Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

Chemistry

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Summary

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

Nós desenvolvemos recentemente um sistema de célula inteira biocatalítica simples, reutilizável e acoplado com a capacidade de regeneração do cofactor e imobilização biocatalisador para melhorar o rendimento de produção e a síntese sustentada. Aqui descrita é o procedimento experimental para o desenvolvimento de um tal sistema constituído por dois E. estirpes de E. coli que expressam enzimas funcionalmente complementares. Em conjunto, estas duas enzimas podem funcionar co-operacionalmente para mediar a regeneração de cofactores caros para melhorar o rendimento do produto do bio-reacção. Além disso, o método de síntese de uma forma imobilizada do sistema biocatalítica acoplado por encapsulação de células inteiras em esferas de alginato de cálcio é relatado. Como um exemplo, apresenta-se a melhoria da biossintese da L-xilulose a partir de L-arabinitol por acoplamento E. células de E. coli que expressam as enzimas desidrogenase L-arabinitol ou NADH oxidase. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de 150mM de L-arabinitol, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, o que é mais elevado do que os relatados na literatura. A forma imobilizada dos biocatalisadores de célula inteira acoplados demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento obtido no primeiro ciclo após 7 ciclos sucessivos de re-utilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a actividade catalítica. Portanto, os métodos descritos aqui fornece duas estratégias que podem ajudar a melhorar a produção industrial da L-xilulose, bem como outros compostos de valor acrescentado que requerem o uso de co-factores em geral.

Introduction

Biotransformação de célula inteira redutora usando microorganismos tornou-se um método generalizado para a síntese quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente e terapeuticamente importantes 1 - 3. Ele apresenta várias vantagens sobre a utilização de enzimas isoladas, particularmente, a eliminação dos processos de purificação a jusante custo intensivo e a demonstração de um tempo de vida prolongado 4-7. Para vias biocatalíticas onde são necessários co-factores para a formação do produto, os sistemas de célula inteira tem o potencial para proporcionar a regeneração in situ de cofactor através da adição de baixo custo dadores de electrões co-substratos 5,8,9. No entanto, esta capacidade é diminuída para reacções que requerem uma concentração estequiométrica de co-substratos raras ou caras 10 - 13. Juntamente com a pobre reutilização de células inteiras, o que impede o estabelecimento de um produ escalável e contínuasistema cção. são necessárias modificações estratégica dos sistemas de células completas para estas biotransformações dependente do cofactor para superar as limitações acima mencionadas. Especificamente, a combinação de biocatalisadores de célula inteira que trabalham cooperativamente foram mostrados para aumentar significativamente a produtividade e a estabilidade das enzimas abrigavam 14. Estes factores, que são frequentemente críticos para permitir a produção em grande escala de produtos comercialmente viáveis, ainda pode ser optimizada por micróbios biocatalíticas co-imobilização 15. Recentemente, desenvolvemos um sistema biocatalítico de células inteiras simples e reutilizável que permite tanto a regeneração cofator e imobilização biocatalisador para a produção de L-xilulose 16. Neste estudo, este sistema foi utilizado como um exemplo para ilustrar os procedimentos experimentais de aplicar estas duas estratégias para melhorar o rendimento da produção e a capacidade de reutilização biotransformação biocatalisador.

L-xilulose pertence a uma CLAss de moléculas biologicamente úteis chamado açúcares raros. Açúcares raros são monossacarídeos originais ou derivados de açúcar que ocorrem muito raramente na natureza, mas desempenham um papel crucial como elementos de reconhecimento em moléculas bioativas 17,18. Eles têm uma variedade de aplicações que vão desde adoçantes, alimentos funcionais para agentes terapêuticos potenciais 19. L-xilulose pode ser utilizado como um inibidor potencial de várias a-glucosidases, e pode também ser usado como um indicador de hepatite ou cirrose hepática 17,20. Conversão de alta eficiência de xilitol a L-xilulose em sistemas de célula completa tem sido relatado previamente em Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 e Escherichia coli 26. Em E. coli, no entanto, só foi conseguido utilizando (<67 mM) concentrações baixas de xilitol 26, devido a possíveis efeitos inibidores de uma concentração inicial xilitol superiores a 100 mM sobre a atividade xilitol-4-desidrogenase 21,26. O equilíbrio termodinâmico entre xilulose e xilitol tem sido demonstrado que favorecem fortemente a formação de xilitol 25,27. Além disso, o rendimento de xilulose é limitada pela quantidade de cofactores caros que têm de ser fornecidos, na ausência de um sistema de co-factor de regeneração in situ. Juntos, esses fatores limitam o potencial para a expansão em sistemas sustentáveis ​​para a biossíntese de L-xilulose.

Para superar essas limitações e melhorar o rendimento biotransformação L-xilulose, a estratégia de regeneração cofator foi empregado pela primeira vez através do estabelecimento de um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado. Especificamente, L-arabinitol 4-desidrogenase (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), uma enzima na via catabólica de L-arabinose de fungos, foi selecionado para catalisar a conversão de L-arabinitol em L-xilulose 28,29 . Como muitas enzimas biossintéticas, um dos principais limitatioN de HjLAD é que ele requer uma quantidade estequiométrica do caro nicotinamida adenina dinucleótido cofactor (NAD +, a forma oxidada de NADH) para efectuar esta conversão. NADH oxidase encontrado em Streptococcus pyogenes (SpNox) foi mostrado para exibir actividade de cofactor de alta-regeneração 30,31. Aproveitando este atributo de SpNox, E. células coli que expressam HjLAD para a produção de L-xilulose foram acoplados com E. células coli que expressam SpNox para a regeneração do NAD + para aumentar a produção de L-xilulose representado pela reacção acoplado mostrado na Figura 1A. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de mM de L-arabinitol 150, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, tornando este sistema muito mais eficiente do que os relatados na literatura.

A estratégia de imobilização de célula inteira foi utilizado ao lado de aumentar ainda mais a capacidade de reutilização do biocatalyt acopladosistema IC. Métodos comumente usados ​​para a imobilização de células inteiras incluem adsorção / o encadeamento covalente a matrizes sólidas, a reticulação / arrastamento e encapsulamento em redes poliméricas 32. Entre estas abordagens, o método mais adequado para a imobilização de células é encapsulamento em pérolas de alginato de cálcio. Suas propriedades de gelificação leves, matriz aquosa inerte e alta porosidade ajudar a preservar as propriedades fisiológicas e funcionalidade dos produtos biológicos encapsulados 33. Portanto, o sistema de biocatalisador acoplado contendo tanto E. células de E. coli que abrigam HjLAD ou SpNox foi imobilizado em pérolas de alginato de cálcio para permitir que vários ciclos de produção de L-xilulose (Figura 2) .O sistema de biocatalisador imobilizado demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento de conversão do primeiro ciclo após 7 ciclos de sucessiva reutilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a sua actividade catalítica.

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Protocol

1. Whole-cell Biocatalisadores Preparação

NOTA: O E. recombinante coli que abrigam pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 são doravante referida como E. coli e E. SpNox coli HjLAD, respectivamente.

  1. Inocular uma única colônia de E. coli HjLAD em 3 ml de meio suplementado com canamicina (50 ug / ml) de Luria-Bertani (LB) e incubar num incubador agitador de O / N a 37 ° C, 250 rpm.
  2. Dilui-se a cultura de 1: 100 em 200 mL de LB fresco contendo 50 ug / ml de canamicina e incubar a 37 ° C, 250 rpm até a DO600 atingir ~ 0,6.
  3. Induzir a expressão da proteína por adição de HjLAD 0,1 mM de isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) ao meio de cultura e incuba-se a 16 ° C, 180 rpm durante 16 horas.
    1. Como alternativa, executar a indução a 25 ° C, 200 rpm durante 6 horas, se a biossíntese de L-xilulose (Passo 2 abaixo) é realizada no mesmo dia.
  4. Colher o E. induzida coli HjLAD por centrifugação a 3200 xg durante 20 minutos a 4 o C. Descartar o sobrenadante e prossiga para a Etapa 2 para processar o pellet celular.
  5. Em paralelo, executar as etapas 1,1-1,4 por E. coli SpNox.

2. Biossíntese de L-xilulose por acoplamento E. coli e E. HjLAD coli SpNox para Cofator Regeneração

  1. Ressuspender as peletes de células de E. coli e E. HjLAD coli SpNox separadamente em tampão Tris 50 mM-HCl (pH 8,0) a uma densidade celular de 5,0 g de peso celular seco (gDCW) / L.
    Nota: A correlação entre gDCW e a densidade óptica medida a 600 nm (OD 600) pode ser criada para facilitar o experimento. A fórmula utilizada noeste protocolo é uma gDCW / L = 0,722 * OD 600-,0965, que pode variar entre os diferentes espectrômetros.
  2. Misturar 600 mL de 5,0 gDCW / G E. coli HjLAD, 600 ul de 5,0 gDCW / G E. coli SpNox, 100 ul de 20 mM de NAD +, e 150 ul de 2 M de L-arabinitol em uma 14 ml de tubos de fundo redondo, e perfazer um volume de reacção de 2 ml por adição de 550 ul de Tris-HCl 50 (pH 8,0) .
    Nota: O rácio da quantidade biocatalisadores de célula inteira dois podem ser optimizadas para melhorar a biossíntese do produto. Para o sistema descrito, uma proporção de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 verificou-se ser óptima para a L-xilulose biossíntese (Figura 1B).
  3. Incubar a mistura de reacção a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h.
  4. Recolhe-se o sobrenadante após centrifugação a 4 ° C, 3,200 xg durante 10 minutos, umaND prosseguir para quantificar a produção de L-xilulose, tal como descrito no Passo 3 abaixo.

3. Ensaio colorimétrico para a quantificação de L-xilulose

  1. Aspirar 100 ul do sobrenadante de reacção recolhidas a partir do passo 2.4 para um tubo de 1,5 ml.
  2. Adicionar 50 ul de 1,5% de cisteína, 900 uL de ácido sulfúrico a 70%, e 50 ul de 0,1% de carbazole dissolvido em etanol e misturar suavemente por inversão do tubo 3 vezes.
  3. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C, 200 rpm durante 20 min.
  4. Medir a absorvância óptica da mistura de reacção a 560 nm (A 560), utilizando um espectrofotómetro.
    1. Diluir a mistura de reacção se a leitura A 560 está acima de 1.

4. A imobilização de catalisadores de células inteiras recombinantes em esferas de alginato de cálcio

  1. Dissolve-se 4 g de alginato de sódio em 100 ml de água destilada. Preparar a solução de alginato adicionando soídio alginato de água para evitar a formação de grumos. Aquece-se a mistura, se necessário.
  2. Adicionar 600 uL de 5,0 gDCW / G E. coli HjLAD e 600 ul de 5,0 gDCW / G E. coli SpNox em 1,2 ml de 4% de alginato preparada no passo 4.1 e misturar as células e alginato por pipetagem suave, para evitar a formação de bolhas.
  3. Aspirar a suspensão de alginato / célula para uma seringa utilizando uma agulha e adicionar-se a mistura gota a gota em um cloreto de cálcio 0,3 M de solução (CaCl 2) numa proveta de 100 ml com agitação contínua.
    Nota: O volume de solução de CaCl2 utilizada para a formação de drageia de alginato deve ser suficiente para que as gotículas de alginato de ser completamente submerso. Além disso, a distância entre a agulha da seringa e a superfície da solução de cloreto de cálcio tem de ser mantido dentro de uma gama óptima para assegurar a formação de grânulos uniformemente esférica. A faixa ótima distância pode ser determinada experiênciaaliado e depende do diâmetro interior da agulha. Como estimativa, uma distância de ~ 15 ± 5 cm verificou-se ser óptima para uma agulha de seringa 0,6 cm (diâmetro interno).
  4. Deixar os grânulos na solução de CaCl2 para 2-3 horas à temperatura ambiente sem agitação para permitir a formação de reticulação de gel e grânulos.
  5. Decantar a solução de CaCl 2, sem perturbar as esferas vertendo cuidadosamente a solução de CaCl2 para um tubo cónico de 50 ml, e transferir os grânulos restantes em solução de CaCl2 para outro tubo de 50 ml.
  6. Lavam-se as esferas com 10 ml de Tris-HCl 50 (pH 8,0) três vezes para remover células excessivas CaCl2 e un-encapsulada.
    NOTA: Em um determinado passo, não centrifugar as contas como isso irá romper-los. Para separar os grânulos a partir da solução, para permitir que a suspensão em repouso durante 3-5 minutos. As contas vai assentar no fundo e o tampão de lavagem pode ser decantadoem um outro recipiente.
    1. Não descarte o tampão de lavagem usado. A piscina do buffer utilizado Tris-HCl de lavagem (30 ml) com a solução usada CaCl2 recolhidos a partir do passo 4.5.
  7. Agregar as E. imobilizada-un células de E. coli por centrifugação da solução de CaCl 2 e de Tris-HCl reunidas recolhidas a partir do passo 4.6 a 3.200 xg durante 20 min. Para determinar a eficiência de imobilização, calcular a densidade das células peletizadas un-encapsulado em gDCW / L, tal como descrito na etapa 2.1.
  8. Transferir as esferas lavadas a partir do passo 4.6 em um tubo. Siga passos 2.2 - 3.4 para avaliar a biossíntese de L-xilulose usando todas as esferas lavadas em lugar de sedimentos celulares.

5. Estabilidade Ensaio de Imobilizados Biocatalisadores para a Produção L-xilulose

  1. Recolher os grânulos do passo 4.8 e lavar duas vezes com 10 ml de Tris-HCl 50 (pH 8,0) tampão sem centrifugação (conforme descrito no Passo 4.6).
  2. use todadas pérolas lavadas para realizar a reacção tal como descrito nos passos 2.2 - 3.4.
  3. Repita os passos de 5,1-5,2 para o número desejado de ciclos de produção e medir a quantidade de L-xilulose produzida no sobrenadante da reacção em cada ciclo.

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Representative Results

Para permitir a co-factor de regeneração, a síntese de L-xilulose foi realizada num sistema de célula inteira biocatalítica acoplado contendo E. coli e E. HjLAD coli SpNox. Após a optimização de vários parâmetros, a capacidade de reutilização do sistema foi melhorada por meio da imobilização que em pérolas de alginato de cálcio (Figura 2).

Produção L-xilulose com Cofator Regeneração por acoplamento E. coli e E. HjLAD coli SpNox.
Para melhorar a bioconversão da L-arabinitol em L-xilulose, a E. coli e E. HjLAD coli SpNox foram acoplados para permitirregeneração de cofator. Para ter em conta as diferenças na expressão de proteínas e disponibilidade cofator em E. coli e E. SpNox coli HjLAD células, um estudo de comparação do rendimento de L-xilulose a várias E. coli SpNox Para- E. rácios HjLAD coli foi realizada. Como mostrado na Figura 1B, o rendimento aumentou à medida que a E. coli SpNox Para- E. coli HjLAD proporção aumentou de 0,13: 1 a 1: 1. Os rendimentos obtidos para razões de 1: 1 e 1,33: 1 e foram equivalentes máxima para este sistema acoplado. Todas as outras experiências foram realizadas com a E. coli SpNox Para- E. proporção coli HjLAD de 1: 1. Começando com uma concentração inicial de mM de L-arabinitol 150, a utilização de E. coli HjLAD biocatalisador sozinho produziu 118 mM L-xilulose após 8 horas (ponto de saturaçãopara a concentração de L-xilulose), representando um rendimento de 79% (Figura 1C). Em comparação, a utilização da E. coli e E. HjLAD coli SpNox em uma proporção de 1: 1 produziu 144 mM de L-xilulose, melhorando o rendimento para 96%.

Optimização da Imobilização Biocatalisador de célula inteira
Imobilização de biocatalisadores em pérolas de alginato de cálcio oferece muitas vantagens, tais como a melhoria da viabilidade, como um resultado do ambiente de gel suave que protege as células contra as tensões físicas num biorreactor. As propriedades destas pérolas de alginato é em grande parte determinada pelos parâmetros de formulação e processamento 34. Para optimizar o rendimento de produção de L-xilulose por uma forma imobilizada do biocatalisador da célula inteira acoplado acima descrito, dois parâmetros principais, nomeadamente a concentração de alginato de sódio e a concentração de CaCl 2, foram avaliados. Esses sãoos parâmetros principais que determinam a integridade e a rigidez das pérolas de alginato de cálcio, que por sua vez afectam a eficiência biocatalisador imobilização e de difusão molecular.

Como mostrado na Figura 3A, a eficiência biocatalisador imobilização demonstrou uma tendência crescente com o aumento da concentração de alginato de sódio na gama de 1 - 3% (w / v). Quando a concentração de alginato de sódio usado na matriz de imobilização foi de menos de 1%, os grânulos resultantes foram frágil e facilmente quebrada devido à baixa estabilidade mecânica, libertando a maioria das células na solução circundante de CaCl 2 (dados não mostrados). Mediante o aumento da concentração de alginato de sódio a 2% maior do que, os grânulos resultantes endurecido em excesso levando a problemas de difusão molecular 35 (Figura 4). Variando a concentração de CaCl 2 produziu uma tendência semelhante no immobilizat biocatalisadoreficiência de iões. Para uma concentração fixa de alginato de sódio (2% w / v) e no intervalo de 0,1-0,4 M de CaCl2, menores concentrações de CaCl 2 resultou numa diminuição da rigidez dos grânulos e aumento de vazamento de células para dentro da solução circundante. Isto é devido à limitada disponibilidade de iões Ca2 + para ligar de modo cruzado os blocos guluronato sobre as cadeias de polímeros de alginato de 36 (Figura 3B). No entanto, o aumento da concentração de CaCl 2 de 0,3 M a 0,4 M melhorou a eficiência biocatalisador imobilização apenas marginalmente. Devido à alta eficiência de imobilização (> 90%), CaCl 2 concentrações superiores a 0,4 M não foram avaliados. Quando foram utilizados CaCl2 concentrações de menos de 0,1 M, a gota de alginato de sódio que contém o biocatalisador se desfez na solução de CaCl2 e não há contas esféricas foram formados (dados não mostrados).

Para maximizar obiocatalisador eficiência imobilização sem significativamente abrandar a difusão molecular nas esferas de alginato de cálcio, o alginato de sódio e concentração de CaCl2 foram otimizados seguinte para a melhoria da produção L-xilulose. Usando o mesmo intervalo de concentração, tal como para a eficiência de imobilização (1-3% W / alginato de sódio v e 0,1-0,4 M de CaCl2), uma concentração de alginato de sódio óptima de 2% foi observado para alcançar o rendimento máximo de produção de L-xilulose (Figura 4A ). Para além desta concentração ideal, o rendimento mostrou uma tendência decrescente. Isto era esperado, devido aos problemas na difusão associados à excessiva rigidez das esferas de alginato de cálcio. Do mesmo modo, a concentração óptima de CaCl 2 verificou-se ser 0,3 M (Figura 4B). Combinado com os dados apresentados na Figura 3, a concentração óptima de alginato de sódio (2%) e a concentração de CaCl2 (0,3 M), que permitiu a formação de grânulos comrigidez e permeabilidade adequada foi estabelecido, permitindo o vazamento de células mínimo e rendimento de produção máxima L-xilulose.

Deve notar-se que, um outro factor que afecta a eficiência catalítica global do biocatalisador imobilizado é o peso da cultura de células encapsuladas. Os catalisadores eficiência aumenta com o aumento do inóculo de células até um peso inóculo ideal, para além do qual ele mostra uma tendência decrescente 37. Uma possível explicação para esta diminuição é superlotação celular, o que dificulta a difusão molecular através das pérolas de alginato de cálcio e diminui a eficiência catalítica do sistema. Usando a condição de imobilização optimizado acima, a maior produção de L-xilulose foi obtido com uma célula de carga de 3,75 (gDCW) / G 16 (dados não mostrados).

Reutilização dos Biocatalisadores-célula inteira livre e imobilizada paraL-xilulose Produção.
Usando a condição estabelecida optimizada de 1: 1 E. coli SpNox a E. proporção coli HjLAD, 2% (w / v) de alginato de sódio, e 0,3 M de CaCl2, a acoplado saída biocatalisador da célula inteira imobilizado um rendimento de L-xilulose máxima de 64%, em comparação com um rendimento muito mais elevado de 96% para a livre sistema de célula inteira acoplado (ciclo 1 da Figura 5). Note-se que o rendimento da E. imobilizada coli célula HjLAD sozinho foi apenas de 32,5% (dados não mostrados), menor que a do sistema acoplado imobilizada, bem como o sistema de biocatalisador único livre (79%, Figura 1C). Esta redução foi como esperado imobilização é conhecido por diminuir a actividade de biocatalisadores, possivelmente devido a limitações de difusão do substrato, mas foi compensada pela vantagem de melhorar a capacidade de reutilização de um biocatalisador sobre a imobilização. Este efeito sobre a estabilidade do biocatalisador édemonstrado pela tendência decrescente com um rendimento de L-xilulose observada em submeter os sistemas livres e imobilizadas repetidamente para um processo de reacção em lotes, mostrado na Figura 5. O rendimento para o sistema livre mostrou um declínio muito mais acentuado do que o do sistema imobilizado, indicando mais rápida perda de actividade enzimática no sistema livre. Como resultado, ambos os sistemas tinham um rendimento de L-xilulose comparável para o ciclo de produção 2. No final de 7 ciclos de sucessivos de re-utilização, os biocatalisadores encapsuladas mantiveram a sua estabilidade e manteve 65% do rendimento original, enquanto o conjunto de células livres sistema mantido a menos de 10% da sua capacidade de produzir L-xilulose. Isto demonstra que os biocatalisadores imobilizados pode ser reutilizado de forma eficaz para a produção de L-xilulose, e que o benefício da melhoria da capacidade de reutilização e estabilidade provocada por imobilização ultrapassa em muito a redução da actividade do biocatalisador, que confere uma vantagem significativa para o processo de produção atravésum sistema de célula inteira livre.

figura 1
Figura 1. Sistema de célula inteira Acoplado para a Produção Biocatalítica de L-xilulose. (A) Representação esquemática que ilustra a reacção de co-factor de regeneração que ocorre num sistema de célula completa compreendendo acoplado E. células de E. coli que abrigam HjLAD ou SpNox, respectivamente. (B) A variação no rendimento de L-xilulose com diferente E. coli SpNox a E. rácios coli HjLAD. (C) um rendimento de L-xilulose a partir de um biocatalisador de célula inteira composta de apenas E. coli HjLAD comparada com a de um sistema de célula inteira acoplado constituído por E. coli e E. HjLAD coli susceptíveis de regeneração SpNox cofactor. As parcelas apresentados representam média e stadesvio ndard de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A imobilização dos Biocatalisadores-célula inteira através de encapsulamento em alginato de grânulos. Esquemático, que representa a formação de tamanho uniforme de Ca2 + drageias de alginato por adição gota a gota da suspensão de células de alginato de sódio a uma solução de cloreto de cálcio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. parâmetros que influenciam a eficiência de Imobilização de o biocatalisador de célula inteira em alginato de grânulos. eficiência de imobilização como uma função de (A) de alginato de sódio (% w / v) duas concentração (M) (B) de CaCl. As parcelas apresentados representam a média e desvio padrão de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Avaliação do Rendimento da L-xilulose a partir do Biocatalisador de célula inteira Acoplado imobilizado como uma função de (A) de alginato de sódio (% w / v) duas concentração (B) de CaCl (M). As parcelas apresentados representam a média e desvio padrão de três experiências independentes.lank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Avaliação do biocatalisador Reutilização. O rendimento da produção de L-xilulose por 7 ciclos sucessivos de reutilização de biocatalisador de célula inteira acoplado livre e imobilizada é mostrado em cinza claro e escuro, respectivamente. A trama mostrada representa a média eo desvio padrão de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Recentes avanços tecnológicos têm permitido um aumento na comercialização de biotherapeutics recombinantes, resultando em um aumento gradual no seu valor de mercado na indústria de biotecnologia. Um tal avanço é o advento da engenharia metabólica em microorganismos recombinantes, que tem mostrado uma grande promessa no estabelecimento de sistemas industriais escaláveis ​​38. Tal como acontece com a maioria dos processos, o sucesso na comercialização de biomoléculas recombinantes produzidas por microorganismos geneticamente modificados é altamente dependente do rendimento de produção do sistema 39. Isto levou ao rápido desenvolvimento da genética "força bruta" 39, onde a evolução dirigida de enzimas biocatal�icas foi implementado a fim de melhorar a atividade catalisadora 3. No entanto, para certas vias metabólicas, tais como vias de redox, simples melhoria biocatalisador não é suficiente para influenciar economização de produção devido ao efeito significativo de OTHrequisitos de reacção essenciais de er, tais como cofactores caro. Scale-up de um tal sistema, mesmo com biocatalisadores melhoradas, servirá apenas para aumentar os custos de produção. Assim, os métodos estratégicos adicionais são necessários para a comercialização de bioreactions envolvendo razões estequiométricas de cofatores. Além disso, a reciclagem de um biocatalisador é também necessário para melhorar a viabilidade económica de um bioprocesso. Para superar o efeito de limitar o consumo de cofactor rápida e pobre capacidade de reutilização de biocatalisadores de célula inteira, temos desenvolvido anteriormente um sistema imobilizado, acoplado de célula inteira biocatalítica para a regeneração de cofactor e estável reutilização 16. Descrita no presente estudo são os procedimentos experimentais necessários para casal e co-imobilizar dois biocatalisadores de célula inteira para melhor rendimento biotransformação e reutilização, juntamente com os resultados representativos.

Um factor crítico para ser considerado para acoplar o BIOCAT de célula inteiraalysts é a manutenção de um controlo preciso sobre as condições estabelecidas para a indução de proteína e a formação do produto biocatalítica para assegurar a reprodutibilidade do sistema. Variações nos parâmetros como OD 600 de indução, o tempo de indução, e a concentração de IPTG deve ser evitada para minimizar a variação de lote para lote. Além disso, é necessário re-avaliação da relação de célula-a-célula para as biotransformações diferentes. Note-se que a E. coli HjLAD: E. coli SpNox proporção de 1: 1 relatados neste estudo foi determinada por optimização experimental, em vez do que a relação estequiométrica teórica. Para imobilização dos biocatalisadores de célula inteira recombinantes em pérolas de alginato de cálcio, existem várias etapas críticas para assegurar a uniformidade no que se refere à rigidez e distribuição das células do grânulo. Em primeiro lugar, a solução de alginato deve ser preparado por adição lenta de alginato de sódio em água, e não vice-versa, para evitar aglomeração que could afectar a concentração de alginato local e, assim, a extensão da reticulação. Em segundo lugar, a pipetagem suave deve ser empregues no manuseamento da suspensão de células-alginato para evitar a formação de bolhas de ar, que causam tensão de corte sobre as células encapsuladas, impedir a transferência de massa eficiente e pode mesmo causar os grânulos para flutuar. No caso de as bolhas de ar são introduzidas no seio da suspensão, permitir que a suspensão de células-alginato para ficar em repouso durante 20 - 30 minutos para permitir que as bolhas de escapar. Em terceiro lugar, ao fazer os grânulos, a suspensão de células-alginato deve ser adicionado lentamente e cuidadosamente, de forma gota a gota em um volume suficiente de solução de cloreto de cálcio para um tamanho uniforme e morfologia. Beads submersas incompletamente em cloreto de cálcio vai ter uma forma irregular e má rigidez que pode contribuir para a fuga de celular. Por fim, para evitar a variabilidade no volume de reacção de tampão de lavagem residual, os grânulos do Passo 4.8 pode ser ligeiramente riscados com papel de filtro (não ar seco).

E. coli e E. SpNox culturas de células coli HjLAD, oferecendo um melhor controle na manutenção de uma proporção desejada entre as duas enzimas. Além disso, as células que expressam as proteínas individuais são sujeitos a menos stress do que as múltiplas proteínas que co-expressam, o que poderia levar ao enrolamento incorrecto da proteína reduzida e aumento da expressão de proteínas 40,41. Assim, o acoplamento de células inteiras directo apresenta a capacidade de mediar os processos catalíticos multi-enzima, sem comprometer de forma significativa o rendimento do produto. Estratégias no entanto, já estabelecidos, como cuidadosa seleção de promotores bacterianos com intensidade variável 42,43 e melhorias nos locais de ligação ao ribossoma 44 pode ser employed para mitigar o controlo limitado sobre a proporção de enzimas-alvo em sistemas de co-cultura ou de co-expressão. Entre as numerosas técnicas de imobilização, encapsulação apresenta múltiplas vantagens para imobilizar biocatalisadores de célula inteira em relação aos métodos alternativos, tais como a ligação cruzada e a adsorção, que são mais apropriadas para as enzimas purificadas. A encapsulação de células também pode ser realizada numa variedade de biomateriais tais como agar, quitosano, gomas, carragenano, gelatina e alginato de 45 para melhorar a capacidade de reutilização dos biocatalisadores. No entanto, o alginato de cálcio encapsulação foi mostrado ser a abordagem mais eficaz no que diz respeito à eficiência e imobilização de biomoléculas produção 46,47.

Uma limitação importante da utilização de biocatalisadores de célula inteira bacterianas é a capacidade mínima para modificação pós-tradução de proteínas heterólogas em E. tipo selvagem coli 48. Isso restringe o uso bem sucedido de biocatalisadores eucarióticas within este sistema. Uma alternativa para superar essa limitação poderia ser o uso de organismos como leveduras que estão melhor equipados com eucariótica máquinas pós translacional. Uma outra limitação do sistema descrito está relacionada com a utilização de imobilização para melhorar a capacidade de reutilização. A imobilização é uma estratégia rentável comum empregada para neutralizar a fraca estabilidade de biocatalisadores e melhorar a sua taxa de rotatividade, simplificando o bioprocessos 49-51. Os principais parâmetros que afectam o desempenho catalítico de biocatalisadores de célula inteira encapsulados incluem a concentração de alginato de sódio, concentração de CaCl2, carga e tamanho do grânulo de célula. É importante reconhecer que estes parâmetros não são independentes um do outro. Como tal, uma análise exaustiva de todos os fatores dentro de um único estudo é muito demorado-, portanto, é necessário seleccionar os parâmetros mais importantes para otimização. Avaliadas e apresentadas aqui são os efeitos dadois parâmetros, alginato de sódio e a concentração de CaCl 2. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, já anteriormente realizado a optimização de carga de células, comparando a dependência do rendimento em peso de 16 células imobilizadas. Relatos na literatura indicam que a variação de tamanho das partículas, também pode modular o rendimento de produção, aumentando a encapsulação da enzima, a melhoria de actividade para o aumento da área de superfície do sistema imobilizado ou alterando a difusão de substratos e produtos, devido a propriedades de transporte alteradas. Dependendo das reacções biocatalíticas sob consideração, selecção de alternativas factores críticos podem ser necessários, o que poderia levar à geração de um conjunto diferente de condições óptimas. Um estudo detalhado para a criação de condições óptimas para os parâmetros adicionais prevê a possibilidade de melhorar ainda mais o desempenho do sistema de célula inteira acoplado.

Em resumo, nós relatamos a implemen experimentalção de um sistema de célula inteira biocatalítica acoplado imobilizada em esferas de alginato de cálcio, que ilustra a melhoria da produção de L-xilulose. Ao expressar diferentes enzimas recombinantes que facilitam outras vias dependentes cofactor biocatalíticas, elevados rendimentos de muitas moléculas biologicamente relevantes podem ser obtidas utilizando o protocolo aqui descrito. Além disso, este sistema pode ser expandida para acomodar mais do que dois biocatalisadores recombinantes para um pote de multi-enzima biossíntese de produtos 52 e outros do que a produção biocatalítica aplicações, tais como biossensores para microbianas carência bioquímica de oxigénio 53. Aproveitando o recurso sinérgica deste sistema, o encapsulamento de consórcios microbiana simbiótica pode ser usado para uma infinidade de aplicações, tais como biorremediação 54-56, bioprocessamento de célula inteira para os biocombustíveis 57, promoção de crescimento pelo solo bioaumentação 58 e biomineração para a recuperação de metais 59

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes. O documento tem como objetivo relatar metodologia detalhada para gerar um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado imobilizada em esferas de alginato. Novidades científicas têm sido relatados em um estudo anterior 16.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (NRF-2013R1A1A2012159 e NRF-2013R1A1A2007561), Universidade Konkuk, e do Departamento de Engenharia Química e MCubed programa da Universidade de Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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