Immobilisering av Multi-biocatalysts i alginatkuler for kofaktor Regeneration og forbedret Reusability

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presentert er protokollen for ko-immobiliserte biokatalysatorer hel-celle for regenerering kofaktor og forbedret gjenbruk, ved hjelp av produksjon av L-xylulose som et eksempel. Kofaktor regenereringen oppnås ved kobling av to Escherichia coli-stammer som uttrykker funksjonelt komplementære enzymer; hel-celle biokatalysator immobilisering oppnås ved celle innkapsling i kalsium alginatkuler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi har nylig utviklet en enkel, gjenbrukbar og koplet hel-celle biokatalytisk system med mulighet for kofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering for økt produksjonsutbytte og vedvarende syntese. Beskrevet herved er den eksperimentelle fremgangsmåte for utvikling av et slikt system som består av to E. coli-stammer som uttrykker funksjonelt utfyllende enzymer. Til sammen kan disse to enzymer fungere samarbeide for å megle regenerering av dyre kofaktorer for å forbedre produktutbytte av bioreaction. I tillegg er rapportert fremgangsmåte for å syntetisere en immobilisert form av det koblede system biokatalytisk ved innkapsling av hele celler i kalsium alginatkuler. Som et eksempel presenterer vi den forbedrede biosyntesen av L-xylulose fra L-arabinitol ved kobling E. coli-celler som uttrykker enzymene L-arabinitol dehydrogenase eller NADH-oksidase. Under optimale betingelser og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, som er høyere enn de som er rapportert i litteraturen. Den immobiliserte formen av de sammenkoblede hel-celle biokatalysatorer vist god driftsstabilitet, opprettholde 65% av utbyttet oppnådd i den første syklusen etter 7 sykluser av påfølgende gjenbruk, mens det frie cellesystemet nesten helt mistet den katalytiske aktivitet. Derfor metodene som presenteres her, har to strategier som kan bidra til å forbedre den industrielle produksjon av L-xylose, samt andre verdiøkende forbindelser som krever bruk av kofaktorer generelt.

Introduction

Reduktiv hel-celle biotransformasjon ved hjelp av mikroorganismer er blitt en utbredt metode for chemo-enzymatisk syntese av kommersielt og terapeutisk viktige biomolekyler 1 - 3. Den presenterer flere fordeler i forhold til bruken av isolerte enzymer, spesielt eliminering av kostnadskrevende nedstrøms renseprosesser, og påvisning av forlenget levetid 4 - 7. For biokatalytiske veier hvor kofaktorer som er nødvendige for produktdannelse, hel-celle-systemer har potensial til å gi in situ kofaktor regenerering ved tilsetning av billige elektrondonerende ko-substrater 5,8,9. Imidlertid er denne kapasiteten redusert for reaksjoner som krever en støkiometrisk konsentrasjon av sjeldne eller kostbare ko-substrat 10 - 13. Sammen med dårlig gjenbruk av hele celler, hindrer dette etablering av en skalerbar og kontinuerlig proDette skjer system. Strategiske modifikasjoner av hel-celle-systemer for disse kofaktor-avhengige biotransformasjoner er nødvendig for å overvinne de ovennevnte begrensninger. Nærmere bestemt, er kombinasjonen av hel-celle-biokatalysatorer som samarbeider har vist seg å betydelig forbedre produktivitet og stabilitet av de næret enzymene 14. Disse faktorene, som ofte er avgjørende for å muliggjøre storskala produksjon av kommersielt levedyktige produkter, kan optimaliseres ytterligere ved co-immobilisere biokatalytiske mikrober 15. Vi har nylig utviklet en enkel og gjenbruk hel-celle biokatalytisk system som gjør at både kofaktor regenerering og biocatalyst immobilisering for L-xylulose produksjon 16. I denne studien ble dette systemet brukt som et eksempel for å illustrere de eksperimentelle prosedyrer for å bruke disse to strategiene for økt biotransformasjon utbyttet og biocatalyst gjenbruk.

L-xylulose tilhører en CLAss av biologisk nyttige molekyler kalt sjeldne sukker. Sjeldne sukker er unike monosakkarider eller sukkerderivater som skjer svært sjelden i naturen, men spille viktige roller som anerkjennelse elementer i bioaktive molekyler 17,18. De har en rekke bruksområder fra søtningsmidler, funksjonell mat til potensielle legemiddel 19. L-xylulose kan brukes som en potensiell inhibitor av flere a-glukosidaser, og kan også brukes som en indikator for hepatitt eller skrumplever 17,20. Høy virkningsgrad konvertering av xylitol til L-xylulose i hel-cellesystemer er blitt rapportert tidligere i Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 og Escherichia coli 26. I E. coli, ble det imidlertid oppnådd bare ved hjelp lav (<67 mm) xylitol konsentrasjoner 26 på grunn av potensielle inhiberende virkninger av en initial xylitol konsentrasjon høyere enn 100 mm på xylitol-4-dehydrogenase aktivitet 21,26. Den termodynamiske likevekt mellom xylulose og xylitol har vist seg å sterkt favorisere dannelsen av xylitol 25,27. I tillegg er xylulose utbytte begrenset av mengden av dyre kofaktorer som må tilføres i fravær av en in situ-kofaktor regenerering system. Sammen utgjør disse faktorene begrenser mulighetene for skalering i bærekraftige systemer for L-xylulose biosyntese.

For å overvinne disse begrensningene og forbedre L-xylulose biotransformasjon yield, var det strategiske kofaktor regenerering ansatt først ved å etablere en kombinert hel-celle biokatalytisk system. Nærmere bestemt, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) fra Hypocrea jecorina (HjLAD), et enzym som er i L-arabinose katabolismen av sopp, ble valgt for å katalysere omdannelsen av L-arabinitol inn i L-xylulose 28,29 . Som mange biosyntetiske enzymer, en stor limitation HjLAD er at det krever en støkiometrisk mengde av den kostbare nikotinamidadenindinukleotid kofaktor (NAD +, den oksyderte form av NADH) for å utføre denne omdannelsen. NADH oxidase funnet i Streptococcus pyogenes (SpNox) har vist seg å vise høy kofaktor-regenerering aktivitet 30,31. Benytte seg av denne egenskap av SpNox, E. coli-celler som uttrykker HjLAD for fremstilling av L-xylulose ble koblet med E. coli-celler som uttrykker SpNox for regenereringen av NAD + for å øke den L-xylulose produksjon avbildet ved den koblede reaksjonen vist i Figur 1A. Under optimale forhold og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150 mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, noe som gjør dette system mye mer effektiv enn de som er rapportert i litteraturen.

Strategien for hel-celle immobilisering ble ansatt ved ytterligere styrke gjenbruk av kombinert biocatalytic system. Vanlig brukte metoder for hel-celle immobilisering inkluderer adsorpsjon / kovalent kobling til faste matriser, kryssbinding / entrapment og innkapsling i polymere nettverk 32. Blant disse metodene, er den mest egnede metode for celle immobilisering er innkapsling i kalsium alginatkuler. Deres milde gel-egenskapene, inert vandig matrise og høy porøsitet bidra til å bevare de fysiologiske egenskaper og funksjonalitet av de innkapslede biologiske 33. Derfor er koplet biokatalysator system inneholdende både E. coli-celler som HjLAD eller SpNox ble immobilisert på kalsium alginat perler til å aktivere flere sykluser av L-xylulose produksjon (figur 2) sikret immobilisert biocatalyst systemet demonstrert god driftsstabilitet, opprettholde 65% av konverterings utbyttet av den første syklusen etter 7 runder med påfølgende gjenbruk, mens den frie cellesystemet nesten helt mistet sin katalytiske aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hel-celle Biocatalysts Forberedelse

MERK: rekombinant E. coli-celler som pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 blir heretter referert til som E. coli SpNox og E. coli HjLAD hhv.

  1. Vaksinere en enkelt koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium supplementert med kanamycin (50 ug / ml) og inkuberes i en risteinkubator O / N ved 37 ° C, 250 rpm.
  2. Fortynne kulturen ved 1: 100 i 200 ml frisk LB inneholdende 50 pg / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C, 250 opm inntil OD 600 når ~ 0,6.
  3. Indusere HjLAD proteinekspresjon ved tilsetning av 0,1 mM isopropyl β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) til kulturmediet og inkuber ved 16 ° C, 180 rpm i 16 timer.
    1. Alternativt utføre induksjon ved 25 o C, 200 rpm i 6 timer hvis den L-xylulose-biosyntese (trinn 2 nedenfor) er utført på samme dag.
  4. Høste indusert E. coli HjLAD cellene ved sentrifugering ved 3200 xg i 20 min ved 4 o C. Kast supernatanten og gå videre til trinn 2 for å behandle cellen pellet.
  5. Parallelt utføre trinn 01.01 til 01.04 for E. coli SpNox.

2. biosyntesen av L-xylulose av Coupling E. coli HjLAD og E. coli SpNox for kofaktor Regeneration

  1. Resuspender cellepelletene av E. coli HjLAD og E. coli SpNox hver for seg i 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0) ved en celletetthet på 5,0 g tørrcellevekt (gDCW) / L.
    Merk: det kan etableres en sammenheng mellom gDCW og optisk tetthet målt ved 600 nm (OD 600) for å lette eksperimentet. Formelen som brukes idenne protokollen er en gDCW / L = 0,722 * OD 600 til 0,0965, noe som kan variere mellom ulike spektrometre.
  2. Bland 600 mL av 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 mL av 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 ul 20 mM NAD +, og 150 pl av 2 M L-arabinitol i en 14 ml rundbunnet rør og bringe reaksjonsvolumet til 2 ml ved tilsetning av 550 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
    Merk: Forholdet mellom de to hel-celle biokatalysatorer mengde kan optimaliseres for å øke biosyntese av produktet. For det beskrevne system, et forhold på E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 ble funnet å være optimal for L-xylulose-biosyntese (figur 1B).
  3. Inkuber av reaksjonsblandingen ved 30 ° C, 200 rpm i 8 timer.
  4. Samle supernatanten etter sentrifugering ved 4 ° C, 3200 x g i 10 min ennd fortsette å kvantifisere den L-xylulose produksjon som beskrevet i trinn 3 nedenfor.

3. kolorimetrisk analyse for L-xylulose Kvantifisering

  1. Sug av 100 ul av reaksjons supernatanten oppsamlet fra trinn 2,4 til et 1,5 ml rør.
  2. Tilsett 50 ul av 1,5% cystein, 900 ul av 70% svovelsyre, og 50 ul 0,1% karbazol oppløst i etanol og bland forsiktig ved å vende røret 3 ganger.
  3. Inkuber av reaksjonsblandingen ved 37 ° C, 200 rpm i 20 min.
  4. Måle den optiske absorbans av reaksjonsblandingen ved 560 nm (A 560) ved hjelp av et spektrofotometer.
    1. Fortynn reaksjonsblandingen hvis A 560 lesing er over 1.

4. Immobilisering av rekombinante Hel-celle Katalysatorer i alginat perler

  1. Oppløs 4 g natriumalginat i 100 ml destillert vann. Forbered alginat løsning ved å legge til sodium alginat til vann for å unngå dannelse av klumper. Varm opp blandingen hvis det er nødvendig.
  2. Legg 600 mL av 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD og 600 mikroliter av 5,0 gDCW / L E. coli SpNox i 1,2 ml 4% alginat forberedt i trinn 4,1 og bland cellene og alginat ved forsiktig pipettering å unngå bobledannelse.
  3. Aspirer alginat / cellesuspensjonen inn i en sprøyte ved hjelp av en kanyle og blandingen ble dråpevis inn i en 0,3 M kalsiumklorid (CaCl 2) oppløsning i en 100 ml begerglass med kontinuerlig omrøring.
    Merk: Volumet av CaCl 2 løsning som brukes for alginat perle dannelse bør være nok for de alginat dråper å være helt under vann. I tillegg må avstanden mellom kanylen og overflaten av kalsiumkloridoppløsningen holdes innenfor et optimalt område for å sikre dannelsen av jevnt sfæriske kuler. Den optimale avstanden serien kan bestemmes eksperimentally og er avhengig av den indre diameter av nålen. Som et anslag, ble en avstand på ~ 15 ± 5 cm funnet å være optimal for en 0,6 cm (indre diameter) sprøytespissen.
  4. La perlene i CaCl2-løsning for 2 - 3 timer ved romtemperatur uten omrøring for å tillate tverrbindings og gelperler formasjonen.
  5. Dekanter CaCl2 oppløsningen uten å forstyrre kulene ved forsiktig å helle den CaCl2-løsning i et 50 ml konisk rør, og overføre de gjenværende kuler i CaCl2-oppløsning inn i en annen 50 ml konisk rør.
  6. Vask kulene med 10 ml av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) buffer tre ganger for å fjerne overdreven CaCl2 og un-innkapslede celler.
    NOTAT: På et gitt trinn, ikke sentrifuger kulene som gjør dette vil briste dem. For å skille kulene fra oppløsningen, lar suspensjonen stå i ro i 3 - 5 min. Kulene vil legge seg på bunnen, og vaskebufferen kan dekanteresinn i en annen beholder.
    1. Ikke kast den brukte vaskebuffer. Pool den brukte Tris-HCl-vaskebuffer (30 ml) med den brukte CaCl2-løsning oppsamlet fra trinn 4.5.
  7. Klumpe un-immobilisert E. coli-celler ved sentrifugering av den samlede CaCl2 og Tris-HCl-oppløsning oppsamlet fra trinn 4.6 ved 3200 xg i 20 min. For å bestemme effektiviteten immobilisering, beregne tettheten av de pelleterte un-innkapslede celler i gDCW / L som beskrevet i trinn 2.1.
  8. Overfør de vaskede perlene fra trinn 4,6 til et rør. Følg trinn 2,2 - 3,4 for å evaluere den L-xylulose biosyntese ved hjelp av alle de vaskede kuler i stedet for cellepelletene.

5. Stabilitet Assay av immobilisert Biocatalysts for L-xylulose Produksjons

  1. Samle perlene fra trinn 4.8 og vask to ganger med 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) buffer uten sentrifugering (som beskrevet i trinn 4.6).
  2. Bruk alleav de vaskede perlene for å utføre reaksjonen som er beskrevet i trinn 2,2 - 3,4.
  3. Gjenta trinn 5.1 til 5.2 for ønsket antall produksjonssykluser og måle mengden av L-xylulose produsert i reaksjonen supernatanten i hver syklus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å aktivere kofaktor regenerering, ble L-xylulose-syntese utført i en koplet hel-celle biokatalytisk system inneholdende E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler. Etter optimaliseringen av forskjellige parametere, ble gjenbruk av dette systemet forbedres ved å immobilisere den i kalsium alginatkuler (figur 2).

L-xylulose produksjon med kofaktor Regenerering av Coupling E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler.
For å forbedre bioomdanning av L-arabinitol inn i L-xylulose, E. coli HjLAD og E. coli-celler SpNox koblet for å aktiverekofaktor gjenfødelse. Å ta hensyn til forskjeller i proteinuttrykk og kofaktor tilgjengelighet i E. coli SpNox og E. coli HjLAD-celler, en sammenligningsstudie av den L-xylulose utbytte ved forskjellige E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD forholdstall ble utført. Som vist i figur 1B, økte utbytte som E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD andelen økte fra 0,13: 1 til 1: 1. 1 og 1.33:: Resultatene oppnådd for forholdstall en utbyttene 1 var tilsvarende og maksimal for dette kombinert system. Alle ytterligere forsøk ble utført med E. coli SpNox -to- E. coli HjLAD forhold på 1: 1. Fra og med en initial konsentrasjon på 150 mM L-arabinitol, bruk av E. coli HjLAD biocatalyst alene produsert 118 mM L-xylulose etter 8 timer (metningspunktfor L-xylulose konsentrasjon), som representerer et utbytte på 79% (figur 1C). Til sammenligning er bruken av E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler i en 1: 1 ratio fremstilt 144 mM L-xylulose, forbedre utbyttet til 96%.

Optimalisering av Hel-celle biocatalyst Immobilisering
Immobilisering av biokatalysatorer i kalsium alginatkuler byr på mange fordeler, for eksempel forbedret levedyktighet, som et resultat av mild gelen miljø som beskytter cellene fra de fysiske påkjenninger i en bioreaktor. Egenskapene til disse alginatkuler er i stor grad bestemt av formulering og prosessparametere 34. For å optimalisere produksjonen utbyttet av L-xylulose med en immobilisert form av den koblede hel-celle biokatalysator som er beskrevet ovenfor, på to hovedfaktorer, nemlig natriumalginat konsentrasjon og CaCl2-konsentrasjon, ble evaluert. Disse erhovedparametrene som bestemmer integritet og stivhet av kalsium alginatkuler, som i sin tur påvirker biokatalysator immobilisering effektivitet og molekylær diffusjon.

Som vist i figur 3A, er biokatalysator immobilisering effektivitet vist en økende trend med økende natriumalginat konsentrasjon i området på 1 - 3% (w / v). Når natriumalginat konsentrasjonen som blir benyttet i det immobiliserende matriks var mindre enn 1%, ble de resulterende perlene var skjøre og lett ødelagt på grunn av lav mekanisk stabilitet, frigjør de fleste av cellene i det omkringliggende CaCl2-løsning (data ikke vist). Ved økning av natriumalginat konsentrasjon til mer enn 2%, av de resulterende perler herdet overdrevet ledende til problemer i molekylær diffusjon 35 (figur 4). Varierende CaCl 2 konsentrasjonen ga en lignende trend i biocatalyst immobilization effektivitet. For en fastsatt konsentrasjon av natrium alginat (2% v / v), og i området fra 0,1 til 0,4 M CaCl2, lavere CaCl 2 konsentrasjoner resulterte i redusert stivhet av kulene og økt lekkasje av celler inn i den omkringliggende løsningen. Dette er på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av Ca 2 + -ioner for kryssbinding av guluronate blokkene på alginat polymerkjedene 36 (figur 3B). En økning av CaCl2-konsentrasjon fra 0,3 M til 0,4 M forbedret biokatalysator immobilisering effektivitet bare marginalt. På grunn av den høye virkningsgrad immobilisering (> 90%), CaCl 2 konsentrasjoner utover 0,4 M ikke ble vurdert. Når CaCl 2 konsentrasjoner på mindre enn 0,1 M, ble brukt, natriumalginat dråpen som inneholder biokatalysatoren falt fra hverandre i CaCl2-løsning, og ingen sfæriske kulene ble dannet (data ikke vist).

For å maksimerebiokatalysator immobilisering effektivitet uten i betydelig grad å bremse ned den molekylære diffusjon i de kalsium alginatkuler, natrium-alginat og CaCl2-konsentrasjonen ble optimalisert for neste forbedret L-xylulose produksjon. Ved å bruke det samme konsentrasjonsområde som for immobilisering effektivitet (1 - 3% w / v natriumalginat og 0,1 til 0,4 M CaCl 2), en optimal natriumalginat konsentrasjon på 2% ble observert for å oppnå maksimal utbytte av L-xylulose produksjon (figur 4A ). Utover dette optimal konsentrasjon, utbyttet viste en nedadgående trend. Dette var ventet, på grunn av problemene i diffusjon forbundet med overdreven stivhet av kalsium alginatkuler. Tilsvarende ble den optimale CaCl2-konsentrasjonen funnet å være 0,3 M (figur 4B). Kombinert med de data som er vist i figur 3, den optimale natriumalginat konsentrasjon (2%) og CaCl2-konsentrasjonen (0,3 M) som tillot dannelsen av perler medegnet stivhet og permeabilitet ble etablert, slik minimal celle lekkasje og maksimal L-xylulose produksjonsutbyttet.

Det bør bemerkes at en annen faktor som påvirker den totale katalytiske effektivitet av den immobiliserte biokatalysator er vekten av den innkapslede cellekultur. De katalytiske effektivitet øker med økende celle inokulum opp til en optimal inokulum vekt, utover hvilket den viser en avtagende tendens 37. En mulig forklaring for denne reduksjonen er cellulær overbefolkning, som hindrer molekylær diffusjon gjennom kalsium- alginatkuler og minsker den katalytiske effektiviteten av systemet. Ved hjelp av den optimaliserte immobilisering betingelsen ovenfor, ble den høyeste L-xylulose produksjonen oppnådd med en celle lasting av 3,75 (gDCW) / l 16 (data ikke vist).

Gjenbruk av det immobiliserte og gratis Hel-celle Biocatalysts forL-xylulose Production.
Ved hjelp av den etablerte optimalisert tilstand av 1: 1 E. coli SpNox til E. coli HjLAD ratio, 2% (vekt / volum) natriumalginat, og 0,3 M CaCl2, den immobiliserte koplet hel-celle biokatalysator utgangs en ​​maksimal L-xylulose utbytte på 64%, sammenlignet med en mye høyere utbytte av 96% for den frie koplet hel-cellesystem (syklus 1 i figur 5). Legg merke til at utbyttet av immobilisert E. coli HjLAD celle alene var bare 32,5% (data ikke vist), lavere enn den til det immobiliserte koblede system, så vel som den frie enkelt biokatalysator system (79%, figur 1C). Denne reduksjonen var forventet da immobilisering er kjent for å redusere aktiviteten av biokatalysatorer, muligens på grunn av substratet diffusjonsbegrensninger, men ble kompensert ved fordelen av forbedret gjenbruk av en biokatalysator ved immobilisering. Denne virkning på stabiliteten av biokatalysatoren erdemonstreres ved den nedadgående trend i L-xylulose utbytte observert på å underkaste den frie og immobiliserte systemer gjentatte ganger til en satsvis reaksjon prosess, vist i Figur 5. Utbyttet av den frie system viste en mye brattere fall enn den til det immobiliserte system, noe som indikerer en mer hurtig tap av enzymaktivitet i det frie systemet. Som et resultat av begge systemer hadde en tilsvarende L-xylulose utbytte for produksjonssyklusen 2. Ved slutten av 7 sykluser av påfølgende gjenbruk, opprettholdt de innkapslede biokatalysatorer deres stabilitet og tilbakeholdt 65% av det opprinnelige utbyttet mens den frie helcelle- systemet opprettholdt mindre enn 10% av dens evne til å produsere L-xylulose. Dette viser at de immobiliserte biokatalysatorer kunne igjen anvendes effektivt for fremstilling av L-xylulose og at fordelen med forbedret gjenbruk og stabilitet forårsaket av immobilisering langt oppveier reduksjon i aktiviteten av biokatalysatoren, overdragelse en betydelig fordel til produksjonsprosessen i løpeten fri hel-cellesystem.

Figur 1
Figur 1. Sammen Hel-celle system for biokatalytiske Produksjon av L-xylose. (A) Skjematisk illustrerer kofaktor regenerering reaksjonen som finner sted i en koplet hel-cellesystem som omfatter E. coli-celler som HjLAD eller SpNox, henholdsvis. (B) Variasjon i utbyttet av L-xylulose med forskjellig E. coli SpNox til E. coli HjLAD forholdstall. (C) L-xylulose utbytte fra en hel-celle biokatalysator består av bare E. coli HjLAD sammenlignet med en koplet hel-celle-system som består av E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler i stand til kofaktor regenerering. Tomtene er vist representerer gjennomsnittet og standard avvik på tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. immobilisering av Whole-celle Biocatalysts via Innkapsling i alginatkuler. Skjematisk representerer dannelsen av jevnstore Ca 2+ alginatkuler ved dråpevis tilsetning av natrium alginat-cellesuspensjonen til en løsning av kalsiumklorid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Parametere som påvirker effektiviteten av Immobilisering av hel-celle biokatalysator i alginatkuler. Immobilisering effektivitet som en funksjon av (A) natriumalginat (% w / v) 2-konsentrasjon (M) (B) CaCl. Tomtene er vist representerer gjennomsnitt og standardavvik av tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Evaluering av Utbyttet av L-xylulose fra den immobiliserte Coupled Hel-celle biokatalysator som en funksjon av (A) natriumalginat (% w / v) 2 (M) konsentrasjon (B) CaCl. Flatene er vist representerer gjennomsnittet og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.mager "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Vurdering av biokatalysator Reusability. Utbyttet av L-xylulose produksjon i 7 på hverandre følgende sykluser med gjenbruk av immobilisert og fri koplet hel-celle biokatalysator er vist i mørke og lys grå, respektivt. Plottet er vist representerer gjennomsnittet og standardavvik av tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nyere teknologiske fremskritt har aktivert en bølge i kommersialisering av rekombinante biotherapeutics, noe som resulterer i en gradvis økning i markedsverdi i bioteknologisk industri. En slik utvikling er det advent av metabolsk ingeniør i rekombinante mikroorganismer, som har vist et stort løfte i å etablere skalerbare industrielle systemer 38. Som med de fleste prosesser, er det en vellykket kommersialisering av rekombinante biomolekyler som er produsert av genetisk modifiserte mikroorganismer svært avhengig av produksjonsutbyttet av systemet 39. Dette har ført til den raske utviklingen av "brute force" genetikk 39, der rettet utviklingen av biokatalytiske enzymer har blitt iverksatt for å bedre biocatalyst aktivitet tre. Imidlertid, for visse metabolske baner, slik som redox-reaksjonsveier, er bare en biokatalysator forbedring ikke er tilstrekkelig til å påvirke økonomisering av produksjonen på grunn av den betydelige effekten av OTHere nødvendige reaksjons krav, slik som dyre kofaktorer. Oppskalering av et slikt system, selv med forbedrede biokatalysatorer, vil bare tjene til å øke produksjonskostnadene. Dermed er flere strategiske metoder som kreves for kommersialisering av bioreactions involverer støkiometriske forhold av kofaktorer. I tillegg resirkuleres en biokatalysator er også nødvendig for å forbedre den økonomiske gjennomførbarheten av en bioteknologi. For å overvinne den begrensende effekt av rask kofaktor forbruk og dårlig gjenbruk av hel-celle biocatalysts har vi tidligere utviklet en immobilisert, kombinert hel-celle biokatalytisk system for kofaktor regenerering og stabil gjenbruk 16. Beskrevet i denne studien er de eksperimentelle prosedyrer som kreves for å par og co-immobilisere to hel-celle biocatalysts for bedre biotransformasjon yield og gjenbruk, sammen med de representative resultater.

En kritisk faktor for å bli vurdert for kobling av hel-celle biocatalysts er opprettholdelse av en nøyaktig kontroll over de betingelser som er etablert for protein induksjon og biokatalytisk produktdannelse for å sikre reproduserbarhet av systemet. Variasjoner i parametre som induksjons OD 600, induksjon tid, og IPTG-konsentrasjonen bør unngås for å minimalisere batch-til-batch variasjon. I tillegg er re-evaluering av celle-til-celle-forhold som kreves for ulike biotransformasjoner. Legg merke til at E. coli HjLAD: E. coli SpNox forhold på 1: 1 rapportert i denne studien ble bestemt ved eksperimentelle optimalisering snarere enn den teoretiske støkiometriske forhold. For immobilisering av de rekombinante hel-celle biokatalysatorer i kalsiumalginat perler, er det flere viktige tiltak for å sikre ensartethet med hensyn til vulsten stivhet og fordeling av celler. For det første må alginatoppløsning fremstilles ved langsom tilsetning av natriumalginat i vann, og ikke vice versa for å forhindre klumpdannelse som could påvirke den lokale alginat konsentrasjonen og således graden av tverrbinding. For det andre bør forsiktig pipettering anvendes ved håndtering av celle-alginat suspensjonen for å unngå dannelse av luftbobler, noe som påfører skjærspenning på de innkapslede celler, hindre effektiv masseoverføring og kan til og med forårsake at perlene til å flyte. I tilfelle luftbobler innføres i suspensjonen, tillate celle-alginat suspensjonen stå i ro i 20 - 30 minutter for å la boblene unnslippe. For det tredje, når gjør kulene, den cellesuspensjon alginat må det tilsettes langsomt og forsiktig i en dråpevis måte til et tilstrekkelig volum av kalsiumklorid-løsning for ensartet størrelse og morfologi. Perler nedsenket i ufullstendig kalsiumklorid vil få en uregelmessig form og dårlig stivhet som kan bidra til celle lekkasje. Til slutt, for å unngå variasjon i reaksjonsvolumet fra restvaskebuffer, kan perlene i trinn 4.8 være lett strøket med filterpapir (ikke lufttørk).

E. coli SpNox og E. coli HjLAD cellekulturer, gir en bedre kontroll med å opprettholde et ønsket forhold mellom de to enzymer. I tillegg er celler som uttrykker enkle proteiner utsettes for mindre belastning enn de co-uttrykkende multiple proteiner, noe som kan føre til redusert protein misfolding og økt protein ekspresjon 40,41. Således presenterer direkte hel-celle kopling evnen til å mediere multi-enzym katalytiske prosesser uten i vesentlig grad går på bekostning av produktutbytte. Men etablerte strategier som nøye utvalg av bakterielle arrangører med varierende styrke 42,43 og forbedringer i ribosombindingsseter 44 kan være ansatt id å dempe begrenset kontroll over forholdet mellom målenzymer i ko-kultur eller ko-ekspresjonssystemer. Blant de mange immobilisering teknikker, presenterer innkapsling flere fordeler for immobilisering av hel-celle-biokatalysatorer fremfor alternative metoder så som tverrbinding og adsorpsjon, som er mer egnet for rensede enzymer. Innkapsling av celler kan også utføres i en rekke av biomaterialer som agar, chitosan, gummi, karragen, gelatin og alginat 45 for å forbedre gjenbruk av biokatalysatorer. Imidlertid har kalsium-alginat innkapsling vist seg å være den mest effektive måte med hensyn til immobilisering effektivitet og produksjon biomolekyl 46,47.

En stor begrensning for anvendelse av bakterie hel-celle biokatalysatorer er det minimal mulighet for post-translasjonell modifikasjon av heterologe proteiner i villtype E. coli 48. Dette begrenser den vellykkede bruk av eukaryote biokatalysatorer wTVen på dette systemet. Et alternativ for å overvinne denne begrensning kan være bruk av organismer som gjær som er bedre utstyrt med eukaryot posttranslasjonell maskineri. En annen begrensning ved det beskrevne system er relatert til bruken av immobilisering for forbedret gjenbruk. Immobilisering er en vanlig kostnadseffektiv strategi ansatt for å motvirke dårlig stabilitet av biocatalysts og forbedre sin omløpshastighet ved å forenkle bioteknologi 49-51. De viktigste parameterne som påvirker den katalytiske ytelsen av innkapslede hel-celle biokatalysatorer omfatter natriumalginat konsentrasjon, CaCl2-konsentrasjon, celle lasting og perlestørrelse. Det er viktig å erkjenne at disse parametre er ikke uavhengige av hverandre. Som sådan, en omfattende analyse av alle faktorer i et enkelt studie er meget tidkrevende, og dermed er det nødvendig å velge de mest avgjørende parametre for optimalisering. Evalueres og presenteres her er effekten avto parametre, natriumalginat og CaCl2-konsentrasjon. Selv om det ikke er nærmere omtalt her, har vi tidligere utførte optimalisering av cellen lasting, sammenligner avhengighet av utbyttet på vekten av cellene immobilisert 16. Rapporter i litteraturen antyder at variasjonen av perlestørrelse kan også modulere produksjonsutbyttet ved å øke enzym innkapsling, bedre aktivitet via økte overflatearealet til det immobiliserte system, eller ved å endre spredningen av substrater og produkter på grunn av endrede transportegenskaper. Avhengig av biokatalytiske reaksjoner under vurdering, kan valg av alternativ kritiske faktorer være nødvendig, noe som kan føre til dannelse av et annet sett med optimale forhold. En detaljert studie for opprettelse av optimale betingelser for flere parametere gir rom for ytterligere forbedring i ytelse av det koblede hel-cellesystem.

I sammendraget, rapporterer vi den eksperimentelle iverktering av en koplet hel-celle biokatalytisk system immobilisert på kalsium alginatkuler, som illustrerer den forbedrede produksjon av L-xylulose. Ved å uttrykke forskjellige rekombinante enzymer som letter andre kofaktor avhengig biokatalytiske veier, høye utbytter av mange biologisk relevante molekyler kan oppnås ved hjelp av protokollen beskrevet her. I tillegg kan systemet utvides til å romme mer enn to rekombinante biokatalysatorer for one-pot multi-enzym biosyntese av produktene 52 og andre enn biokatalytisk produksjon programmer, for eksempel mikrobielle biosensorer for biokjemisk oksygenforbruk 53. Å dra nytte av synergi funksjon i dette systemet, kan innkapsling av symbiotisk mikrobiell konsortier brukes for en myriade av applikasjoner som bioremediation 54-56, hel-celle bioprocessing for biodrivstoff 57, plantevekst promotering av jord bioaugmentation 58 og biomining for metallgjenvinning 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser. Papiret tar sikte på å rapportere detaljerte metoder for å generere et kombinert hel-celle biokatalytisk system immobilisert i alginatkuler. Vitenskapelige nyheter har blitt rapportert i en tidligere studie 16.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (NRF-2013R1A1A2012159 og NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University, og Institutt for kjemisk prosessteknologi og mCubed program ved University of Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27, (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110, (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54, (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76, (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92, (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32, (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15, (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72, (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5, (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14, (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20, (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106, (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45, (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89, (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39, (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72, (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62, (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90, (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72, (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49, (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72, (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40, (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74, (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36, (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67, (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271, (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34, (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76, (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41, (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37, (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11, (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14, (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33, (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22, (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103, (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9, (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30, (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15, (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50, (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163, (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40, (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100, (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30, (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100, (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7, (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012, (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3, (203), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics