Прогнозирование и проверка элементов гена регуляторной Активированный Во время ретиноевой кислоты индуцированных эмбриональных стволовых дифференцировка клеток

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эмбриональное развитие представляет собой многоступенчатый процесс, включающий активацию и подавление многих генов. Enhancer элементов в геноме, как известно, способствуют ткани и клеточного типа специфической регуляции экспрессии генов во время дифференцировки клеток. Таким образом, их идентификация и дальнейшее исследование имеет важное значение для того, чтобы понять, как определяется судьба клеток. Интеграция данных экспрессии генов (например, микрочипов или РНК-Seq) и результаты иммунопреципитации хроматина (CHIP) основанное геномные исследования (ЧИП-сл) позволяет крупномасштабную идентификацию этих регуляторных областей. Тем не менее, функциональная проверка конкретных усилителей камерного типа требует дальнейшего в пробирке и в естественных условиях экспериментальных процедур. Здесь мы опишем, как активные усилители могут быть идентифицированы и экспериментально подтверждено. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс шаг за шагом, который включает в себя: 1) идентификация регуляторных областей путем анализа, 2) Клонирование и EXPER Обломок-сл данныхментальные проверка предполагаемого регуляторного потенциала выявленных геномных последовательностей в анализе репортерного, и 3) определение активности энхансера в естественных условиях путем измерения уровня транскриптов РНК энхансер. Представленный протокол достаточно подробным, чтобы помочь любому, чтобы настроить этот рабочий процесс в лаборатории. Важно отметить, что протокол может быть легко адаптирован к и в любой системе клеточной модели.

Protocol

1. Enhancer Отбор на основе чип-анализа сл

  1. Скачать RXR ЧИП-Seq сырые fastq данные файла (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) от http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Загрузка и извлечение требуемого файла индекса BWA для выравнивания (в нашем случае: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    ПРИМЕЧАНИЕ: Посещение https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts для получения дополнительной информации относительно этапы анализа биоинформатики и загружать скрипты, используемые ниже.
  3. Совместите файл примера fastq к MM10 генома (использовать сценарий: perform_alignment.sh). Это позволит создать папку с файлом .bam и статистики выравнивания. Унифицированные RXR Обломок-сл данных (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), а соответствующий индекс файла (.bai) доступны здесь:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    Примечание: BWA представляет собой программный пакет, который выравнивает Релательно короткие последовательности (например, чиповых-сл результаты) в базе данных последовательностей, таких как опорной мыши генома (например, MM10) 13.
  4. Запустить скрипт (callpeaks.sh) для пика вызова и де Novo анализа мотива. Используйте файл .bam в качестве входных данных. Сценарий основан на Homer findPeaks 14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные файлы дают нам информацию об общем количестве пиков, обогащение мотивов, процент фона и целевых последовательностей с мотивами, и т.д.. (Рисунок 1). Как правило, несколько мотивов перечислены в порядке их значимости.
  5. Переназначение # 1 место мотив (NR половина `AGGTCA`) (используйте скрипт: remap_motif.sh)
    Примечание: В результате, скрипт генерирует .bed файл, который показывает, какие Обломок-пики охватывают геномные области, которые содержат канонический участок связывания фактора транскрипции, представляющего интерес.
  6. Скачать и визуализировать результаты выровненной RXR Обломок-SEQ читает (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (также скачать .bai)) и AGGTCA мотив вхождения (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) по интегративной геномики Viewer (ВНА) 15 , чтобы определить предполагаемую RAR / RXR сайты связывания (Рисунок 2 и Рисунок 3).
    Примечание: Интеграция различных Обломок-сл данных позволит более точно прогнозировать хорошие усиливающие 16,17 кандидата. Недавние исследования показали , что активные усиливающие , как правило , обогащены P300 и коррелируют с H3K4me1 и H3K27ac, и расположены в открытых хроматина регионах, тем самым показывая гиперчувствительность ДНКазы I также рекомендуется 18-21.
  7. Используйте "Определить интересующую область" в ВНА 15 , чтобы получить 200 - 400 последовательности пар оснований выбранной области генома и использовать эти последовательности для последующих конструкций праймеров.

2. Анализ Репортер

Примечание: Система люциферин / люциферазы используетсякак очень чувствительного анализа репортера для регуляции транскрипции. В зависимости от активности люциферазы энхансер фермент, который катализирует окисление люциферин до оксилюциферин что приводит к bioluminescense, который может быть обнаружен. В качестве первого шага, идентифицированы предполагаемые последовательности энхансеров должны быть субклонируют в вектор - репортера (например, ТК-люциферазы 22, pGL3 или NanoLuc).

  1. Праймер Дизайн
    1. Дизайн ПЦР - праймеров для амплификации 200 - 400 пар оснований предполагаемых областей усиливающих по Primer3 (доступны здесь: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. Скопируйте и вставьте геномную последовательность из ВНА, которая включает предполагаемую сайт связывания в Primer3 (см шаг 1.7). Установить диапазон размеров продукта до 250 - 300 пар оснований в Primer3.
    3. Сверяет ПЦР - праймеров с помощью браузера УСК генома Виртуальная ПЦР инструмент (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      Примечание: Этот протокол на более позднем этапе использует HindIIЯ и BamHI ферменты рестрикции для клонирования. Проверьте , правильно ли ПЦР - амплификации последовательности , как предсказывается УСК In-силикомарганца ПЦР инструмент будет содержать сайты рестрикции AAGCTT или GGATCC (например, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Получение необходимых праймеров от коммерческого поставщика.
  2. ПЦР - амплификации Enhancer последовательности из геномной ДНК
    1. Очищают шаблон геномной ДНК из первичных клеток (например, первичные эмбриональные фибробласты). Использование коммерческого набора для GDNA изоляции и следовать инструкциям производителя.
      Примечание: Высокое качество гДНК имеет важное значение для успешной ПЦР-амплификации. Соответствующие ВАС-клонов могут быть использованы, если ПЦР не легко из гДНК.
    2. Готовят 50 мкл ПЦР - реакционной смеси , содержащей 100 нг гДНК, 5 мкл 10х буфера, 3 мкл MgSO 4 (25 мМ), 5 мкл дНТФ (2 мМ каждого), 1,5 мкл Fwd праймера (10 мкМ), 1,5 мкл Rev праймера (10 мкМ) , 1 мкл ДНК-полимеразы
    3. Установите цикл ПЦР (2 мин 95 ° C, (20 сек 95 ° С, 10 сек 58 - 65 ° С, 18 сек 70 ° С) X25 повтор, 2 мин 70 ° С, навсегда 4 ° С). Установка температуры отжига с учетом грунтовку предсказал значения Tm.
    4. Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки коммерческой ПЦР и следовать инструкциям производителя.
    5. Введем сайты рестрикции для клонирования путем повторения ПЦР с праймерами , как он использован выше, но с добавлением свесов на их 5' - концах (например, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 '(HindIII), Rev: 5'-ТАТА GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
    6. Выполните 5 мкл продукта ПЦР на агарозном геле, чтобы проверить наличие неспецифических продуктов ПЦР.
      Примечание: Если больше групп обнаружены, запустить весь ПЦР-продукт и очищают соответствующую группу с помощью набора для экстракции геля коммерческого.
    7. ограничение
      Примечание: Для клонирования вставки перед ТК промотора 22 очищенного продукта ПЦР и вектор (например, TK-Luc) должны быть расщепляли HindIII и BamHI.
      1. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг очищенного продукта ПЦР, 1 мкл HindIII (20 ед / мкл) 1 мкл BamHI (20 ед / мкл) и 5 ​​мкл 10х буфера.
      2. Подготовить 250 мкл реакционной смеси, содержащей вектор 5 мкг (TK Luc, или альтернативный вектор-репортер), 5 мкл HindIII (20 ед / мкл), 5 мкл BamHI (20 ед / мкл), 5 мкл термочувствительный щелочной фосфатазы (1 ед / мкл) и 25 мкл 10х буфера.
        Примечание: AP обработка вектора значительно уменьшает самолигирование одностенных расщепленного вектора и, таким образом фон.
      3. Выдержите реакционных смесей в течение 4 ч при температуре 37 ° С, а затем очищают переваренных продуктов ПЦР и вектор с использованием набора для очистки ПЦР-коммерческой.
    8. LigatioN
      1. Настройка реакции на перевязки в ПЦР-пробирки, включая 2 мкл 10х Т4 ДНК-лигазы буфера, 10 нг TK-Luc вектор, 50 нг вставки (переваривается продукт ПЦР), 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (400 ед / мкл) и нуклеазы без воды до 20 мкл.
        Примечание: Приготовьте отрицательный контроль, когда реакция не содержит вставку.
      2. Аккуратно перемешайте реакцию с помощью пипетки вверх и вниз, спином вниз кратко пробирки для ПЦР с использованием мини-центрифугу, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
      3. Тепло инактивируют при 65 ° С в течение 10 мин , затем охладить на льду и использовать 5 мкл продукта для превращения в 50 мкл компетентных клеток (например, DH5 & alpha).
      4. Используйте стандартную процедуру теплового шока для трансформации бактерий, подобрать колоний и выделения плазмидной ДНК с коммерческим набором. Проверка все конструкции путем секвенирования до следующих шагов.
    9. Трансфекция клеток ES
      1. С помощью 48-луночных планшетах. Добавить 200 мкл 0,1% желатина Solutион / лунку за 30 мин до клеточной обшивки.
      2. Пластинчатые эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в день до трансфекции. Используйте фидерных свободных ES клеток и планшет при плотности 3 × 10 4 клеток на лунку в 250 мкл ES СМИ / лунку.
      3. Подготовьте плазмиды смеси (каждая смесь рассчитана на 8 лунок, 4 необработанной и 4 - ретиноевой кислоты лечение) Смешайте 1:. 1 250 нг TK-Luc Пустой (отрицательный контроль), 950 нг кодирования вектор β-галактозидазы (βGal), Mix 2 : 1250 нг TK-Luc Hoxa1 энхансер (положительный контроль), 950 нг βGal, Микс 3: 1,250 нг TK-Luc PRMT8 энхансер (область интереса), 950 нг βGal.
        Примечание: ES-клетки экспрессируют желательные факторы транскрипции (RAR / RXR). Оставьте скважины нетрансфецированные для определения значений базовых позже во время измерений люциферазы и β-галактозидазы.
      4. Добавить качество трансфекция уменьшенные сыворотки средства массовой информации для каждой плазмиды смешивают до 106 мкл общего объема (достаточно для 8 лунок).
      5. Добавить 4,5 мкл качества ES трансфекциюионный реагент затем тщательно перемешать с помощью пипетки 15 раз вверх и вниз. Выдержите трансфекции смесь в течение 10 мин при комнатной температуре.
      6. Добавьте 13 мкл трансфекции смеси к клеткам на лунку, тщательно перемешать с помощью пипетки. Поместите клетки обратно в инкубатор (37 ° C) O / N до лечения лигандом.
      7. Осторожно удалите носитель путем аспирации из клеток и добавить 250 мкл свежей информации / лунку, содержащую 0,01 - 1 мкМ все-транс-ретиноевой кислоты (RA) в качестве конечной концентрации или ДМСО в качестве транспортного средства. Инкубируйте клетки в течение 24 - 48 часов.
        Примечание: ретиноевой кислоты чувствителен к свету.
    10. Получение клеточных лизатов
      1. Развести 5x буфера для лизиса (1,25 мл 0,5 М Трис , рН = 7,8, 1 мл 1 М дитиотреитола (ДТТ) (в H 2 O), 10 мл 0,1 М ЭДТА , рН = 8,0, 50 мл глицерина, 5 мл Тритона Х-100, стерильные вода до 100 мл) до 1 раза с использованием стерильной воды, добавить 20 мкл 1М DTT / 10 мл и уравновешиваться до комнатной температуры перед использованием. Приготовьте 10 мл в течение 48-луночного планшета на день анализа. Удалить СМИ тщательно аспирации из клеток. Промойте клетки один раз с 1x PBS. Добавить 200 мкл 1х буфера для лизиса / лунку непосредственно к клеткам.
      2. Встряхивают в течение 2 ч при комнатной температуре (химический лизиса). Замораживание клеточных лизатов на пластине при температуре -80 ° C (механический лизис). Лизаты можно хранить при температуре -80 ° С в течение нескольких дней.
      3. Оттепель лизатов. После полного оттаивания, передача лизаты клеток на 96-луночный планшет с использованием электронного многоканальную пипетку. Передача 80 мкл лизата клеток в 96-луночного четкой пластины для β-галактозидазы анализа и 40 мкл лизата клеток в белой тарелке для измерения люциферазы. Избегайте образования пузырьков.
    11. β-галактозидазы пробирного
      Примечание: Бета-галактозидазы или альтернативные вторые репортеры должны быть использованы в качестве внутреннего контроля для учета неспецифических экспериментальных вариаций.
      1. Готовят буфер субстрата β-галактозидазы: 80,0 г Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 г NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 г KCl, 1,0 г MgSO 4 • 7H 2 O, составляют до 1000 мл стерильной водой. Регулировка рН до 7,4. Фильтр стерилизовать (0,2 мкм) и хранят при температуре 4 ° С
      2. Смешайте субстратный буфер 1 мл β-галактозидазы с 4 мг ONPG (о-нитрофенил-бета-D-галактозидазы). Добавить 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (βME) на 1 мл буфера непосредственно перед использованием. Добавьте 100 мкл буфера для субстрата β-галактозидазы до 80 мкл лизата клеток.
      3. Инкубируйте реакции при 37 ° С до тех пор, слабый желтый цвет не будет разработан. Измерить оптическую плотность при OD 420 нм на планшет-ридер и экспорт данных.
        Примечание: Время изменяется в зависимости от эффективности трансфекции, как правило, не дольше, чем 30 мин.
    12. анализа люциферазы
      1. Приготовьте 50 мл люциферин субстрат реагента: 15,1 мг D-люциферин соли, 82,7 мг АТФ соль, 185 мг MgSO 4 • 7H 2 O, добавляют 50 мл полипропиленовую трубку,затем добавляют 1,5 мл 1 М HEPES буфера, 48,5 мл АТФ свободной воды, вихрь, убедитесь, что все соединения полностью растворяются. Хранить 5 - 10 мл аликвоты при -80 ° С.
      2. Теплый 5 мл люциферин субстрат реагента до комнатной температуры перед началом работы. Пипетка 100 мкл субстрата реагента в каждую лунку белой пластины, содержащей 40 мкл лизата клеток и измерять сигнал сразу с помощью люминесцентного счетчика машины.
      3. Получите деятельность, по крайней мере, трех независимых экспериментов в трех экземплярах трансфекциях.
      4. Вычислить первую базовую нормализованное активность люциферазы и базовые нормированные значения β-галактозидазы для каждой скважины путем вычитания средних значений, измеренных для не трансфицированных клеток из каждого измеренного значения. Затем вычислить отношение люциферазы / бета-галактозидазы.

    3. Характеристика РНК Enhancer

    Примечание: Более прямой индикатор активности энхансера возникла из недавнего генома-Wисследования язь, определившие много коротких некодирующих РНК, размером от 50 до 2000 нт, которые были расшифрованы с усилителями, и называются усиливающие РНК (eRNAs) 16,25,26 (рисунок 4). Эрна индукция сильно коррелирует с индукцией соседних экзонов-кодирующих генов. Таким образом, энхансер активность сигнал-зависимого может быть определена количественно в естественных условиях путем сравнения производства Эрна между различными условиями РТ-КПЦР.

    1. Рекомендации по Primer дизайн для обнаружения Эрна по RT-КПЦР
      1. Выберите геномные области для измерений Эрна, что по крайней мере 1,5 - 2 кб от аннотированных стартовых сайтов транскрипции.
        Примечание: Важно отметить, что высокие уровни транскрипции мРНК через внутригенных усилителями предотвратить точное определение количества Эрной в смысловой ориентации, антисмысловые eRNAs на внутригенных усилителями могут быть обнаружены и похожи на уровне до eRNAs на extragenic усилителями.
      2. Как правило, используют регионы 200 - 1000 пар оснований сюдам от центра фактора транскрипции сайта связывания интерес для разработки праймера либо на смысловой или анти-смысловой цепи (рисунок 4 и рисунок 6).
        Примечание: Если GRO-сл, ДНКазы-сл, H3K4me1, H3K4me3 или H3K27ac ЧИП-SEQ данные доступны от желаемых типов клеток и условий, он может быть использован для более точного дизайна грунтовки. eRNAs транскрибируются с предполагаемыми областей усиливающих, характеризующихся высокими уровнями H3K4me1 и ME3. Выражение eRNAs положительно коррелирует с обогащением активированного энхансер гистонов марки H3K27ac.
      3. Дизайн ПЦР - праймеры для флуоресцентного красителя на основе измерения RT-КПЦР из eRNAs по Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Сформировать последовательность антисмысловой (обратный комплемент смысловой цепи) для дизайна грунтовки в соответствии с : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Вставка 200 - 300 п.н. смысловой или антисмысловой последовательности для дизайна праймеров.
    2. Измерение Эрна Транскрипция
    3. Изолировать тотальной РНК из обработанных клеток с коммерческими кислой фенольной реагентом экстракции / хлороформ основе в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
    4. Используйте DNAseI для лечения изолированной РНК перед использованием их в реакции обратной транскрипции. Деактивированы ДНКазы в соответствии с рекомендациями изготовителя перед обратной транскрипции.
    5. Измерение концентрации РНК после лечения ДНКазы I и использовать 1000 нг на реакцию RT. Использование высокого качества обратной транскриптазы.
      Примечание: В большое количество eRNAs не может быть Полиаденилированная, обратной транскрипции требует использования случайных праймеров.
    6. Обнаружение обратной транскрипции Эрна с помощью RT-КПЦР с использованием стандартной процедуры. Мера , не зависящих от лечения мРНК для нормализации (например, 36B4, Ppia, GAPDH, Actb).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали пан-специфическое антитело RXR с целью выявления генома, какие гены RA-регулируемых имеют обогащение рецепторов в их непосредственной близости. Анализ биоинформатики RXR Обломок-сл данных , полученных из клеток ES , обработанных ретиноевой кислотой выявлено обогащение половины участка ядерных рецепторов (AGGTCA) под RXR занятых узлов (рисунок 1). Используя алгоритм биоинформатики мы нанесем назад результат поиска мотив для половины участка к RXR ЧИП-Seq данных (Рисунок 2). Этот анализ помог нам точно определить те пики, которые были ChIP перекрывающихся с каноническими сайтами связывания ядерных рецепторов. Визуализация этих сайтов в ВНА показали обогащение этих факторов транскрипции в непосредственной близости от Hoxa1, ранее характеризующейся цели RAR / RXR (рисунок 2 и рисунок 3). Мы также идентифицировали ген - мишень новым RA, а именно PRMT8 27. Это лаолучатель область содержит прямой повтор без каких - либо распорных нуклеотидов между двух половин сайтов (AGGTCAAGGTCA) (рисунок 3). Для того, чтобы функционально проверить, что элемент идентифицирован для Hoxa1 действительно может связать RAR / RXR и регламентированы РА мы построили ТК-люциферазы векторов репортер, которые содержали ~ 300bp геномную область, в том числе выявленных элементов. Мы также построены векторы без элемента ответа (рисунок 5). ЭС клетки были трансфицированы и активность люциферазы измеряли в отсутствие и в присутствии ретиноевой кислоты (рис 5). Конструкты, содержащие элемент ретиноевой кислоты ответ (редком) сделал показать интенсивность сигнала увеличилась люциферазы при обработке РА, в то время как конструкция без RARE не индуцируемым.

Мы также изучали кислотно-зависимой активности ретиноевой Hoxa1 энхансер. Для того, чтобы установить, является ли Эрна выражение чувства и анти-смысл Hoxa1 RAR / RXR-связанного энхансер Correlate с экспрессии мРНК гена, мы также измеряли уровень мРНК Hoxa1 (рисунок 6). Эти результаты подтвердили, что усиливающий активность индуцируется кратковременного лечения РА (3 ч), тем самым подтверждая, что энхансер, вероятно, участвует в регуляции энхансера RA-зависимой.

Рисунок 1
Рисунок 1. Гомер Д Е Novo Motif Результаты. Выходной HTML (homerResults.html) , порожденную Гомера на примере RXR ЧИП-сл показан. Последовательность логотипы , соответствующие началу обогащенные фактор транскрипции мотивы , идентифицированные де Novo открытия мотив в RXR-связанного локусов. 7463 RXR заняты геномные области были использованы для поиска мотива. 77,66% из этих областей содержит AGGTCA-подобный мотив (причислены # 1). Для более подробного описания визита: (http://homer.salk.edu/ho Мер / мотив /) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Нахождение геномные области , содержащие мотив интереса. Визуализация выровненной RXR Обломок-SEQ чтений (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam и AGGTCA мотив вхождения (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) по интегративной геномики Viewer (IGV). Ряды окрашено чтения нити (чтений на + цепи: красный, - прядей:. синий) Геном используется для выравнивания: MM10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

JPG "/>
Рисунок 3. Геномные локусы Hoxa1 и PRMT8 энхансеры. ВНА снимок RXR ЧИП-Seq сигналов , полученных из необработанных и обработанных RA (24 часа в сутки, 1 мкМ) эмбриональных стволовых клеток 27 показаны. Выявленные последовательности связывания окрашены в красный цвет. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
. Рисунок 4. Экспериментальный дизайн для тестирования Эрна кодирующих последовательностей Расширители , выбранные для энхансер РНК (Erna) измерения должны быть расположены не менее 1,5 - 2 килобайта расстояние относительно сайта инициации транскрипции (TSS) от ближайшего гена. Обломок-ПОСЛ данные фактора транскрипции (TF), представляющие интерес и анализа мотив может быть использован для идентификации прямого связывания участков генома. Как связывание transcripных коактиватор (например, P300) часто отмечает дистальные энхансеры, области , обогащенные и для TF и P300 являются хорошими кандидатами Enhancer. Выражение eRNAs положительно коррелирует с обогащением активированного энхансер гистонов марки H3K27ac. Регионы 200 -. 1000 п.н. прочь в смысле или направлении антисмысловой от центра фактора транскрипции связывания рекомендуется для дизайна Эрна грунтовки Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. активность люциферазы Показанное Reporter Создаёт в ES клетках. Выявленные геномные области энхансера Hoxa1 были клонированы в ТК-Luc вектора и трансфицировали в эмбриональные стволовые клетки. Построить 1 и 2 содержали элемент ответа кислоты ретиноевой (RARE, ипподчеркнутая последовательность). Клетки обрабатывали RA (24 ч, 1 мкМ). βGal был использован в качестве внутреннего контроля для нормализации. Полосы представляют средние нормированные значения из четырех биологических повторностях. ± с.о. *** P <0,005 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Уровни ретиноевой кислоты Индуцированные Enhancer РНК Транскрипция. Hoxa1 мРНК и Эрна как измерено с помощью RT-КПЦР. Общую РНК выделяли из ЭС клеток, обработанных в течение 3 ч с ретиноевой кислотой (RA) или ДМСО в качестве носителя (VEH). Праймеры для смысловой и антисмысловой обнаружения Эрна и ампликонов PCR показаны. Расстояние областей, обнаруженных Эрна RT-КПЦР от центра участка связывания RXR указывается. Значения были нормализованы к среднему значению 36B4 мРNA. Данные представляют среднее ± стандартная ошибка *** Р <0,005 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12, (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics