קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מוצג פרוטוקול biocatalysts כל תא שיתוף משתק להתחדשות פקטור ויכולת שימוש חוזרת משופר, באמצעות הייצור של L-xylulose כדוגמא. התחדשות פקטור מושגת על ידי צימוד שני זני Escherichia coli להביע אנזימים משלימים מבחינה תפקודית; וקיבוע biocatalyst כל תא מושגת על ידי אנקפסולציה תא חרוזים אלגינט סידן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט, לשימוש חוזר ו מצמידה כל תא עם יכולת התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst תשואת ייצור משופרת וסינתזה מתמשכת. בזאת הוא תאר את הליך הניסויים לפיתוח של מערכת כזו מורכב משני E. קולי זני המבטאים אנזימים משלימים מבחינה תפקודית. יחד, שני אנזימים אלה יכולים לתפקד שיתוף ניתוח לתווך ההתחדשות של קו-פקטורים יקרים לשיפור תפוקת התוצר של bioreaction. בנוסף, השיטה של ​​סינתזת צורה משותקת של מערכת biocatalytic מצמידה ידי אנקפסולציה של תאים שלמים בחרוזי אלגינט סידן מדווחת. כדוגמא, אנו מציגים את ביוסינתזה המשופרת של L-xylulose מ L-arabinitol ידי צימוד E. קולי תאים המבטאים את האנזימים dehydrogenase L-arabinitol או מונואמין NADH. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150המ"מ L- arabinitol, תשואת L-xylulose המקסימאלי הגיעה 96%, שהוא גבוה יותר מאשר אלו המדווחים בספרות. הצורה המשותקת של biocatalysts כל תא המצמידים הפגינה יציבות תפעולית טובה, שמירת 65% מהתשואה שהושגה במחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה את הפעילות הקטליטית. לכן, שיטות דיווח כאן מספק שתי אסטרטגיות שיכול לעזור לשפר את הייצור התעשייתי של L-xylulose, וכן תרכובות ערך מוסף אחרים המחייבים את השימוש קו-פקטורים בכלל.

Introduction

Biotransformation כל תא רדוקטיבי באמצעות מיקרואורגניזמים הפך שיטה נפוצה לסינתזת האנזימטית הכימותרפיה של ביומולקולות בעלי חשיבות המסחרית טיפולי 1 - 3. היא מציגה מספר יתרונות על פני השימוש של אנזימים מבודדים, בעיקר החיסול של תהליכי טיהור במורד זרם עתיר עלות לבין ההפגנה של חיים מורחבים 4 - 7. לקבלת מסלולים biocatalytic שבו קו-פקטורים נדרשים ליצירת מוצר, מערכות תא כולו יש פוטנציאל לספק בהתחדשות פקטור באתרו באמצעות התוספת של 5,8,9 שיתוף מצעים לתרום אלקטרונים זולים. עם זאת, היכולת הזו היא פחתה לתגובות הדורשות ריכוז stoichiometric של מצעי שיתוף נדירים או יקרים 10 - 13. יחד עם שימוש חוזר עני של תאים שלמים, זה מקשה על הקמת produ מדרגי הרציףמערכת ction. שינויים אסטרטגיים של מערכות שלמות תאים עבור biotransformations פקטור תלויי אלה נדרשים להתגבר על המגבלות הנ"ל. באופן ספציפי, שילוב של biocatalysts כל התא שפועלים בשיתוף פעולה הוכח באופן משמעותי כדי לשפר את הפרודוקטיביות ואת היציבות של האנזימים טפחו 14. גורמים אלו, אשר לעתים קריטיים המאפשרים ייצור בקנה מידה הגדולה של מוצרים בכמות מסחרית, יכולים להיות מותאמים יותר על ידי חיידקי biocatalytic משתק שיתוף 15. פיתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט לשימוש חוזר כל תא המאפשר גם התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst לייצור L-xylulose 16. במחקר זה, מערכת זו נוצלה כדוגמה כדי להמחיש את הפרוצדורות של במסגרתו קיימות שתי אסטרטגיות אלה תשואה ייצור biotransformation משופרת ויכולת השימוש החוזר biocatalyst.

L-xylulose שייך CLAss של מולקולות ביולוגיות שימושיות בשם סוכרים נדירים. סוכרים נדירים הם מונוסכרידים ייחודיים או נגזרי סוכר המתרחשים לעתים נדירות מאוד בטבע, אבל לשחק תפקידים מכריעים כאלמנטי הכרה במולקולות ביו 17,18. יש להם מגוון של יישומים החל ממתיקים, מזון פונקציונלי ל -19 רפויות פוטנציאלי. L-xylulose יכול לשמש מעכב פוטנציאל של α-glucosidases המרובה, עשוי לשמש גם כאינדיקטור של שחמת כבד או דלקת כבד 17,20. המרה יעילות גבוהה של קסיליטול כדי L-xylulose במערכות כל תא דווחה בעבר Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 23 701B, pallidus Bacillus 24,25 Y25 ו Escherichia coli 26. בתוך א ' coli, לעומת זאת, הושג אותו באמצעות נמוכים בלבד (<67 מ"מ) ריכוזים קסיליטול 26 בשל השפעתו מעכבת פוטנציאל של ריכוז קסיליטול ראשוני גבוה יותר מ 100 מ"מ על פעילות קסיליטול-4-דהידרוגנז 21,26. שיווי המשקל התרמודינמי בין xylulose ו קסיליטול הוכח בחום להעדיף היווצרות של קסיליטול 25,27. בנוסף, תשואת xylulose מוגבלת על ידי הכמות של קו-פקטורים יקרים כי צריך להיות מסופקים בהעדר במערכת התחדשות הפקטור באתרו. יחד, גורמים אלה מצמצמים את פוטנציאל ההתרחבות לתוך מערכות קיימא עבור ביוסינתזה L-xylulose.

כדי להתגבר על המגבלות האלה ולשפר את תשואת biotransformation L-xylulose, האסטרטגיה של התחדשות פקטור הועסקה לראשונה על ידי הקמת מערך biocatalytic כל תא מצמיד. באופן ספציפי, L-Arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) מ Hypocrea jecorina (HjLAD), אנזים במסלול קטבולי L-arabinose של פטריות, נבחרה לזרז את ההמרה של L-arabinitol לתוך L-xylulose 28,29 . כמו אנזימי biosynthetic רבים, limitatio גדולהn של HjLAD הוא שזה דורש כמות stoichiometric של פקטור אדנין dinucleotide nicotinamide היקר (NAD +, בצורת החמצון של NADH) לבצע המרה זו. מונואמין מצאו NADH ב pyogenes סטרפטוקוקוס (SpNox) הוכח להציג-התחדשות-פקטור גבוה פעילות 30,31. ניצול של תכונה זו של SpNox, E. קולי תאים המבטאים HjLAD לייצור-xylulose L היו מצמידים עם E. קולי תאי מבטאי SpNox להתחדשות של NAD + כדי להגביר את ייצור L-xylulose מתואר על ידי התגובה המצמידה מוצגת באיור 1 א. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150 מ"מ L- arabinitol, התשואה L-xylulose מקסימלי הגיעו 96%, מה שהופך את המערכת הרבה יותר יעיל מאלו שדווחו בספרות.

האסטרטגיה של חוסר תנועה כל התא הועסקה הבאה לשפר עוד יותר את השימוש החוזר של biocatalyt מצמידמערכת IC. בדרך כלל שיטות המשמשות וקיבוע כל תא כוללות ספיחה / קוולנטיים מקשרים מטריצות מוצקות, cross-linking / מלכוד אנקפסולציה ברשתות פולימריים 32. בין גישות אלה, בשיטה המתאימה ביותר עבור קיבוע התא הוא אנקפסולציה בחרוזים אלגינט סידן. נכסי gelation הקלים שלהם, מטריקס מימית אינרטי נקבובית גבוה לעזור לשמר את המאפיינים פיסיולוגיים ופונקציונלית של הביולוגיות במארז 33. לכן, מערכת biocatalyst מצמידים המכילה הוא E. קולי תאים מחסה HjLAD או SpNox היה משותק חרוזים אלגינט סידן לאפשר מחזורים רבים של ייצור L-xylulose (איור 2) .the מערכת biocatalyst משותקת הפגינו יציבות תפעולית טובה, שמירה 65% מהתשואה המרה של המחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה הפעילות הקטליטית שלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Whole-cell biocatalysts הכנה

הערה: א רקומביננטי קולי תאים מחסה pET28a- SpNox 31 או pET28a- HjLAD 28 להלן מכונים E. coli SpNox וא coli HjLAD, בהתאמה.

  1. לחסן מושבה אחת של E. coli HjLAD ב 3 מ"ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני בתוספת kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה ב- O שייקר אינקובטור / N ב 37 מעלות צלסיוס, 250 סל"ד.
  2. לדלל את התרבות על ידי 1: 100 ב 200 מ"ל של LB טרי המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ו לדגור על 37 מעלות צלסיוס, 250 סל"ד עד 600 OD מגיע ~ 0.6.
  3. להשרות ביטוי החלבון HjLAD ידי הוספת 0.1 מ"מ איזופרופיל β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) עד בינוני התרבות לדגור על 16 מעלות צלסיוס, 180 סל"ד במשך 16 שעות.
    1. לחלופין, לבצע אינדוקציה ב- 25 מעלות צלסיוס, 200 RPמ 'עבור 6 שעות אם ביוסינתזה L-xylulose (שלב 2 להלן) מבוצע באותו יום.
  4. קציר מושרה E. coli HjLAD התאים על ידי צנטריפוגה ב 3200 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלסיוס בטל supernatant והמשך לשלב 2 לעבד את התא גלולה.
  5. במקביל, לבצע צעדים 1.1 - 1.4 עבור E. coli SpNox.

2. ביוסינתזה של L-xylulose ידי צימוד E. coli HjLAD וא coli SpNox להתחדשות פקטור

  1. Resuspend את כדורי תא של E. coli HjLAD וא coli SpNox בנפרד 50 mM Tris-HCl חיץ (pH 8.0) בשעה צפיפות התאים של משקל התא 5.0 גרם יבש (gDCW) / L.
    הערה: מתאם בין gDCW ואת הצפיפות האופטית נמדדה ב 600 ננומטר (OD 600) ניתן להקים כדי להקל על הניסוי. הנוסחה המשמשת בפרוטוקול זה הוא 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - 0,0965, אשר יכול להשתנות בין ספקטרומטרים שונים.
  2. מערבבים 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli HjLAD, 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli SpNox, 100 μl של 20 מ"מ NAD +, ו -150 μl של 2 M L-arabinitol בתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית ולהביא את עוצמת התגובה 2 מ"ל על ידי הוספת 550 μl של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) .
    הערה: היחס בין שני כמות biocatalysts כל תא יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ביוסינתזה של המוצר. עבור המערכת המתוארת, יחס של E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 נמצאה להיות אופטימלי עבור ביוסינתזה L-xylulose (איור 1B).
  3. דגירת תערובת התגובה ב C 30 o, 200 סל"ד במשך 8 שעות.
  4. אסוף את supernatant לאחר צנטריפוגה ב 4 מעלות צלסיוס, 3,200 XG במשך 10 מינימליnd להמשיך לכמת את הייצור L-xylulose כמתואר שלב 3 להלן.

3. Assay מדד-צבע עבור כימות L-xylulose

  1. לשאוב 100 μl של supernatant התגובה שנאספו בשלב 2.4 לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 50 μl של ציסטאין 1.5%, 900 μl של חומצה גופרתית 70%, ו -50 μl של 0.1% carbazole מומס באתנול ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך 3 פעמים.
  3. דגירת תערובת התגובה ב C 37 o, 200 סל"ד במשך 20 דקות.
  4. מדוד את הספיגה האופטית של תערובת התגובה ב 560 ננומטר (א 560) באמצעות ספקטרופוטומטר.
    1. לדלל את תערובת התגובה אם קריאת 560 תהיה מעל ל -1.

4. קיבוע של זרזי Whole-cell רקומביננטי חרוזי אלגינט סידן

  1. ממיסים אלגינט נתרן 4 גרם ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. כן פתרון אלגינט על ידי הוספת sאלגינט למי גינות כדי למנוע היווצרות גושים. מחממים את התערובת במידת הצורך.
  2. להוסיף 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli HjLAD ו -600 μl של 5.0 gDCW / L א coli SpNox ב 1.2 מ"ל 4% אלגינט מוכן בשלב 4.1 ומערבבים התאים אלגינט על ידי pipetting עדין כדי למנוע היווצרות בועה.
  3. לשאוב את ההשעיה אלגינט / תא לתוך מזרק באמצעות מחט ומוסיפים את תערובת טיפה חכם לתוך כלוריד 0.3 M סידן (2 CaCl) פתרון בכוס 100 מ"ל עם בחישה מתמדת.
    הערה: היקף הפתרון CaCl 2 המשמש היווצרות חרוז אלגינט בהחלט יספיק הטיפות אלגינט להיות שקוע לחלוטין. בנוסף, המרחק בין מחט המזרק ואת השטח של פתרון כלוריד סידן חייב להישמר בתוך טווח אופטימלי כדי להבטיח היווצרות של חרוזים כדוריים אחיד. טווח המרחק האופטימלי ניתן לקבוע ניסויברית ותלוי הקוטר הפנימי של המחט. כאומדן, מרחק של ~ 15 ± 5 ס"מ נמצאה להיות אופטימלי עבור 0.6 ס"מ מחט המזרק (פנימי קוטר).
  4. השאירו את החרוזים הפתרון CaCl 2 עבור 2 - 3 שעות ב RT ללא ערבוב כדי לאפשר היווצרות חרוזים crosslinking וג'ל.
  5. למזוג את הפתרון CaCl 2 מבלי להפריע את החרוזים על ידי שפיכת בזהירות הפתרון CaCl 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, ולהעביר את החרוזים הנותרים בתמיסה CaCl 2 לתוך צינור אחר 50 מ"ל חרוטי.
  6. שטוף את החרוזים עם 10 מיליליטר של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) חיץ שלוש פעמים כדי להסיר תאים מופרזים CaCl 2 ובטלו כמוסים.
    הערה: בכל צעד נתון, לא בצנטריפוגה חרוזים מכיוון שהדבר יהיה קרע אותם. כדי להפריד את החרוזים מן הפתרון, לאפשר ההשעיה לעמוד באין מפריע במשך 3 - 5 דקות. החרוזים יישבו בתחתית ואת החיץ לשטוף ניתן יצקלתוך מיכל אחר.
    1. אל תמחק למאגר לשטוף בשימוש. פינת למאגר לשטוף Tris-HCl בשימוש (30 מ"ל) עם הפתרון CaCl 2 משומשים שנאספו שלב 4.5.
  7. גלולה בלתי משותק E. קולי תאים על ידי צנטריפוגה של הפתרון Tris-HCl CaCl 2 ונקווה שנאספו שלב 4.6 ב 3,200 XG במשך 20 דקות. כדי לקבוע את היעילות וקיבוע, לחשב את הצפיפות של תאים בלתי-כמוס pelleted ב gDCW / L כמתואר בשלב 2.1.
  8. מעביר את חרוזי שטף משלב 4.6 לתוך צינור. בצע את השלבים 2.2 - 3.4 להעריך את ביוסינתזה L-xylulose באמצעות כל החרוזים שטף במקום כדורי תא.

5. Assay יציבות המשותק biocatalysts עבור הפקת L-xylulose

  1. לאסוף את החרוזים משלב 4.8 ולשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) חיץ ללא צנטריפוגה (כמתואר שלב 4.6).
  2. השתמש בכלשל חרוזים שטף לבצע את התגובה כמתואר בשלבים 2.2 - 3.4.
  3. חזור על שלבים 5.1 - 5.2 המספר הרצוי של מחזורי ייצור למדוד את כמות L-xylulose המיוצר supernatant התגובה בכל מחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאפשר התחדשות פקטור, סינתזת L-xylulose בוצעה במערכת biocatalytic כל תא מצמידים המכילה E. coli HjLAD וא תאי SpNox coli. בעקבות אופטימיזציה של פרמטרים שונים, השימוש החוזר של מערכת זו שופר על ידי משתק אותו חרוזי אלגינט סידן (איור 2).

הפקה L-xylulose עם התחדשות פקטור ידי צימוד E. coli HjLAD וא תאי SpNox coli.
כדי לשפר את bioconversion של L-arabinitol לתוך L-xylulose, את א coli HjLAD וא תאי SpNox coli היו מצמידים כדי לאפשרהתחדשות-פקטור. כדי להסביר את ההבדלים בביטוי חלבון וזמינות פקטור ב E. coli SpNox וא coli HjLAD תאים, מחקר השוואה של תשואות L-xylulose ב שונה E. coli SpNox -to- E. יחסי coli HjLAD בוצעו. כפי שניתן לראות בתרשים 1B, מגידול בתשואה כמו E. coli SpNox -to- E. יחס coli HjLAD עלה מ 0.13: 1 עד 1: 1. התשואה המושגת עבור יחסים 1: 1 ו 1.33: 1 הייתה שווה ערך מקסימאלי עבור מערכת מצמידים זה. כל הניסויים נוספים בוצעו עם E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD יחס של 1: 1. החל עם בריכוז ההתחלתי של 150 מ"מ L- arabinitol, השימוש E. biocatalyst coli HjLAD לבד הפיק 118 מ"מ L- xylulose אחרי 8 שעות (לנקודת רוויהעבור L-xylulose ריכוז), מייצג תשואה של 79% (תרשים 1C). לשם השוואה, את השימוש של E. coli HjLAD וא coli SpNox התאים ב יחס של 1: 1 הפיק 144 מ"מ L- xylulose, שיפור התשואה ל -96%.

אופטימיזציה של קיבוע biocatalyst Whole-cell
קיבוע של biocatalysts בחרוזי אלגינט סידן מציע יתרונות רבים, כגון כדאיות משופרת, כתוצאת סביבת ג'ל העדינה המגנה על התאים מפני הלחצים הפיסיים bioreactor. המאפיינים של חרוזים אלגינט אלה נקבעים במידה רבה על ידי פרמטרי ניסוח ועיבוד 34. כדי לייעל את תשואת הייצור של L-xylulose ידי טופס משותק של biocatalyst כל תא המצמידים שתואר לעיל, שני פרמטרים עיקריים, כלומר ריכוז אלגינט נתרן וריכוז CaCl 2, הוערכו. אלו הםהפרמטרים העיקריים הקובעים את היושרה ואת הנוקשות של חרוזים אלגינט סידן, אשר בתורו משפיע על יעילות וקיבוע biocatalyst ו דיפוזיה מולקולרית.

כפי שניתן לראות באיור 3 א, את היעילות וקיבוע biocatalyst הפגינה מגמת עלייה ככל שעלה ריכוז אלגינט נתרן בטווח של 1 - 3% (w / v). כאשר ריכוז אלגינט נתרן בשימוש במטריצה ​​וקיבוע היה פחות מ -1%, חרוזים וכתוצאה מכך היו שברירי ושבירות בשל יציבות מכנית נמוכה, שחרור רוב התאים לתוך התמיסה CaCl 2 שמסביב (מידע לא מוצג). עם הגדלת ריכוז אלגינט נתרן יותר מ -2%, החרוזים וכתוצאה מוקשים מובילים מוגזם לבעיות ב דיפוזיה מולקולרית 35 (איור 4). משנה את ריכוז CaCl 2 ניב מגמה דומה biocatalyst immobilizatיעילות יון. ריכוז קבוע של אלגינט נתרן (2% w / v) בטווח של 0.1 - 0.4- מליון CaCl 2, ריכוזי CaCl 2 התחתונות חל ירד הנוקשות של חרוזים והגדילה דליפה של תאים לתוך התמיסה שמסביב. זאת בשל ההיצע המוגבל של יוני Ca 2+ עבור cross-linking אבני guluronate על שרשרות פולימר אלגינט 36 (איור 3 ב). עם זאת, להגדיל את הריכוז CaCl 2 מ 0.3 M 0.4 M שיפר את יעילות וקיבוע biocatalyst באופן שולי בלבד. בשל היעילות וקיבוע הגבוהה (> 90%), CaCl 2 ריכוזים מעבר 0.4 M לא הוערכו. כאשר CaCl 2 ריכוזים של פחות מ -0.1 M שימשו, אגל אלגינט נתרן המכיל את biocatalyst התפרק בפתרון CaCl 2 ולא חרוזים כדוריים נוצרו (מידע לא מוצג).

כדי למקסם אתיעילות וקיבוע biocatalyst מבלי להאט את דיפוזיה מולקולרית משמעותית את החרוזים אלגינט סידן, נתרן אלגינט וריכוז CaCl 2 היו אופטימיזציה הבא לייצור L-xylulose השתפר. באמצעות טווח הריכוז זהה ליעילות וקיבוע (1 - 3% w / אלגינט נתרן נ ו -0.1 - 0.4- מליון CaCl 2), ריכוז אלגינט נתרן אופטימלי של 2% נצפתה להשיג תשואה מקסימאלית של ייצור L-xylulose (איור 4 א ). מעבר ריכוז אופטימלי זה, התשואה הראתה מגמת ירידה. זה היה צפוי, בשל בעיות דיפוזיה הקשורים קשיח היתר של חרוזי אלגינט סידן. באופן דומה, הריכוז האופטימלי 2 CaCl נמצא 0.3 M (האיור 4B). בשילוב עם הנתונים שניתן לראות בתרשים 3, ריכוז אלגינט נתרן האופטימלי (2%) ו CaCl 2 ריכוז (0.3 M) שאפשר ההיווצרות של חרוזים עםקשיחות וחדירות מתאימות הוקמו, מה שמאפשרים דליפת תא מינימאלית ותשואת ייצור מקסימלי L-xylulose.

יצוין כי, גורם נוסף אשר משפיע על היעילות הקטליטית הכוללת של biocatalyst המשותקת הוא המשקל של תרבית התאים הכמוסות. עליות היעילות הקטליטית עם הגדלת בידוד תא עד משקל בידוד אופטימלי, שמעבר לו הוא מראה מגמת ירידת 37. הסבר אפשרי לירידה זו הוא צפיפות הסלולר, אשר מעכבת דיפוזיה מולקולרית ברחבי חרוזי אלגינט סידן מקטין את היעילות הקטליטית של המערכת. באמצעות התנאי וקיבוע אופטימיזציה לעיל, ייצור L-xylulose הגבוה ביותר הושג עם טעינת התא של 3.75 (gDCW) / L 16 (מידע לא מוצג).

Reusability של biocatalysts Whole-cell ללא יכולת לזוז, חינם עבורL-xylulose הפקה.
באמצעות תנאי אופטימיזציה הוקם של 1: 1 א coli SpNox כדי E. coli יחס HjLAD, 2% (w / v) אלגינט נתרן, ו 0.3 M CaCl 2, משותקת מצמידים פלט biocatalyst כל תא תשואה L-xylulose מקסימלי של 64%, לעומת תשואה גבוהה בהרבה של 96% עבור חינם המערכת כולה תאים מצמידים (מחזור 1 של איור 5). ראוי לציין, כי התשואה של משותקת E. coli HjLAD בתא לבדו היה רק 32.5% (מידע לא מוצג), נמוכה מזו של המערכת בשילוב משותקת כמו גם את מערכת biocatalyst אחת חינם (79%, איור 1 ג). הפחתה זו הייתה צפויה כמו קיבוע ידוע להפחית את פעילותם של biocatalysts, ככל הנראה בשל למצע מגבלות דיפוזיה, אבל פוצתה היתרון של שימוש חוזר שיפור של biocatalyst על חוסר תנועה. השפעה זו על יציבות biocatalyst היאשמפגין מגמת הירידה בתשואת L-xylulose שנצפה על העמדת המערכות החופשיות משותקות שוב ושוב תהליך התגובה יצווה, שמוצגת באיור 5. התשואה עבור המערכת בחינם נרשמה ירידה חדה הרבה יותר מזו של המערכת המשותקת, מה שמעיד על איבוד מהיר יותר של פעילות האנזים במערכת חינם. כתוצאה מכך, הן היו מערכות תשואה דומה L-xylulose עבור מחזור ייצור 2. בסוף 7 מחזורים רצופים מחדש בשימוש, biocatalysts הכמוס שמר על היציבות שלהם שמר 65% מהתשואה המקורית בעוד כל התא חינם מערכת שומרת פחות מ -10% של יכולתה לייצר L-xylulose. מכך ניתן להסיק כי biocatalysts המשותקת יכולה לעשות בה שימוש חוזרת ביעילות לייצור L-xylulose וכי התועלת של שימוש חוזר משופר ויציבות הביאה על ידי קיבוע עולים בהרבה על הירידה בפעילות של biocatalyst, המקנה יתרון משמעותי לתהליך ההפקה עלמערכת כל תא בחינם.

איור 1
איור 1. מערכת שלמה תאים יחד להפקת biocatalytic של xylulose L. (א) סכמטי המדגים את תגובת התחדשות פקטור המתרחשת במערכת כל תא מצמידים המהווה E. קולי תאים מחסה HjLAD או SpNox, בהתאמה. (ב) וריאציה בתשואת L-xylulose עם E. השונה coli SpNox כדי E. יחסי HjLAD coli. (C) L-xylulose תשואה מתוך biocatalyst כל תא מורכבת E. רק coli HjLAD בהשוואה לזו של מערכת שלמות תאי מצמידים המורכבים E. coli HjLAD וא coli SpNox תאים מסוגלים התחדשות פקטור. המגרשים המוצגים מייצגים ממוצע STAסטיית ndard של שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
קיבוע איור 2. של biocatalysts-שלמות התא באמצעות Encapsulation ב חרוזי אלגינט. סכמטי המייצג את ההיווצרות של חרוזים אלגינט בגודל Ca 2+ האחיד על ידי תוספת dropwise של השעית אלגינט תאי נתרן פתרון של סידן כלורי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
פרמטרי איור 3. השפעה על היעילות של קיבוע של biocatalyst Whole-תא חרוזים אלגינט. יעילות קיבוע כפונקציה של (א) אלגינט נתרן (% w / v) (B) CaCl 2 (M) ריכוז. המגרשים המוצגים מייצגים את הסטייה הממוצעת ורמה שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
הערכת איור 4. של תשואה של L-xylulose מן biocatalyst Whole-cell מצמידים ללא יכולת לזוז כפונקציה של (א) אלגינט נתרן (% w / v) (B) CaCl 2 (M) ריכוז. המגרשים המוצגים מייצגים את הסטייה הממוצעת ורמה שלושה ניסויים בלתי תלויים.כחוש וגבוה "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. הערכה של Reusability biocatalyst. התשואה של ייצור L-xylulose עבור 7 מחזורים רצופים של שימוש חוזר של עצמו משותק ואינו חינם biocatalyst כל תא מצמידים מוצג באפור כהה לבהיר, בהתאמה. העלילה לראות מייצגת את הסטייה הממוצעת ורמה שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתוחים טכנולוגיים אחרונים אפשרו התפרצות של המסחור של Biotherapeutics רקומביננטי, וכתוצאה מכך עלייה הדרגתית בשווי השוק שלהן בתעשיית הביוטכנולוגיה. קידום אחת כזו הוא כניסתו של הנדסת מטבולית מיקרואורגניזמים רקומביננטי, אשר הוכיחה הבטחה גדולה בהקמת 38 מערכות תעשייתיות להרחבה. כמו במרבית התהליכים, המסחור המוצלח של ביומולקולות רקומביננטי המיוצרת על ידי חיידקים מהונדסים גנטי תלוי מאוד תשואת הייצור של המערכת 39. זה הוביל את הפיתוח המואץ של גנטיקה "בכוח הזרוע" 39, שבו אבולוציה מכוונת של אנזימי biocatalytic יושמה לצורך שיפור פעילות biocatalyst 3. עם זאת, עבור מסלולי מטבוליים מסוימים, כגון מסלולי חיזור, שיפור biocatalyst בלבד אינו מספיק כדי להשפיע economization ייצור בשל ההשפעה המהותית של othאה דרישות תגובה חיוניות, כגון קו-פקטורים יקרים. מדרוג כלפי מעלה של מערכת כזו, אפילו עם biocatalysts משופרת, ישמש אך ורק כדי להגדיל את עלויות הייצור. לפיכך, שיטות אסטרטגיות נוספות נדרשות למסחור bioreactions המעורב יחסי stoichiometric של קו-פקטורים. בנוסף, המחזור של biocatalyst הוא גם הכרחי לשיפור הכדאיות הכלכלית של Bioprocess. כדי להתגבר על השפעת הגבלת צריכת פקטור מהירה ויכולת השימוש חוזרת עניי biocatalysts כל התא, פתחנו בעבר משותק, מערכת biocatalytic כל תא מצמיד להתחדשות פקטור מחדש לשימוש יציב 16. המתוארים במחקר הנוכחי הם הפרוצדורות נדרשו זוג ושיתוף לשתק שני biocatalysts כל תא תשואה ויכולת שימוש חוזר biotransformation משופרות, יחד עם תוצאות הנציג.

גורם קריטי כדי להיחשב עבור צימוד biocat כל התאalysts הוא החזקת שליטה מדויקת התנאים הקבועים לזירוז חלבון היווצרות מוצר biocatalytic כדי להבטיח שחזור של המערכת. וריאציות בפרמטרים כמו האינדוקציה OD 600, זמן אינדוקציה, וריכוז IPTG יש להימנע כדי למזער תצווה אל תצווה וריאציה. בנוסף, הערכה מחדש של יחס תא אל התא נדרשת biotransformations השונה. ראוי לציין, כי א coli HjLAD: E. coli SpNox יחס של 1: 1 דיווח במחקר זה נקבע על ידי אופטימיזציה הניסיון ולא יחס stoichiometric התיאורטי. עבור קיבוע של biocatalysts כל תא רקומביננטי חרוז אלגינט סידן, ישנם מספר צעדים קריטיים כדי להבטיח אחידות לגבי נוקשות החרוז וההפצה של תאים. ראשית, הפתרון אלגינט חייב להיות מוכן לאט על ידי אלגינט נתרן הוספת למים, ולא להיפך כדי למנוע clumping כי שיתוף ULD להשפיע על ריכוז אלגינט המקומי ובכך מידת cross-linking. שנית, pipetting העדין צריך להיות מועסק בעת טיפול השעית אלגינט תאים כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר, גורמות מאמץ גזירה על התאים הכמוסים, לעכב העברת מסה יעילה ואף עלול לגרום החרוזים לצוף. במקרה בועות אוויר מוכנסים ההשעיה, מאפשרים ההשעיה אלגינט תאים לעמוד באין מפריע במשך 20 - 30 דקות כדי לאפשר לברוח בועות. שלישית, בעת ביצוע החרוזים, השעית התא-אלגינט יש להוסיף לאט ובזהירות באופן טיפה חכמה לתוך נפח מספיק של פתרון כלוריד סידן גודל ומורפולוגיה אחידים. חרוזים שקועים באופן חלקי ב כלוריד סידן יהיו צורה לא סדירה ונוקש עניים שיכול לתרום דליפת תא. לבסוף, כדי למנוע השתנות בהיקף תגובת חיץ לשטוף שיורים, את חרוזי שלב 4.8 ניתן מחק קל עם נייר סינון (לא אוויר יבש).

= ילדה "jove_content"> אסטרטגיות נפוצות התחדשות פקטור כוללות שיתוף תרבות של תאי מחסה אנזימי משלימה תפקודית שיתוף ביטוי של אנזימים אלה באותו התא. המערכת המתוארת מעסיקה אסטרטגיה שונה של צימוד E. הנפרד coli SpNox וא בתרביות תאי coli HjLAD, המציעות שליטה טובה יותר בשמירה על יחס רצוי בין שני האנזימים. בנוסף, תאי מבטאי חלבונים יחידים חשופים ללחץ פחות מאלו חלבוני שיתוף להביע מרובים, אשר עלול להוביל misfolding חלבון מופחת ביטוי חלבון מוגבר 40,41. לפיכך, צימוד כל תא ישיר מציג את היכולת לתווך תהליכים קטליטיים רב-אנזים מבלי להתפשר תשואת מוצר באופן משמעותי. עם זאת, אסטרטגיות ותיקות כגון בחירה זהירה של יזמים חיידקי עם משתנה כוח 42,43 ושיפורי אתרי קישור הריבוזום 44 יכול להיות פקידד כדי למתן את השליטה המוגבלת על היחס של אנזימי יעד במערכות שיתוף תרבות או שיתוף ביטוי. בין טכניקות קיבוע רבות, אנקפסולציה מציג יתרונות מרובים עבור משתק biocatalysts כל התא פני שיטות חלופיות כגון cross-linking ו ספיחה, אשר מתאימות יותר עבור אנזימים מטוהרים. Encapsulation של תאים יכול להתבצע גם במגוון חומרים ביולוגיים כמו אגר, chitosan, החניכיים, carrageenan, ג'לטין ו אלגינט 45 לשיפור השימוש החוזר של biocatalysts. עם זאת, אנקפסולציה אלגינט סידן הוכחה להיות גישה היעילה ביותר מבחינת ייצור יעילות biomolecule וקיבוע 46,47.

מגבלה עיקרית אחת של ניצול biocatalysts כל תא חיידקים היא היכולת המינימאלית עבור שינוי שלאחר translational של חלבוני Heterologous wild-type E. coli 48. זה מגביל את השימוש המוצלח של biocatalysts איקריוטיים within מערכת זו. חלופה להתגבר על מגבלה זו יכולה להיות בשימוש של אורגניזמים כמו שמרים, כי הם מצוידים טוב יותר עם מכונות translational פוסט איקריוטיים. מגבלה נוספת של המערכת המתוארת קשורה לשימוש של חוסר תנועה עבור שימוש חוזר משופר. קיבוע הוא אסטרטגיה משותפת חסכונית מועסקת על מנת לנטרל את היציבות העניה של biocatalysts ולשפר התחלופה שלהם על ידי פישוט Bioprocess 49 - 51. הפרמטרים העיקריים המשפיעים על ביצועי קטליטי של biocatalysts כל התא הכמוס כוללים ריכוז אלגינט נתרן, ריכוז CaCl 2, טעינת תא גודל חרוז. חשוב להכיר בכך פרמטרים אלה אינם תלויים זה בזה. ככזה, ניתוח מקיף של כל הגורמים בתוך מחקר יחיד הוא מאוד זמן רב, ולכן יש צורך לבחור את הפרמטרים החשובים ביותר עבור אופטימיזציה. הערכנו והציג כאן הן ההשפעות שלשני פרמטרים, אלגינט נתרן בריכוז 2 CaCl. למרות שלא נדונו בפירוט כאן, יש לנו קודם לכן בצע את אופטימיזציה של טעינת תא, השוואת התלות של תשואה על המשקל של תאים משותקים 16. דוחות בספרות מצביעים וריאציה של גודל חרוז יכול גם לווסת את תשואת הייצור על ידי הגדלת אנקפסולציה אנזים, שיפור פעילות באמצעות הגדלת שטח פנים של המערכת המשותקת או על ידי שינוי דיפוזיה של מצעים ומוצרים בשל מאפייני תחבורת שינו. בהתאם לתגובות biocatalytic נדונות, מבחר של גורמים קריטיים חלופיים עשוי להידרש, מה שעלול להוביל את הדור של קבוצה שונה של תנאים אופטימליים. מחקר מפורט להקמת תנאים אופטימליים פרמטרים נוספים מספק היקף עבור שיפור נוסף בביצועים של המערכת כולה תאים יחד.

לסיכום, אנו מדווחים על implemen הניסיוןשינוע של מערכת biocatalytic כל תא מצמידים המשותקת חרוזי אלגינט סידן, הממחישה את הייצור המשופר של L-xylulose. על ידי הבעת אנזימים רקומביננטי שונים המאפשרים מסלולי biocatalytic תלוי פקטור אחרים, תשואות גבוהות של מולקולות רבות רלוונטיות מבחינה ביולוגית ניתן להשיג באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. בנוסף, מערכת זו יכולה להיות מורחבת כדי להכיל יותר משני biocatalysts רקומביננטי לביוסינתזה רב-אנזים בסיר אחד המוצרים 52 ויישומים אחרים מאשר ייצור biocatalytic, כגון חיישנים ביולוגיים חיידקים עבור צריכת חמצן ביוכימית 53. ניצול של תכונה סינרגיסטי של מערכת זו, אנקפסולציה של קונסורציומים חיידקים סימביוטיים ניתן להשתמש עבור מספר עצום של יישומים כגון bioremediation 54 - 56, bioprocessing כל תא דלק ביולוגי 57, קידום גידול צמחים בקרקע bioaugmentation 58 ו biomining להתאוששות מתכת 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים. העיתון שיתפשר דיווח מתודולוגיה מפורטת בכדי ליצור מערכת biocatalytic כל תא מצמידים משותק חרוזים אלגינט. חידושים מדעיים דווחו במחקר קודם 16.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר למדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (NRF-2013R1A1A2012159 ו NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk האוניברסיטה, המחלקה להנדסה כימית MCubed תוכנית באוניברסיטת מישיגן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics