Multicolor Fluorescens Detection for Droplet Microfluidics Brug af optiske fibre

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dråbe mikrofluidik en platform for high throughput biologi ved afskaerme eksperimenter i en lang række af vandige dråber suspenderet i et luftfartsselskab olie 1. Dråber er blevet anvendt til applikationer så forskellige som enkelt celleanalyse 2, digital polymerasekædereaktion (PCR) 3, og enzym evolution 4. Fluorescerende assays er standard form for registrering af dråbe mikrofluidik, da deres lyse signaler og hurtig tid respons er kompatible med påvisning af sub-nanoliter dråbe mængder ved kilohertz satser. Mange anvendelser kræver fluorescens detektion i mindst to farver samtidigt. For eksempel vores laboratorium almindeligvis udfører PCR-aktiveret droplet sortering eksperimenter, der bruger en påvisning kanal for resultatet af et assay, og bruger en sekundær baggrund farvestof for at gøre assay-negative dråbe tællelig 5.

Typiske afsløring stationer for dråbe mikrofluidik er based på epifluorescens mikroskoper, og kræver komplicerede lys manipulationer ordninger at indføre excitationslys fra fri plads lasere i mikroskop for at være fokuseret på prøven. Efter fluorescens udsendes fra en dråbe, er det udsendte fluorescerede lys filtreres så hver detektering kanal benytter et fotomultiplikatorrør (PMT) centreret på et bølgelængdebånd. Epifluorescensmikroskop-baserede optiske detektionssystemer giver en adgangsbarriere grundet deres bekostning, kompleksitet, og krævede vedligeholdelse. Optiske fibre giver mulighed for at konstruere en forenklet og robust påvisningsprotokol, da fibre kan manuelt indsættes i mikrofluidapparater, hvilket fjerner behovet for spejl-baserede lys routing, og tillader lys stier for at være forbundet ved hjælp af fiberoptiske konnektorer.

I dette papir, beskriver vi samling og validering af en kompakt og modulært ordning til at udføre flerfarvet fluorescens detektion ved at udnytte en bred vifte af optiske fibre etda enkelt fotodetektor 6. Optiske fibre er koblet til individuelle lasere, men er indsat vinkelret på en L-formet strømningskanal med regelmæssige rumlige forskydninger. En fluorescens samling fiber er orienteret parallelt med excitation regioner og er forbundet til en enkelt PMT. Fordi en dråbe passerer gennem laserstrålerne på forskellige tidspunkter, registreret af PMT viser en tidsmæssig forskydning, tillader brugeren at skelne mellem fluorescens udsendt efter dråben exciteres af hvert enkelt laserstråle. Denne tidsmæssige forskydning eliminerer behovet for at adskille udsendte lys til separate PMT'er anvendelse af en serie af dikroiske spejle og båndpasfiltre. For at validere effektiviteten af ​​detektoren, vi kvantificere fluorescens i dråben populationer indkapsler farvestoffer med forskellig farve og koncentration. Følsomheden af ​​systemet undersøges for farve fluorescein detektion enkelt, og viser evnen til at detektere små dråber med koncentrationer ned til 0,1 nM, en 200x følsomhed ekspovement sammenlignet med nylige fiber tilgange rapporteret i litteraturen 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 Master Fabrication

  1. Design af mikrofluide strukturer for tre lags fabrikation bruger design software og have design trykt af en sælger på printkort film med 10 um opløsning. Detaljerne i enhedens design er givet i en vedhæftet henvisning 6 og kanal geometrier er vist i figur 1. Lagene bør omfatte Justeringsmærkerne at hjælpe sammenstillet funktioner fra hver fabrikation lag 8.
  2. Placer en pre-rengjort 3 tommer silicium diameter wafer på et spin coater og tænd for vakuum til at anbringe det til borepatronen. Påfør 1 ml SU8-3050 i centrum af skiven og centrifugering i 20 sekunder ved 500 rpm, derefter 30 sekunder ved 1.750 rpm, hvilket giver en lagtykkelse på 80 um.
  3. Fjern skiven og bages på en 135 ° C varmeplade i 30 minutter. Tillad waferen at afkøle til stuetemperatur, før man går videre til det næste trin.
  4. Expose den coatede wafer til 1. lag maske under en kollimeret 190 mW, 365 nm LED i 3 min. Efter eksponering, placere wafer på en 135 ° C kogeplade i 1 min, afkøl derefter til RT, før du fortsætter til næste trin.
  5. Placer wafer på spin coater og tænd for vakuum til at anbringe det til borepatronen. Påfør 1 ml SU8-3050 i centrum af skiven og centrifugering i 20 sekunder ved 500 rpm, derefter 30 sekunder ved 5.000 omdrejninger i minuttet, hvilket resulterer i et lag, som tilvejebringer en yderligere tykkelse på 40 um.
  6. Fjern wafer og bages på en 135 ° C varmeplade i 30 min, derefter afkøles til RT, før du flytter til næste trin.
  7. Juster 2. lagmaske på geometri mønstrede i 1.3 og udsætte den coatede wafer til en kollimeret 190 mW, 365 nm LED i 3 min. Efter eksponering, placere på en 135 ° C kogeplade i 4 min 30 sek, så cool at RT før man går videre til næste trin.
  8. Placer wafer på spin coater og tænd for vakuum til at anbringe det til borepatronen. Påfør 1 ml SU8-3050 i centrum af skiven og centrifugering i 20 sekunder ved 500 rpm og derefter 30sekunder ved 1.000 rpm, hvilket resulterer i et lag, som tilvejebringer en yderligere tykkelse på 100 um.
  9. Fjern wafer og bages på en 135 ° C varmeplade i 30 min, derefter afkøles til RT, før du flytter til næste trin.
  10. Juster 3. lagmaske på geometri mønstrede i 1.3 og udsætte den coatede wafer til en kollimeret 190 mW, 365 nm LED i 3 min. Efter eksponering, placere på en 135 ° C kogeplade i 9 min, afkøl derefter til RT, før du fortsætter til næste trin.
  11. Udvikle maskerne ved at nedsænke i en omrørt bad af propylenglycolmonomethylether acetat i 30 min. Vask skiven i isopropanol og bages på en 135 ° C varmeplade i 1 min. Placer udviklede mester i en 100 mm petriskål for polydimethylsiloxan (PDMS) støbning.

2. PDMS Device Fabrication

  1. Forbered 10: 1 PDMS ved at kombinere 50 g af siliconen med 5 g hærder i et plastbæger. Blande indholdet med et roterende værktøj udstyret med en rørepind. degnår blandingen inde i en ekssikkator i 30 minutter, eller indtil alle luftbobler er fjernet.
  2. Hæld PDMS at give en tykkelse på 3 mm over master og placere tilbage i ekssikkator til yderligere afgasning. Når fjernes alle bobler, bage anordningen ved 80 ° C i 80 min.
  3. Skær enheden fra formen ved hjælp af en skalpel og sted på en ren overflade med den mønstrede side op og punch de strømningstekniske ind- og udgange med en 0,75 mm biopsi punch. Enheden skal skæres, så de 120 um og 220 um høje geometrier er tilgængelige fra siden af ​​enheden.
  4. Plasma behandle enheden, med indslag side op, sammen med en pre-rengjorte 2 inches med 3 inches objektglas ved 1 mbar O 2 plasma i 20 sek i en 300 W plasma renere. Binde PDMS-enheden ved at placere den mønstrede side af PDMS-enheden på plasma-behandlede side af objektglasset. Placer enheden i en 80 ° C varm ovn og bages den samlede enhed til 40 min.
  5. Render kanalernehydrofob ved anvendelse af en sprøjte til at skylle enheden med en fluoreret overfladebehandling væske. bage straks enheden ved 80 ° C i 10 minutter for at afdampe opløsningsmidlet.

3. Forberedelse af optiske komponenter

  1. Forbered laser excitation fiber ved at fjerne isoleringen fra de sidste 5 mm af en 105 um kerne, 125 um beklædning, NA = 0.22 optisk fiber.
  2. Forbered 2. farve laser excitation fiber ved at gentage 3.1 for en 2. identisk fiber.
  3. Forbered fiber til opsamling af fluorescens-signalet ved at gentage 3.1 for en 200 um kerne, 225 um beklædning, NA = 0,39 optisk fiber.
  4. Undersøg spidsen af ​​alle fibre - hvis de tips ikke ender i en flad overflade, re-kløve enderne med en fiber skriftklog.
  5. Vedhæft en laser fiber kobler til en 50 mW, 405 nm laser og vedhæfte et af de 105 um kerne fibre til laseren. Ret afisolerede ende ved føleren af ​​laser magtmeter, og bruge de fine justeringer af laser kobling til at maksimere lasereffekten.
  6. Gentag 3,5 for en 50 mW, 473 nm laser.
  7. Monter en 446/510/581/703 nm quad båndpasfiltre på PMT hjælp linse rør til at blokere laserlys og sende udsendte fluorescens. Vedhæft fiber kobling, så lyset rejser gennem filtrene før rammer PMT.
  8. Fastgør fiber fra 3,3 til enheden samles i 3.7.

4. Offline Mixed Emulsion Generation

  1. Anskaf en flow fokus mikrovæskeanordning dropmaker enhed med en 60 um x 60 um blænde.
  2. Fyld en 1 ml sprøjte med HFE 7500 olier med 2% ionisk fluor 9.
  3. Fyld en serie af 1 ml sprøjter med følgende kombinationer af fluorescein (FITC) og dextran-konjugeret blå farvestoffer (CB) i PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, og 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Monter dropmaker enhed på scenen af ​​en omvendt mikroerklare og den vandige og olie sprøjter på sprøjtepumper. Par sprøjterne til enheder, der bruger PE-2 rør.
  5. Løb sprøjtepumper ved 500 ul / time for olie og 250 ul / time i de vandige opløsninger, skabe en blanding af 80 um dråber, der indeholder de løsninger fra 4,3. For hver type af vandig prøve, bruge en frisk dropmaker enhed for at eliminere krydskontaminering. Indsamle ~ 200 pi emulsion fra hver farvestof kombination i en tom sprøjte.
  6. Efter de 4 dråber typer er blevet opsamlet i en enkelt samling sprøjte, bland emulsionen ved gentagne gange at dreje sprøjten.
  7. Gentag trin 4,2-4,6 med vandige opløsninger indeholdende 0,1, 1, 10 og 100 nM FITC i PBS.

5. Optisk fiberoplægget

  1. Placer mikrofluid chip fremstillet i trin 2 på scenen af ​​et omvendt mikroskop koblet med et digitalt kamera, som kan <100 mikrosekunder lukkerhastigheder.
  2. Arbejde omhyggeligt fra siden, Insert fiberen koblet til 473 nm laser i længst opstrøms 120 um kanal, pas på ikke at punktere igennem til hovedstrømmen kanal.
  3. Sæt fiber koblet til 405 nm laser ind i fjerneste nedstrøms 120 um høje side kanal, der giver fiber afstand på 300 um.
  4. Sæt PMT-koblet fiber ind i 220 um høje kanal vinkelret på de to laser excitation fibre.

6. Fluorescens Påvisning af blandede Emulsioner

  1. Montere en 5 ml sprøjte fyldt med HFE 7500 med 2% ionisk fluor til afstandsstykket olieindløbet af detekteringsindretningen med PE-2 rør.
  2. Monter sprøjten med blandede FITC / CB emulsion på en vertikalt orienteret sprøjte pumpe og par til enhedens dråbe reinjektion indløb hjælp PE-2 rør. Tilslut en længde på PE-2 rør fra enhedens udgang til en affaldsbeholder.
  3. Prime enheden ved at køre hver af pumperne på 1000 pi / time, indtil bådeolie og dråber ses at regelmæssigt kombination i enheden, og flyder nedstrøms.
  4. Juster strømningshastighederne således at afstandsstykket olien kører ved 6.000 pi / HR og dråber på 100 ul / time, hvilket giver en betydelig afstand mellem dråber rejser gennem påvisning region.
  5. Tænd laserne, starte datafangst program, og juster PMT gevinst at levere signaler, der er mere end 100x baseline støj gulvet. Juster lasereffekten så alle dubletten toppe er tydeligt synlige på et enkelt, lineært skaleret timetrace.
  6. Erhverve 60 sek af PMT spænding timetrace på mindst 20 kHz. Importer data i computing program såsom Matlab og måle højden af ​​toppene af de optagne dubletter ved hjælp af brugerdefinerede computing program script.
    BEMÆRK: Dette er som supplerende information.
  7. Gentag trin 6,2-6,7 ved hjælp af FITC-kun blandet emulsion skabt i 4.7, med 405 nm laser slukket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstilling af en PDMS-enhed, der giver mulighed for indsættelse af optiske fibre kræver en flertrins fotolitografi procedure til at oprette kanaler af varierende højde (figur 1). Først en 80 um høje lag af SU-8 spundet på en siliciumskive og mønstret ved anvendelse af en maske til at skabe den væskehåndtering geometri. Dernæst yderligere 40 um lag af SU-8 spundet på skiven, og mønstret ved anvendelse af en anden maske for at oprette funktioner, der vil danne 120 um tall laser fiberoplægget kanaler. Sidste, er 100 um mere SU-8 spundet på wafer, og mønstrede at give 220 um tall afsløring fiber indsættelse kanaler. Føreren er udviklet og anvendt til at støbe en PDMS-enhed, som igen er bundet til et objektglas. Den endelige fabrikation indeholder 80 um høj flow geometri, tilgås via huller knytnæveslag i toppen af ​​enheden og 120 um og 220 um høje optiske fibre kanaler adgang til via den side afenhed.

Geometrien af indretningen anvendes til detektion er vist i figur 2. Eksternt produceret 80 um emulsioner re-injiceres i en dråbe reinjektion havn og adskilt med spacer olie før de flyder ind i en L form detektering kanal. To laser-koblede fibre er indsat i 120 um høje kanaler giver excitation ved diskrete rumlige lokationer i strømningskanalen. Fordi multimodale fibre indsat i disse kanaler har en 125 um udvendig diameter og en 105 um kernediameter, er hele tværsnittet af strømningskanalen belyses med laserlys. I vores detekteringsindretningen strømningskanal gør en brat 90 graders drejning efter den sidste laser excitation region at skabe tæt optisk adgang til en 225 um OD fiber anvendes til at påvise emitteret fluorescens. Den større fiber anvendes på grund af dens høj numerisk apertur (NA = 0,39), hvilket svarer til en standard mikroskopobjektiv.

En dråbe strømmer gennem påvisning kanal støder diskrete excitation regioner foran hver af de laser-koblede optiske fibre (figur 3A). Den enkelte PMT koblet til påvisning fiber optegnelser udsendes fluorescens med en tidsmæssig forskydning kortene til excitation kilde. For en dråbe, der indeholder farvestoffer, der begejstrer ved 473 nm (region "1" i figur 3A) og ved 405 nm (region "2" i figur 3B), det resulterende PMT signal indeholder et signal dublet med en topadskillelse der korrelerer med tid, det tager en lille dråbe at flytte fra et excitation region til den næste. Ved tidsmæssigt koder spektraldata på denne måde, er behovet for yderligere lys filtrering og separate PMT'er for hver fluorofor farve elimineret. Figur 3B viser signal dubletter for et tog af 4 dråber med forskellige farvestof kombinationer. Den første top i den dobbelte svarers til fluorescens udsendt efter excitation ved 473 nm laser i område "1" og den anden top svarer til fluorescens udsendt efter excitation ved 405 nm laser i region "2".

Effektiviteten af ​​påvisning ordningen blev testet ved at detektere en blandet emulsion af smådråber indeholdende farvestoffer, der begejstrer ved 405 nm (dextran-konjugeret blå, CB) og ved 473 nm (fluorescein, FITC). Dråber blev strømmet gennem afsløring regioner på omkring 50 Hz og data blev registreret i 60 sek, derefter efterbehandlet med en computing program script. Dataene er afbildet i figur 4 og viser klar adskillelse mellem de fire re-injiceres dråbe typer. Fordi påvisning systemet ikke skelne mellem forskellige farver af udsendt lys, er hver dråbe beskrevet af dens maksimale totale fluorescens efter at være spændt i område "1" (top 1) og i område 2 (top 2).

(figur 5). Dataene viser evnen til at påvise koncentrationen farvestof, der spænder fra 0,1 til 100 nM FITC på en enkelt detektor med de samme indstillinger afsløring.

figur 1
Figur 1. Multi-layer fotolitografi. Den mikrofluidapparat er fremstillet ved at skabe en mester med tre forskellige funktion højder. Først en 80 um høj lag af SU-8 spundet på og mønstrede ved hjælp af en maske til væsken kanaler. Dernæst 40 pm mere SU-8 spundet på og 120 um høje funktioner er mønstret med en 2 nd maske gennem begge SU-8 lag til opnåelse geometri til at rumme 125 um høje optiske fibre. Efter dette, 100 um mere SU-8 spindes på og mønstret med en 3 rd maske til dannelse 225 um høje funktioner. Efter at udvikle, PDMS støbning, og plasma limning på glas, indeholder den resulterende enhed store kanaler tilgængelige fra side til fiber indsættelse, i tillæg til standard lukkede fluidkanaler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Device design og optisk layout. De strømningstekniske dele af indretningen består af en dråbe reinjector og en olie spacer, der er koblet til en L-formet kanal. Fibre koblet til individuelle lasere indsættes vinkelret på strømningsretningen. En påvisning fiber indsættes vinkelret på laser fibre for at indsamle fluorescerende lys. Dette lys filtreres gennem abandpass filter, før de blev opdaget af en enkelt PMT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Tidsmæssig indkodning af flerfarvet information. (A) Dråber strømme gennem magnetisering regioner "1" og "2" på forskellige tidspunkter, hvilket giver tid skift, der tillader identifikation af det udsendte lys. (B) Data fra et tog på 4 forskellige dråber flyder gennem påvisning kanal. Den første top af hver dublet svarer til den fluorescens udsendt efter excitation i regionen "1" og den anden top i hver dobbelt svarer til fluorescens udsendt efter excitation i regionen "2". Højden af ​​dråber toppe er proportionelle mængden af ​​farvestof ophidset på engiven bølgelængde, undtagen når spektral bleed opstår på grund af anvendelsen af ​​farvestoffer med overlappende excitationsspektre. Bredden af toppene er bestemt af den tid, det tager en dråbe til at krydse en excitation region. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Flerfarvet påvisning af en population blandet dråbe. Scatter plot viser maksimale dråbe for en befolkning blandet dråbe efter excitation og emission af en 473 nm laser (peak 1) og en 405 nm laser (peak 2). Dråberne indeholder kombinationer af fluorescein (FITC) og kaskade blå (CB) ved nM-koncentrationer. Klik her for at se en større version af dennefigur.

Figur 5
Figur 5. Enkelt farve afsløring på meget varieret dråbe befolkning. Histogram af udledningerne en befolkning blandet dråbe indeholder 0,1-100 nM fluorescein efter excitation af en 473 nm laser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fiberoptisk detektion kræver tilpasning af optiske fibre i forhold til fluidkanaler. Fordi vores enhed anvender styrekanaler fremstillet med flerlags fotolitografi, placering af masker i forhold til hinanden, er af stor betydning. Hvis fiber styrekanaler er for tæt på fluidkanalen, der er et potentiale for væskelækage; hvis de vejledende kanaler er placeret for langt væk eller fejljusteret, kan fluorescenssignal indsamlet af påvisning fiber blive væsentligt formindsket. Korrekt justering kan blive hjulpet ved at designe tilpasning mærker, såsom koncentriske cirkler i masker til at blive placeret under foto mønster. Derudover manuel indsætning af optiske fibre ind i indretningen er en delikat proces med potentiale til at bryde spidsen af ​​fibre inden i indretningen, hvilket gør dem ubrugelige. Fastholdelsesudstyr fiber mod objektglasset bundet til PDMS enheden og indsætte fibrene langsomt under iagttagelse med mikroskopet er nøglen til successful fiberoplægget. Endelig reinjektion af præformerede emulsioner bør forekomme med et minimum af håndtering. Ideelt når emulsionen er fremstillet og sat direkte ind i en tom sprøjte, det bør ikke overføres indtil det anvendes til små dråber reinjektion.

Flerfarvet detektion kræver, at toppene i et signal dublet være adskilt fra hinanden, og at signalerne fra på hinanden følgende dråber ikke overlapper. Opsætningen detektion som vi bruger her anvender et par af 125 um optiske fibre adskilt ved en center-til-center afstand på 300 um, giver en ubelyste område af ~ 175 um mellem excitations- regioner. Dette tillader en 80 um dråber, der skal exciteres af kun én lyskilde ad gangen og sikrer, at hver af toppene i en dublet er alene et resultat af en type laser excitation. Design, hvor adskillelsen mellem excitations- regionerne svarer til den dråbediameter giver problematiske signaler med overlappende peak emission dubletter. Than bredde af et signal dublet korrelerer til den tid, det tager for forkanten af ​​en dråbe at indtaste de første excitations- regioner til den tid bagkanten af ​​dråben til at forlade den endelige excitation region, en afstand på ~ 500 um i enhed vi beskrive. For at opretholde selvstændighed af tilstødende detekterede dråber, signal dubletter skal adskilt med et lavt signal region mindst lige så bred som signalet dublet. Til konfiguration beskrevet her, er 80 um smådråber anbragt med mindst 1 mm fra hinanden.

Selvom flerfarvede detektion med en enkelt fotodetektor muliggør betydelige besparelser i form af omkostninger og kompleksitet i forhold til standard teknikker, der er et vist tab af robusthed fordi emitterede lys ikke filtreres ved bølgelængde. Dette kan være problematisk, når der detekteres dråber, der indeholder flere fluoroforer, der begejstrer ved de samme bølgelængder, fordi fluorescensen kilde er sammenfaldende. Disse begrænsninger kan være overcogle ved at udføre eksperimenter med ikke-overlappende excitation profiler, eller ved at designe eksperimenter, hvor spektral bløder løbet ikke finder sted i en "kanal", hvor en følsom analyse udføres. Dette er foreneligt med mange droplet mikrofluid afsløring applikationer, hvor en lys baggrund farvestof bruges til at indikere tilstedeværelsen af en dråbe, og en anden fluorofor anvendes til at angive resultatet af en molekylær biologi assay 10,11.

Sammenlignet med standard teknikker, vores tilgang har to fordele: 1) rumligt registrerede excitation regioner eliminerer behovet for komplicerede lys filtrering, og 2) anvendelse af fiberoptik fjerner behovet for et mikroskop og optisk hardware til direkte lys. Fordi vi løse fælles tekniske problemer med mikrofluide systemer til detektion, har tidligere forskere udviklet metoder til at løse lignende bekymringer. , Martini et al. Frekvens-encode flerfarvet fluorescens optaget Eksempelvisaf en enkelt detektor ved at projicere en excitation kilde gennem unikt mønster "stregkode" filtrerer 12. Vores brug af en optisk fiber-array tillader udnyttelsen af ​​en lignende tidsmæssig kodningsskema hjælp af standard, fra hylden komponenter. Litteraturen viser optiske talrige optiske kobling teknikker, der er flere kontrollerede, at den simple fiberoplægget at vi beskrive. Bliss et al. Bruge væskefyldte optiske bølgeledere for nøje kontrolleret levering og samling af lys fra bestemte mikrokanalplader steder 13, Martinez Vasquez et al. Bruge bølgeledere laser ætset ind kvartsglas substrater til at levere excitationslyset 14, og Vishnubhatla et al. Er i stand til præcist fabrikere fiber indsættelse kanaler ved hjælp af en kombination af laser bestråling og kemisk ætsning 15. Hver af disse teknikker kræver yderligere trin udover dem, der anvendes til at fremstille basen strømningstekniske arkitektur en microfluidic chip. Mens disse fremstillingsprocedurer kan være nødvendig til meget følsom påvisning applikationer, har vi fundet, at fiber indsættelse i en støbt PDMS kanal er tilstrækkelig for de fleste af de daglige applikationer i vores laboratorium. Detektionssystemet kunne detektere FITC koncentrationer ned til 100 pM i 80 um smådråber, nogenlunde svarer til påvisning af ~ 17.000 fluoroforen molekyler. Denne følsomhed er tilstrækkelig for de fleste detection applikationer i vores laboratorium i øjeblikket en epifluorescens-baseret system, den mest almindelige blive PCR-cellesortering af assay positive dråber indeholdende ækvivalentet til 10 6 fluoroforen molekyler 11. Påvisning følsomhed også sammenligner positivt til for nylig rapporteret følsomhed andre optiske fibre baserede systemer - for eksempel, det er 200x mere følsom end detektionsgrænsen på 20 nM Alexa Fluor 488 rapporteret i> 100 um dråber 7.

We har præsenteret en kompakt og modulært dråbe mikrofluid ordning afsløring flerfarvede som et alternativ til dyrere, komplekse og voluminøse epifluorescensmikroskop baserede systemer. De nødvendige afsløring komponenter, der anvendes her (lasere, fibre, fiber adaptere, filter og PMT) kan købes for <$ 10.000, hvilket gør detektion de flerfarvede dråbe tilgængelige for et stort antal efterforskere, og at de enkelte undersøgere råd flere afsløring stationer i et laboratorium. Systemet fjerner også nogle ekspertise-baserede adgangsbarrierer, som en grad af fortrolighed er påkrævet for at tilpasse ledig plads optiske systemer i forbindelse med en epifluorescensmikroskop. Derudover den lille fodaftryk fund setup gør det velegnet til bærbare og diagnostiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats