA. Det kan bara vara en del av komplexa fabriks bundet till DNA. Detta är en viktig punkt att vara medveten om. I motsats härtill kunde gel retardation assay kan användas för att behandla frågan.

Med tekniken i händerna i kombination med djup sekvensering gör det möjligt att övervaka genomet bred de genomiska regioner som upptas av en transkriptionsfaktorer eller en specifik histon märke. Tekniken förbättras och gör det möjligt att förhöra endast small cellpopulationer 15. Det öppnar därmed nya vägar i dynamiken i specifika epigenetiska landskap under fosterutvecklingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics