Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dropp mikrofluidik tillhandahålla en plattform för hög genomströmning biologi genom compartmentalizing experiment i ett stort antal vattenhaltiga droppar suspenderade i en bärare olja 1. Droppar har använts för tillämpningar som varierade som enda cell analys 2, digital polymerase chain reaction (PCR) 3, och enzym evolution 4. Fluorescerande analyser är standardläget för upptäckt för dropp mikrofluidik, eftersom deras ljusa signaler och snabb svarstid är kompatibla med detektering av sub-nanoliter droppvolym på kilohertz priser. Många applikationer kräver fluorescensdetektion i minst två färger samtidigt. Exempelvis utför vårt labb vanligen PCR-aktiverade droppsorteringsexperiment som använder en detekteringskanal för resultatet av en analys, och använder en sekundär bakgrund färgämne för att göra analysen negativa dropp kvantifierbart 5.

Typiska detekteringsstationer för dropp mikrofluidik är based på epifluorescence mikroskop, och kräver komplicerade ljus manipulationer system för att införa excitationsljus från fria rymden lasrar i mikroskop för att fokuseras på provet. Efter fluorescens avges från en droppe, är det emitterade fluorescerande ljuset filtreras så att varje detekteringskanal använder ett fotomultiplikatorrör (PMT) centrerad på en våglängdsband. Epifluorescensmikroskop baserade system optisk detekterings ge ett hinder för inträde på grund av deras bekostnad, komplexitet och underhåll krävs. Optiska fibrer ger möjlighet att bygga en förenklad och robust detektionsschema, eftersom fibrer kan manuellt in i mikroflödessystem enheter, tar bort behovet av spegel baserad ljus routing, och låta ljusvägar kan gränssnitt med hjälp av fiberoptiska kontaktdon.

I detta dokument beskriver vi montering och validering av en kompakt och modulärt system för att utföra multifluorescensdetektion genom att använda en rad optiska fibrer enda enda fotodetektor 6. Optiska fibrer är kopplade till individuella lasrar och infogas normalt till en L-formad flödeskanal med jämna rumsliga förskjutningar. En fluorescensuppsamlingsfiber är orienterad parallellt med exciterings- regionerna och är ansluten till en enda PMT. Eftersom en droppe passerar genom laserstrålarna vid olika tider, uppgifter som registrerats av PMT visar en tidsmässig förskjutning som tillåter användaren att skilja mellan fluorescens som emitteras efter droppen exciteras av en och samma laserstråle. Denna tids förskjutning eliminerar behovet av att separera utsända ljuset att separera PMTs med hjälp av en rad dikroitiska speglar och bandpassfilter. För att validera effektiviteten av detektorn, kvantifiera vi fluorescens i dropp populationer inkapslande färgämnen av olika färg och koncentration. Känsligheten hos systemet undersöks för enfärgade fluorescein detektering, och visar förmåga att upptäcka droppar med koncentrationer ned till 0,1 nM, en 200x känslighet improvement jämfört med senaste fiberbaserade metoder som rapporterats i litteraturen 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 master Fabrication

  1. Utforma mikroflödesstrukturer för tre skikt tillverkning med hjälp av design mjukvara och har mönster tryckta av en leverantör på kretskort film med 10 pm upplösning. Detaljerna i enheten konstruktion ges i en bifogad referens 6 och kanalgeometrier visas i figur 1. Lagren bör innefatta inriktningsmärken för att samlokalisera funktioner från varje tillverkningsskikt 8.
  2. Placera en i förväg rengjord 3 tum kisel diameter wafer på en spinnbeläggare och slå på vakuum att fästa det till chucken. Applicera 1 ml av SU8-3050 i centrum av skivan och snurra i 20 sekunder vid 500 rpm, därefter 30 s vid 1750 rpm, vilket ger en skikttjocklek av 80 | im.
  3. Ta bort skivan och baka på ett 135 ° C värmeplatta i 30 min. Göra det möjligt för skivan att kylas till RT innan vi går vidare till nästa steg.
  4. Exponera den belagda skivan till den 1: a lagermasken enligt en kollimerad 190 mW, 365 nm LED för 3 min. Efter exponering, placera skivan på en 135 ° C värmeplatta under 1 min och sedan svalna till RT innan du fortsätter till nästa steg.
  5. Placera skivan på spinnbeläggare och slå på vakuum att fästa det till chucken. Applicera 1 ml av SU8-3050 i centrum av skivan och snurra i 20 sekunder vid 500 rpm, därefter 30 s vid 5000 varv per minut, vilket resulterar i ett skikt som ger en ytterligare tjocklek av 40 | im.
  6. Ta bort skivan och grädda på en 135 ° C värmeplatta under 30 minuter, kyl sedan till RT innan du flyttar till nästa steg.
  7. Rikta in 2: a lagermask på geometrin mönstrade i 1,3 och exponera den belagda skivan till en kollimerad 190 mW, 365 nm LED för 3 minuter. Efter exponering, placera på en 135 ° C värmeplatta för 4 min 30 sek, kyl sedan till RT innan du fortsätter till nästa steg.
  8. Placera skivan på spinnbeläggare och slå på vakuum att fästa det till chucken. Applicera 1 ml av SU8-3050 i centrum av skivan och snurra i 20 sekunder vid 500 rpm, därefter 30sek vid 1000 varv per minut, vilket resulterar i ett skikt som ger en ytterligare tjocklek av 100 | im.
  9. Ta bort skivan och grädda på en 135 ° C värmeplatta under 30 minuter, kyl sedan till RT innan du flyttar till nästa steg.
  10. Rikta den 3: e lagermask på geometrin mönstrade i 1,3 och exponera den belagda skivan till en kollimerad 190 mW, 365 nm LED för 3 minuter. Efter exponering, placera på en 135 ° C värmeplatta för 9 minuter, kyl sedan till RT innan du fortsätter till nästa steg.
  11. Utveckla maskerna genom nedsänkning i ett omrört bad av propylenglykolmonometyleteracetat under 30 min. Tvätta wafern i isopropanol och baka på en 135 ° C värmeplatta i 1 min. Placera den utvecklade mästare i en 100 mm petriskål för polydimetylsiloxan (PDMS) gjutning.

2. PDMS Device Fabrication

  1. Preparera 10: 1 PDMS genom att kombinera 50 g av silikon-bas med 5 g av härdare i en plastkopp. Blanda innehållet med ett roterande verktyg utrustad med en omrörningsstav. degnär blandningen inuti en exsickator under 30 min, eller till dess att alla luftbubblor avlägsnas.
  2. Häll PDMS för att ge en tjocklek av 3 mm över befälhavaren och placera tillbaka in i torkapparat för ytterligare avgasning. När alla bubblor avlägsnas, baka anordningen vid 80 ° C under 80 min.
  3. Skär enheten från formen med hjälp av en skalpell och plats på en ren yta med den mönstrade sidan uppåt och punsch fluidic inlopp och utlopp med en 0,75 mm biopsistans. Enheten måste skäras så att de 120 um och 220 um höga geometrier är åtkomliga från sidan av enheten.
  4. Plasma behandla anordningen med funktionen uppåt tillsammans med en förren 2 inches med 3 inches glasskiva på en mbar O 2 plasma för 20 sekunder i en 300 W plasma renare. Binda PDMS anordningen genom att placera det mönstrade sidan av PDMS-enheten på den plasmabehandlade sidan av objektglas. Placera enheten i en ugn vid 80 ° och grädda den monterade anordningen i 40 min.
  5. Render kanalernahydrofob genom användning av en spruta för att spola anordningen med en fluorerad ytbehandlingsvätska. Omedelbart baka anordningen vid 80 ° C under 10 min för att förånga lösningsmedlet.

3. Framställning av optiska komponenter

  1. Förbered laser excitation fibern genom att ta bort isoleringen från de sista 5 mm av en 105 um kärna, 125 fim beklädnad, NA = 0,22 optisk fiber.
  2. Förbered 2: a färglaser excitation fiber genom att upprepa 3.1 för en 2: a identisk fiber.
  3. Förbered fiber för uppsamling av fluorescenssignalen genom att upprepa 3.1 för en 200 nm kärna, 225 fim beklädnad, NA = 0,39 optisk fiber.
  4. Inspektera tips för alla fibrer - om tips inte slutar i en plan yta, åter klyva ändarna med en fiber skrivare.
  5. Bifoga en laserfiberkopplare till en 50 mW, 405 nm laser och bifoga en av de 105 pm kärnfibrer till lasern. Rikta den avskalade änden vid sensorn av lasereffektenmeter, och använda de fina justeringar av laser skarvdon för att maximera lasereffekt.
  6. Upprepa 3,5 för en 50 mW, 473 nm laser.
  7. Montera en 446/510/581/703 nm quad bandpassfilter på PMT använder lins rör för att blockera laserljus och överföra emitterad fluorescens. Fäst fiberkopplare så att ljuset färdas genom filtren innan du trycker på PMT.
  8. Fäst fiber från 3,3 till enheten monteras i 3,7.

4. Offline blandade emulsionen Generation

  1. Skaffa en flödesfokus mikrofluidik dropmaker anordning med en 60 um x 60 um öppning.
  2. Fyll en 1 ml spruta med HFE 7500 oljor med 2% jonisk fluorotensid 9.
  3. Fyll en serie av 1 ml sprutor med följande kombinationer av fluorescein (FITC) och dextran-konjugerade blå färgämnen (CB) i PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, och 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Montera dropmaker enheten på scenen av ett inverterat microsklara och vatten och olje sprutor på sprutpumpar. Par sprutorna till enheter med PE-2 slang.
  5. Running sprutpumpar på 500 l / h för oljan och 250 pl / h för vattenlösningar, skapa en blandning av 80 um droppar som innehåller lösningar från 4,3. För varje typ av vattenhaltigt prov, använda ett färskt dropmaker anordning för att eliminera korskontaminering. Samla ~ 200 pl emulsion från varje färgämne kombination i en tom spruta.
  6. Efter de 4 droppar typerna har samlats i en enda uppsamlingsspruta, blanda emulsionen genom att upprepade gånger vrida på sprutan.
  7. Upprepa steg 4,2-4,6 med vattenlösningar innehållande 0,1, 1, 10, och 100 nM FITC i PBS.

5. Optisk fiber Inser

  1. Placera mikroflödes chip tillverkat i steg två på scenen av ett inverterat mikroskop i kombination med en digital kamera som kan <100 ps slutartider.
  2. Arbetar noggrant från sidan, insert fibern är kopplad till 473 nm laser in längst uppströms 120 um kanal, noga med att inte punktera genom till huvudflödeskanalen.
  3. Sätt fibern är kopplad till 405 nm laser in längst nedströms im hög sidokanal 120, som ger fiber avstånd av 300 pm.
  4. Sätt in PMT kopplade fiber till 220 fim lång kanal vinkelrätt mot de två laser excitation fibrer.

6. fluorescensdetektion av blandade emulsioner

  1. Montera en 5 ml spruta fylld med HFE 7500 med 2% jonisk fluorotensid till distansoljeinlopp hos detekteringsanordningen med PE-2-slang.
  2. Montera spruta innehållande den blandade FITC / CB emulsion på en vertikalt orienterad sprutpump och par till enhetens dropp återföring inlopp med hjälp av PE-2 slang. Anslut en längd av PE-2 slang från enheten utgång till en avfallsbehållare.
  3. Prime anordningen genom att köra var och en av pumparna vid 1000 | il / timme tills bådaolja och droppar ses regelbundet kombinera i anordningen och strömmar nedströms.
  4. Justera flödeshastigheter så att distans oljan rinner på 6000 l / tim och dropparna vid 100 pl / h, vilket ger betydande avstånd mellan dropparna färdas genom detekteringsområdet.
  5. Slå på lasrarna, starta datainsamlingsprogram, och justera PMT förstärkning för att ge signaler som är mer än 100x baslinjen brusgolvet. Justera lasereffekten, så att alla de doublet toppar är klart synliga på en enda, linjärt skalas timetrace.
  6. Förvärva 60 sek av PMT spänningen timetrace vid åtminstone 20 kHz. Importera data till beräkningsprogram som Matlab och mäta höjder toppar inspelade dubletter med hjälp av anpassade datorprogrammet script.
    OBS: Detta anges som kompletterande information.
  7. Upprepa steg 6,2-6,7 med användning av FITC-bara blandade emulsionen skapas i 4,7, med 405 nm laser avstängd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tillverkning av en PDMS-enhet som möjliggör införing av optiska fibrer kräver en flerstegsfotolitografi procedur för att skapa kanaler av varierande höjd (Figur 1). För det första är en 80 | j, m lång skikt av SU-8 spanns på en kiselskiva och mönstras med användning av en mask för att skapa vätskehanterings geometri. Därefter ytterligare 40 um skikt av SU-8 spunnet på skivan, och mönstrad med hjälp av en andra mask för att skapa funktioner som kommer att utgöra 120 fim lång laserfiberinför kanaler. Slutligen är 100 um mer SU-8 spunnet på skivan, och mönster för att ge 220 fim lång detekteringsfiberinför kanaler. Befälhavaren utvecklas och används för att gjuta en PDMS anordning, vilken i sin tur är bunden till en glasskiva. Den slutliga tillverkningen innehåller 80 um höga flödesgeometri, nås via hål stansade i toppen av enheten och 120 um och 220 um höga optiska fiberkanaler nås via sidan avanordning.

Geometrin hos den anordning som används för detektion visas i figur 2. Externt genererade 80 um emulsioner återinföras i en droppe återföring hamn och åtskilda med distans olja innan de flyter in i en L-form detekteringskanal. Två laserkopplade fibrerna är införda i 120 | j, m höga kanaler ger excitation vid diskreta rumsliga lägen i flödeskanalen. Eftersom de multimodfibrer införda i dessa kanaler har en 125 ^ m yttre diameter och en 105 | am kärndiameter, är hela tvärsnittet av strömningskanalen belyses med laserljus. I vår enhet detekteringsflödeskanalen gör en tvär 90 graders sväng efter den sista laserexciteringsområdet för att skapa nära optisk access för en 225 um OD fiber som används för att detektera emitterad fluorescens. Den större fiber används på grund av dess hög numerisk apertur (NA = 0,39), som liknar en standardmikroskopobjektiv.

En droppe strömmar genom detekteringskanal möter diskreta exciteringsregioner framför var och en av de laserkopplade optiska fibrer (Figur 3A). Den enda PMT kopplad till detekteringsfiber register utsända fluorescens med en tidsskifte kartorna till exciteringskällan. För en droppe som innehåller färgämnen som exciterar vid 473 nm (region "en" i fig 3A) och vid 405 nm (region "2" i fig 3B), innehåller den resulterande PMT-signalen en signal dublett med en topp separation som korrelerar med tid det tar en droppe att flytta från ett exciteringsområdet till nästa. Genom att temporärt kodning spektraldata på detta sätt, är behovet av ytterligare ljus filtrering och separata PMTs för varje fluoroforen färg elimineras. Figur 3B visar signal dubletter för ett tåg av 4 droppar med olika färgkombinationer. Den första toppen i dubbel motsvarars till fluorescens som emitteras efter excitation av 473 nm laser i regionen "1" och den andra toppen motsvarar fluorescens som emitteras efter excitation av 405 nm laser i regionen "2".

Effekten av detekteringsschemat testades genom detektering av en blandad emulsion av små droppar innehållande färgämnen som exciterar vid 405 nm (dextran-konjugerad blå, CB) och vid 473 nm (fluorescein, FITC). Dropparna rann genom regionerna detekterings på ungefär 50 Hz och data registrerades under 60 sekunder, sedan efterbehandlade med en beräkningsprogram manus. Data plottas i Figur 4 och visar tydlig åtskillnad mellan de fyra åter injicerade dropptyper. Eftersom detekteringssystemet inte skilja mellan olika färger av emitterade ljuset är varje droppe beskrivs av sin maximala totala fluorescens efter att exciteras i regionen "1" (topp 1) och i region 2 (topp 2).

(figur 5). Data visar förmågan att detektera färgkoncentration som sträcker sig från 0,1 till 100 nM FITC på en enda detektor med samma inställningar upptäckt.

Figur 1
Figur 1. Flera lager fotolitografi. Mikroflödessystem enhet tillverkas genom att skapa en mästare med tre olika funktionshöjder. För det första är en 80 | j, m lång skikt av SU-8 spunnet på och mönstras med användning av en mask för fluidkanalerna. Därefter 40 um mer SU-8 spunnet på och 120 ^ m höga funktioner är mönstrad med en 2: a mask genom båda SU-8 skikt för erhållande av geometri för att rymma 125 ^ m höga optiska fibrer. Efter detta, en00 um mer SU-8 spinns på och mönstrad med en 3: e mask för att ge 225 um höga funktioner. Efter framkallning PDMS gjutning, och plasma bindning till glas, innehåller den resulterande enheten stora kanaler tillgängliga från sidan för fiber insättning, i tillägg till standardbehandling slutna vätskekanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Anordning design och optisk layout. Fluidic delarna av anordningen består av en dropp reinjector och en olje spacer, som är kopplad till en L-formad kanal. Fibrer kopplade till individuella lasrar är införda vinkelrätt mot flödesriktningen. En detekteringsfiber är införd vinkelrätt mot de laserfibrer i syfte att samla fluorescerande ljus. Detta ljus filtreras genom abandpass filter, innan den detekteras av en enda PMT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Tids kodning av multi information. (A) Droppar strömma genom exciteringsregioner "1" och "2" vid olika tidpunkter, vilket ger tidsförskjutning som möjliggör identifiering av det utsända ljuset. (B) Data från ett tåg av 4 olika droppar strömmar genom detekteringskanal. Den första toppen av vardera dublett motsvarar den fluorescens som emitteras efter excitering i regionen "1", och den andra toppen i varje dubbel motsvarar den fluorescens som emitteras efter excitering i region "2". Höjden av dropp toppar är proportionella mängden färgämne exciteras vid engiven våglängd, förutom när spektral blödning uppstår på grund av användningen av färgämnen med överlappande exciteringsspektra. Bredden av topparna bestäms av den tid som det tar en droppe att passera en exciteringsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Multi detektion av en blandad dropp befolkning. Punktdiagram som visar maximala dropp intensiteter för en blandad dropp befolkning efter excitation och emission av en 473 nm laser (topp 1) och en 405 nm laser (topp 2). Dropparna innehåller kombinationer av fluorescein (FITC) och kaskadblått (CB) vid nM koncentrationer. Klicka här för att se en större version av dennafigur.

figur 5
Figur 5. Enfärgade upptäckt på mycket varierande dropp befolkning. Histogram av utsläpp från en blandad dropp population innehållande 0,1-100 nM fluorescein efter excitation av en 473 nm laser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fiberoptiska detektions kräver anpassning av optiska fibrer med avseende på vätskekanaler. Eftersom vår enhet använder styrkanaler tillverkade med flerskiktsfotolitografi, är placeringen av masker med avseende på varandra av stor betydelse. Om de fiberstyrkanalerna är för nära fluidkanalen, finns det en potential för fluidläckage; om styrkanalerna är placerade för långt bort eller snett, kan fluorescenssignalen som samlats in av detekteringsfiber minskas avsevärt. Korrekt placering kan underlättas genom att utforma inriktningsmärken, såsom koncentriska cirklar i masker för att placeras tillsammans under foto mönstring. Dessutom är manuell införing av fiberoptik i anordningen en känslig process som har potential att bryta spetsarna på fibrerna inuti anordningen, vilket gör dem oanvändbara. Besöksförbud fiber mot glasskiva bunden till PDMS enheten och sätta fibrerna långsamt under iakttagande med mikroskop är nycklarna till Successful fiber införing. Slutligen återföring av förformade emulsioner bör ske med ett minimum av hantering. Helst när emulsionen görs och in direkt på en tom spruta, det bör inte överföras förrän det används för dropp återföring.

Multi detektering kräver att topparna i en signal dubb vara åtskilda från varandra och att signaler från konsekutiva droppar inte överlappar varandra. Installations upptäckt att vi använder här använder ett par av 125 fim optiska fibrer separerade vid ett centrum till centrum avstånd av 300 pm, vilket ger en icke-belysta området av ~ 175 um mellan exciteringsregioner. Detta tillåter en 80 | j, m droppe som skall exciteras av endast en ljuskälla vid en tid och säkerställer att var och en av topparna i en dublett är enbart ett resultat av en typ av laser excitation. Konstruktioner där separationen mellan exciteringsregionerna liknar droppdiametern ge problematiska signaler med överlappande emissionstopp dubletter. Than bredden av ett signal dublett korrelerar till den tid det tar för den främre kanten av en droppe att ange de första exciteringsregioner till den tid när bakkanten på droppen för att lämna det slutliga exciteringsområdet, ett avstånd av ~ 500 | j, m i enhet vi beskriver. I syfte att bibehålla tydlighet av intilliggande detekterade små droppar, signal dubletter måste vara åtskilda av en låg signalregion åtminstone lika bred som signal dublett. För konfigurationen som beskrivs här, är 80 pm droppar fördelade åtminstone 1 mm från varandra.

Även om flera färger upptäckt med en enda fotodetektor möjliggör betydande besparingar i form av kostnader och komplexitet jämfört med standardtekniker, det finns en viss förlust av robusthet, eftersom det emitterade ljuset inte filtreras av våglängd. Detta kan vara problematiskt vid detektering av små droppar som innehåller flera fluoroforer som exciterar vid samma våglängder, eftersom fluorescenskällan är omöjliga att särskilja. Dessa begränsningar kan vara overcome genom att utföra experiment med icke överlappande exciteringsprofiler eller genom att utforma experiment där spektral utfallande över uppstår inte till en "kanal", där en känslig analys utförs. Detta är kompatibelt med många droppapplikationer mikroflödes upptäckt, där en ljus bakgrund färgämne används för att indikera närvaron av en droppe, och en andra fluorofor används för att rapportera resultatet av en molekylärbiologisk analys 10,11.

Jämfört med standardtekniker, har vår strategi två huvudsakliga fördelar: 1) rumsligt registrerade exciteringsregioner eliminerar behovet av komplicerade ljus filtrering, och 2) användning av fiberoptik avlägsnar behovet av ett mikroskop och optisk hårdvara för direkt ljus. Eftersom vi ta itu med gemensamma tekniska problem med mikroflödesdetektionssystem, har tidigare forskare utvecklat metoder för att ta itu med liknande problem. Till exempel, Martini et al. Frekvens koda multi fluorescens registrerasav en enda detektor genom att projicera en exciteringskälla genom unikt mönstrad "streckkod" filter 12. Vår användning av en optisk fiberuppsättning medger utnyttjandet av en liknande tidsmässig kodningsschema med användning av standard, från hyllan komponenterna. Litteraturen visar optiska många optiska kopplingstekniker som är mer kontrollerade att den enkla fiberinför som vi beskriver. Bliss et al. Använder vätskefyllda guider optisk våg för noggrant kontrollerad leverans och insamling av ljus från specifika mikrokanalplatser 13, Martinez Vasquez et al. Använder vågledare laseretsad i kvarts substrat för att leverera excitationsljus 14, och Vishnubhatla et al. Är kunna exakt tillverka fiberinför kanaler med en kombination av laser bestrålning och kemisk etsning 15. Var och en av dessa tekniker kräver ytterligare steg utöver de som används för att tillverka basen fluidic arkitekturen av en microfluidic chip. Även om dessa tillverkningsprocedurer kan vara nödvändigt för mycket känsliga detektering, har vi funnit att fiber insättning i en gjuten PDMS kanal är tillräckligt för de flesta vardagliga tillämpningar i vårt labb. Detekteringssystemet kunde upptäcka FITC koncentrationer ned till 100 pM i 80 um droppar, vilket ungefär motsvarar detektering av ~ 17.000 fluorofor molekyler. Denna känslighet är tillräcklig för de flesta upptäckt applikationer i vårt laboratorium för närvarande använder en epifluorescence baserat system, den vanligaste av dessa är PCR-aktiverad cellsortering av analys positiva droppar innehållande motsvarande 10 6 fluorofor molekyler 11. Detekteringskänsligheten jämför också positivt till nyligen rapporterat känsligheten hos andra optiska fiberbaserade system - till exempel, är det 200x mer känslig än detektionsgränsen av 20 nM Alexa Fluor 488 rapporterades i> 100 um droppar 7.

We har presenterat en kompakt och modulär droppmikroflödesfler färgsättning detektering som ett alternativ till dyrare, komplexa och skrymmande epifluorescensmikroskop baserade system. De nödvändiga detektions komponenter som används här (lasrar, fibrer, fiber adaptrar, filtrera och PMT) kan köpas för <$ 10.000, vilket gör den flerfärgade droppdetektering tillgänglig för ett stort antal forskare och låta enskilda utredare för att ge flera stationer detektions i ett laboratorium. Systemet också ta bort en del expertis baserade inträdeshinder, som en viss förtrogenhet krävs för att anpassa ledigt utrymme optiska system i samband med ett epifluorescensmikroskop. Dessutom den lilla fotavtryck av upptäckter installationen gör den idealisk för bärbara och diagnostiska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats