جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وداخل الجمجمة أورام المخ الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا هي الصف الثالث astrocytomas والصف الرابع ورم أرومي الأشكال (ورم أرومي أو GBM). هذه الأورام تقدم التكهنات الفقيرة مع متوسط ​​البقاء على قيد الحياة لمدة عام بين 12-15 شهرا مع العلاجات الحالية للGBM في 1-3 الولايات المتحدة. وتشمل العلاجات Multimodality الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي بما في ذلك temozolomide (TMZ) وكلاء المستهدفة كيناز. وكثيرا ما dysregulated إشارات كيناز في الخليج للحاسبات الآلية، بما في ذلك مجموعات فرعية من الأورام مع التضخيم أو الطفرات تفعيل في البشرة عامل النمو مستقبلات (EGFR)، ويزيد في صفائح الدم المستمدة عامل النمو مستقبلات (PDGFR) يشير، وزيادة الفوسفاتيديل-اينوزيتول 3 كيناز (PI3K) و ورم دعم إشارات عائية من خلال الأوعية الدموية غشائي عامل نمو مستقبلات (VEGFR) فضلا عن غيرها من كيناز مدفوعة مسارات 4-6. الحالي في التجارب المختبرية والنماذج الحية تفقد كثيرا هذه التعديلات النيابية <سوب> 7. بالإضافة إلى ذلك، لم تقدم التنميط الجيني الفوائد المتوقعة التي قد تعكس حقيقة أن التغيرات الجينية وجينية لا يتوقع دائما التغيرات في مستوى نشاط البروتين، حيث معظم كيناز تستهدف وكلاء تعمل مباشرة، وحيث العلاجات مع آليات أخرى للعمل قد تعمل بشكل غير مباشر.

وكان خط الخلية خلد التقليدية التي يمكن passaged لا نهاية لفترة طويلة معيارا لاختبار المخدرات نظرا لسهولة الصيانة والتكاثر. ومع ذلك، هذا النموذج يعاني من بيئة نمو عالية من المغذيات (و الاصطناعي) أن يختار لسريعة النمو الخلايا التي تختلف اختلافا كبيرا عن الورم الأصلي. على هذا النحو، كان هناك اهتمام كبير في تطوير نظم نموذج أكثر واقعية تعكس نظام بيولوجي الورم أكثر تعقيدا كما هي موجودة في المريض. xenografts الورم وضعت مباشرة من الورم الرئيسي نمت في الفئران ( "xenoline،" طعم أجنبي المستمدة من المريض أو PDX). نحن نتعاملدي نظام نموذجي أكثر تعبيرا، وخاصة في تحديد علاجات السرطان، كما انهم شعروا التنبؤ بشكل موثوق النجاح السريري. 8 وعلى الرغم من علم الأحياء أكثر تعبيرا، وهذه النماذج هي مكلفة وصعبة لإنشاء وصيانة. وعلاوة على ذلك، فهي ليست قابلة للدراسات عالية الإنتاجية. الحاجة إلى تطوير أفضل النماذج البيولوجية التي تعكس بشكل أدق التغيرات الجزيئية في الأورام الأولية، والبيانات الشخصية واختبار هذه النماذج باستخدام تدابير مباشرة النشاط كيناز، لا بديل علامات وراثية، هو واضح.

ومن المعروف جيدا أن خلاف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات أحادي الطبقة، 3D أو نماذج الفحص المتعددة الخلايا يمكن أن توفر أكثر من الناحية الفسيولوجية النهاية ذات الصلة 9-11. نهج ثقافة 3D مشتركة تشمل ناقل دقيق المغلفة المصفوفة وتشكيل خلية كروي. يمكن أن تتولد الكروية الورم عن طريق تجميع الخلوي باستخدام قارورة الدوار، لوحة pHEMA ومعلقة تقنيات الهبوط. القيود لروتشمل النهج ذات المناظر: عدم قدرة بعض الخلايا لتشكيل الأجسام الشبه الكروية مستقرة، وتقلب في النمو والتحديات مع أنواع الخلايا المختلطة. بدلا من ذلك، فإن العديد من الاصطناعية (هيدروجيل البوليمر) والحيوانات تستمد Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) مصفوفة من الأورام اللحمية الماوس، والكولاجين البقري) تم وضع مصفوفات للثقافة 3D يدرس 12-14. يستخدم الماوس الصحة والسلامة مصفوفة على نطاق واسع ولكن المعروف لتعزيز نمو الخلايا والتمايز في المختبر والمجراة 15.

من أجل تكرار بيولوجية الورم 3D، تم وضع نظام بايوماتريكس الإنسان الدكتور راج سينغ وآخرون. 16. والطبيعي، والنمو خالية من عامل biogel البشري يسمح السقالات الثقافة 3D (الخرز، وأقراص)، والتي تدعم زراعة طويل الأجل من أنواع خلايا متعددة. وتنشأ سلسلة من 3D التصاميم الثقافة biogel البشري لدراسة نمو الورم، التصاق، الأوعية الدموية والغزو خصائص. مزايا وخصائص biogel البشري بالمقارنة مع شيوعا وتتلخص المواد الهلامية الماوس الصحة والسلامة في الجدول 1 والجدول 2.

مصدر: Amnions الإنسان (الأنسجة المجمعة)
خالية من مسببات الأمراض، الاتحاد الدولي للرجبي معفاة / وافق
طبيعة ECM: غير التشويه والتحريف Biogel (GLP-الإنتاج)
مفتاح
المكونات:
العقيد-I (38٪)، Laminin (22٪)، العقيد-IV (20٪)، العقيد-III (7٪)، Entactin وHSPG (<3٪)
خالية من GF: غير قابل للكشف EGF، جمعية جيل المستقبل، TGF، VEGF، PDGF (غير للعائية، غير سامة)

الجدول 1: خصائص Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة.

TH-next.within صفحة = "دائما">
Biogel البشري المواد الهلامية الصحة والسلامة
مصفوفة الإنسان الطبيعية إعادة تشكيل مصفوفة الماوس
نمو الخلايا التي تسيطر عليها والتمايز يمكن أن تعزز نمو الخلايا والتمايز
التعبير الجيني فيزيولوجي التعبير الجيني متغير
نموذج الثقافة مثل الأنسجة 3D نموذج الثقافة القائمة على لوحة

الجدول 2: مزايا Biogel الإنسان بالمقارنة مع الصحة والسلامة هلام المشتركة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم إنجاز جميع التقييمات العلاج طعم أجنبي باستخدام نموذج ورم مثلي لورم أرومي على بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. عزل خلايا GBM طعم أجنبي المستمدة من المريض

  1. إعداد الكواشف
    1. إعادة تشكل كولاجيناز-I في الماء المعقم إلى تركيز 5 ملغ / مل مرشح ومعقمة. متجر في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية (التركيز النهائي هو 50 ميكروغرام / مل في 100 مل من محلول أنزيم).
    2. حل 100 ميكروغرام البشرة عامل النمو (EGF) في 2 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن في 100 ميكرولتر (5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل.
    3. حل 100 ميكروغرام جمعية جيل المستقبل-β في 2 مل العقيمة برنامج تلفزيوني. مخزن في 100 ميكرولتر (5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل.
    4. إضافة زجاجة التالية إلى 500 واحد مل من Neurobasal ميدالجيش العراقي (مصرف مولدوفا الوطني) لإعداد كامل NBM: 10 مل B-27 ملحق بدون فيتامين A، 5 مل ملحق N2، 100 ميكرولتر EGF، 100 ميكرولتر الخلايا الليفية عامل النمو (جمعية جيل المستقبل) -Basic، 5 مل الأمفوتريسين B، 0.5 مل الجنتاميسين، 5 مل لام الجلوتامين.
    5. يعد حل انزيم جديدة من خلال الجمع بين: 98.5 مل PBS، 1 مل كولاجيناز-1، و 0.5 مل 10X التربسين / EDTA وتعقيم عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرون فلتر المسام.
    6. إعداد أو الحصول على وحدة تخزين صغيرة العقيمة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) / F12 زراعة الخلايا المتوسطة مع 7٪ مصل بقري جنيني (FBS) وبرنامج تلفزيوني 1X بدون الكالسيوم أو المغنسيوم.
  2. ورم تبويب
    ملاحظة: Athymic الماوس نو / نو حقن سابقا مع الخلايا السرطانية في الجهة اليمنى وسمح لمن كتلة الورم واضح هو ضروري لهذا الإجراء. في الأمثلة المعروضة هنا، كنا طعم أجنبي خلايا GBM المشتقة من المريض، JX10 وJX12 17.
    1. تعقيم منطقة العمل عن طريق الرش 2٪ بالكلورهيكسيدين واقامة منطقة عمل خفة دمح الأدوات اللازمة / لوازم بما في ذلك تشاك القابل للتصرف، ملقط، مشرط، والزجاج طبق بيتري، حل الانزيم، في برنامج تلفزيوني، والكلورهيكسيدين (انظر الشكل 2A).
    2. الموت ببطء الماوس / الفئران إيواء ورم الجناح. تهدف لمعدل 20٪ النزوح / دقيقة من CO 2 باستخدام 30٪ CO 2. بعد يظهر الماوس توقف التنفس، والحفاظ على CO 2 تدفق لمدة 1 دقيقة (عادة 3 دقائق المجموع). تتم إزالة الفئران من الغرفة ويتم تنفيذ خلع عنق الرحم تأكيدا القتل الرحيم الثانوي. رش الحيوان مع 3٪ بالكلورهيكسيدين لتطهير الجلد.
    3. في حين عقد الماوس ثابتة، وجعل شبه دائري شق الجلد ~ 1.5 سم من كتلة الورم (الجناح زرع الورم) باستخدام مشرط القابل للتصرف العقيمة مع # 11 شفرة بداية الجمجمة لكتلة الورم وعمل قطع نحو بطن الماوس وحولها إلى نهاية الذيلية.
    4. تعكس الجلد فوق كتلة الورم باستخدام الأصابع مع الجر لطيف على نهاية الذيلية من شق ومن ثم دفع على الجلدالسطح من أجل رفع الورم لديهم أفضل الوصول دون لمس الورم (انظر الشكل 2B).
    5. استخدام تشريح حادة مع ملقط لبلطف حرة كتلة الورم من جدار البريتوني ومن الجلد (انظر الشكل 2C).
    6. نقل كتلة الورم مع ملقط لزجاجي معقم طبق بتري (لا تستخدم أطباق بلاستيكية لمنع كسر أثناء تنميق) وصحيح تجاهل الذبيحة وتضع هذه الصكوك جانبا.
    7. استخدام مجموعة جديدة من الأدوات المعقمة (مشرط مع # 11 شفرة، ملقط شبه المنحنية) لينضر أنسجة الورم من الأنسجة الميتة والمضيف غشائي النسيج الضام الذي يغطي الورم.
    8. وضع حل 15 مل الانزيم في العقيمة تنفيس trypsinizing قارورة بقضيب وتبدأ اثارة ببطء في غطاء محرك السيارة.
    9. في كوب طبق بتري معقمة، وغسل الأورام حصادها 3-5 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة الدم الزائد (قد صب أو استخدام حقنة لشطف لهم مع PBS). إمالة بلطف طبق والماصة أو نضح المواد غسل. اللحم المفروم وinely باستخدام اثنين من ريش # 11 مشرط (انظر الشكل 2D).
    10. إضافة 14 مل من محلول أنزيم إلى ورم المفروم والماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات. قارورة نقل الخليط لtrypsinizing تنفيس ويحرك ببطء لمدة 20 دقيقة. إعداد 5 50 أنابيب مخروطية مل بإضافة 1.5 مل FBS إلى كل من أجل تحييد التربسين في الخطوة 1.2.11.
    11. بعد 20 دقيقة، وجمع 14 مل من محلول خلية من trypsinizing قارورة وإضافة إلى أنبوب واحد مع FBS. إضافة محلول أنزيم 14 مل جديدة لقارورة ويستمر التحريك.
    12. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في 150 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. إضافة 45 مل من اكتمال NBM لبيليه، مزيج بلطف، وتكرار الطرد المركزي لشطف من المصل. اعادة تعليق بيليه في 5ML NBM كاملة وعقد على الجليد.
    13. خطوات الحصاد خلية كرر ما مجموعه 5 مواسم الحصاد، والجمع بين كل الخلايا التي تحصد في أنبوب مخروطي الشكل واحد على الجليد.
    14. وضع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على رأس 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. الإعدادية رانه الخلية مصفاة عن طريق تمرير 10 مل من DMEM / F12 + 7٪ FBS من خلال وثم غسل مع 10 مل برنامج تلفزيوني.
    15. ببطء إضافة تعليق الخلية إلى مصفاة، والسماح لها بالتنقيط من خلال (انظر الشكل 2M). رفع بلطف فوق علامة التبويب للمصفاة الخلية في بين كل إضافة جديدة لكسر أي فراغ وتسمح للخلايا مع وقف التنفيذ لتمرير بحرية (انظر الشكل 2N).
    16. الطرد المركزي تعليق خلية تصفيتها على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق في 10 مل الكامل NBM والعد لتحديد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام 0.04٪ التريبان الأزرق وعدادة الكريات. عقد الخلايا على الجليد حتى الجيل microtumor.

2. الأنسجة البديلة بروتوكول تبويب

  1. الآلية dissociator الأنسجة ونظام تصنيف.
    1. وضع أنبوب التفصيل في dissociator الخلوي، حدد البرنامج "ورم _02_02" ثم اضغط على بدء وتشغيل لمدة 32 ثانية. أنبوب نقل إلى الدوار، ومكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    2. الطرد المركزي الخلايا مع وقف التنفيذ في 150 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. في حين الطرد المركزي الخلايا، وإنشاء الكواشف لمعالجة تعليق الخلية. إضافة 10 مل NBM خالية من المصل وتعليق يسحن بلطف.
    3. بعد الطرد المركزي، والحصول على بيليه الخلية التي تحتوي ~ 10-30 × 10 6 خلايا قابلة للحياة (~ 0.3 مل). إعادة تعليق بيليه في 10 مل مصل خالية NBM (انظر الشكل 2O). تحديد خلايا قابلة للحياة عن طريق فحص استبعاد (انظر الخطوة 3.2.2).

3. الجيل Microtumor

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد كامل NBM كما هو الحال في 1.1.4 وإعداد تحييد biogel عالية الكثافة البشرية (HuBiogel) (HDHG في 3 ملغ / مل) في بروتوكول الداخلي. المصفوفات biogel مماثلة يمكن أن تستخدم أيضا.
  2. Microtumor إنتاج والثقافة
    1. الحصول على خلايا PDX فصلها حديثا كما تعليق خلية واحدة في كامل NBM، على الجليد.
    2. مزيج الخلية سوspension مع حجم مساو من حل التريبان الأزرق (0.4٪ في برنامج تلفزيوني) وتحليلها باستخدام عدادة الكريات لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق 18. إزالة حجم الضروري لتوليد 50000 خلية / microtumor حيث حجم = (50000 خلية / ورم * # الأورام) / (خلية قابلة للحياة عد / 1 مل)، ووضع في أنبوب مخروطي جديدة.
    3. تركز الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 150 x ج، لمدة 8 دقائق، في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف و resuspend بيليه الخلية مع حل HDHG المثلج في نسبة النهائية من 1 خلايا جزء في FBS و 4 أجزاء HDHG.
    4. استخدام ماصة الأقنية الإلكترونية للاستغناء 10 ميكرولتر في دبوس خلية HDHG الخليط على طبق من ذهب الصلب 96-دبوس (مع طلاء مسعور) لتوليد microtumors (2 مم حبات تحتوي كل منها على 50000 الخلايا).
    5. ضع حبات الورم 3D داخل نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO مرطب) لمدة 15 دقيقة ليهلم الخرز.
    6. بعد دبق، ونقل microtumors (10 μ؛ ل) إلى غرفة الثقافة تعليق العرف (50 مل) أو طبق ثقافة حجم كبير (10 سم) التي تحتوي على كامل NBM باستخدام الإلكترونية ماصة متعدد القنوات والعرف دبوس الجهاز.
    7. بعد 1-2 أيام في الأنسجة حاضنة الثقافة، ونقل microtumors لوحات ثقافة 96-جيدا تحتوي على / جيد باستخدام الفم واسعة الاستغناء ماصة وأداء مختلف فحص وتحليل البروتوكولات 50 ميكرولتر NBM.
  3. علاج المخدرات وصيانة microtumors
    1. تحديد تركيزات النهائي لاختبار المخدرات.
      ملاحظة: إذا كانت المخدرات التي عرفها فعالية في ثقافة 2D، حدد 2X جيم 50 كما تركيز الجرعة الأوسط وحدد 3 أضعاف التخفيفات المسلسل أعلاه وأدناه للحصول على ما مجموعه 5 مستويات الجرعة. على سبيل المثال، إذا كان IC 50 هو 9 ميكرومتر للدواء في ثقافة 2D، حدد 2 ميكرومتر، 6 ميكرومتر، 18 ميكرومتر، 54 ميكرومتر، و 162 ميكرومتر كما التركيز النهائي للاختبار المخدرات.
    2. إعداد 2X حل الجرعات المخدرات في كامل NBM من sulfoxi ثنائي ميثيلدي (DMSO) الأسهم. تمييع الحل الجرعات في 1٪ المتوسطة DMSO لإعداد 5 جرعة، التخفيف المتسلسل 3 أضعاف.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من حل الجرعات إلى microtumor تحتوي على 50 ميكرولتر في لوحات فحص لتحقيق تركيز DMSO النهائي من 0.5٪. كرر كل تكرار (على سبيل المثال، 4) في كل جرعة الدواء المحددة في 3.3.1.
    4. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ترطيب الأنسجة ثقافة حاضنة ل1-14 أيام. الثقافات تغذية مرتين أسبوعيا عن طريق تحديث وسائل الإعلام وحل المخدرات على النحو الوارد أعلاه.

4. المورفولوجية وتحليل المظهري من Microtumors

  1. تحديد شكل الخلية في microtumors باستخدام معيار تلطيخ الخلية الحية.
    1. إعداد 1 الأسهم ملي من Calcein-AM في DMSO. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
    2. على فترات الثقافة المطلوبة (1 و 7 و 14 يوما)، إضافة Calcein-AM حل أعدت في برنامج تلفزيوني (بدون كا / ملغ) لوحة 96-جيدا ل1 ميكرومتر تركيز النهائي.
    3. احتضان20 دقيقة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO حاضنة ترطيب، وصورة باستخدام مجهر مضان في 2X، 4X، و10X (الإثارة: 450-490 نانومتر الفرقة المرور الانبعاثات: 515 تمريرة طويلة نانومتر، مزدوج اللون 500 نانومتر) .
  2. Microtumor النمو / انتشار الفحص
    1. حل مسحوق الإنتقالي العسكري في برنامج تلفزيوني (بدون كا / ملغ) لإعداد 12 ملي الأسهم. تصفية العقيمة، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. على فترات المطلوب الثقافة (1 و 7 و 14 يوما)، إضافة 20 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري لوحة 96-جيدا لكل 100 حجم ثقافة ميكرولتر. احتضان 2 ساعة في نسيج الثقافة الحاضنة.
    3. يعد حل تحلل جديدة من 10٪ SDS في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك وإضافة مبلغ مساو لحجم الثقافة لوحات. احتضان لوحات مغلقة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    4. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام قارئ متعدد لوحة.
  3. إعداد Microtumor لتحليل Kinomic
    1. إعداد العازلة تحلل من قبل تقشعر لها الأبدان إلى 4 درجة مئوية ثم إضافة نسبة 1: 100 كل من 100X بروبروتين الفوسفاتيز المانع (PPI) و100X بروتين مثبط البروتياز (PI). تخلط جيدا والحفاظ على الجليد.
    2. نقل 2 microtumors إلى كل من الثلاثة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إزالة طاف وإضافة 40 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على مؤشر أسعار المنتجين وPI إلى كل أنبوب وليز لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. عينات ماصة بقوة لكسر حبات الورم. أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات عينات C ومخزن في -80 درجة مئوية حتى التحليل kinomic.

5. Kinomic من التنميط Microtumors

  1. بروتين التيروزين كيناز (PTK) التنميط
    1. الكواشف ذوبان الجليد (10X البروتين كيناز (PK) العازلة و 2٪ زلال المصل البقري (BSA)) إلى 4 درجات عازلة C تحميل PK (300 ميكرولتر 10X PK المخزونات الاحتياطية في 2.7 مل درهم 2 O) في حقنة في الموقف رقم 2 على التنميط منصة.
    2. فتح برنامج حاسوبي كيناز فحص وتحميل ملف بروتوكول PTK واضغط على "ستارت"، يحشي العينات في غضون تحديثات برامج المزودهي البرنامج بعد رقائق المسح. وضع رقائق على منصة التنميط وتحميل 25 ميكرولتر من 2٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في مجموعة وثم اضغط LOAD لبدء البروتوكول التي تسيطر عليها البرنامج عرقلة الخطوة.
    3. تمييع 6 ميكرومتر من 100 ملي الأسهم ATP مع 54 ميكرولتر درهم 2 O لجعل 10 ملي أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). عندما يبدأ البرنامج في الثالث 3، وخطوة غسل النهائية (مرئية على الشاشة) جلب 15 ميكروغرام من المحللة جلبت تصل إلى 28 ميكرولتر مع DH 2 O، ومزيج إضافة إلى مجموعة.
    4. تحضير مزيج PTK الرئيسي (MM) (لمدة تصل إلى 12 عينة). إضافة 32.6 ميكرولتر درهم 2 O لإعادة dithiothreitol (DTT) وإضافة 6 ميكرولتر DTT، و 60 ميكرولتر 10X PK حل لأنبوب PTK-MM1 (تحتوي بالفعل على 60 ميكرولتر 10X BSA).
    5. انتظر حتى موجه 'تحميل' في البرنامج كيناز فحص يبدو ثم إضافة 126 ميكرولتر من PTK-MM1، 60 ميكرولتر PTK المضافة، و 60 ميكرولتر 10 ملي اعبي التنس المحترفين لMM2 (يحتوي aliquoted سابقا 4.5 ميكرولتر PY20 FITC الأجسام المضادة) وتخلط.إضافة 16 ميكرولتر من هذا المزيج سيد PTK إلى كل أنبوب المحللة عينة ومزيج ماصة 5 مرات.
    6. ضمان غطاء زجاجي نظيف ثم إضافة 35 ميكرولتر المحللة / مزيج الرئيسي لكل مجموعة، بالقرب غطاء دائري، واضغط على زر التحميل.
  2. سيرين / ثريونين كيناز (STK) التنميط:
    1. الكواشف ذوبان الجليد (10X العازلة PK، 10X STK العازلة، و 2٪ BSA) إلى 4 درجات مئوية. عازلة تحميل PK (300 ميكرولتر في 2.7 مل درهم 2 0) في موقف حقنة # 1، 1:10 و عازلة STK (300 ميكرولتر في 2.7 مل درهم 2 0) في حقنة موقف # 2.
    2. فتح كيناز فحص البرنامج برامج الكمبيوتر وتحميل ملف بروتوكول STK ثم اضغط على ستارت، يحشي العينات في غضون البرنامج بعد رقائق المسح. وضع رقائق على منصة التنميط وتحميل 25 ميكرولتر من 2٪ BSA لكل مجموعة، ثم اضغط LOAD لبدء بروتوكول منع الخطوة التي تسيطر عليها البرنامج.
    3. تمييع 6 ميكرومتر من 100 ملي اعبي التنس المحترفين مع 54 ميكرولتر درهم 2 O. خلال (3 الثالثة) مزيج الخطوة غسل النهائي2 ميكروغرام من المحللة وتقديم ما يصل الى 32.6 ميكرولتر مع DH 2 O، ومزيج إضافة إلى مجموعة.
    4. جعل STK مزيج الرئيسي: إضافة 70 ميكرولتر 10X PK لأنبوب STK-MM1 (يحتوي على 7 ميكرولتر 100X BSA)، ثم قم بإضافة 42 ميكرولتر درهم 2 O لأنبوب STK-MM1.
    5. انتظر حتى موجه "تحميل" في برنامج فحص كيناز ثم: إضافة 18 ميكرولتر 10 ملي اعبي التنس المحترفين لSTK-MM1، وإضافة 9 ميكرولتر MM1 لكل المحللة عينة. اخلط جيدا.
    6. ضمان غطاء زجاجي نظيف وإضافة 35 ميكرولتر المحللة / مزيج الرئيسي لكل مجموعة، بالقرب غطاء دائري، ثم اضغط على LOAD.
    7. خلال النهائية (3 الثالثة) غسل الخطوة إضافة الجسم المضاد الثانوي 1.05 ميكرولتر STK-FITC إلى أنبوب DMAB (يحتوي على 3.03 ميكرولتر STK مزيج الأجسام المضادة الأولية)، إضافة 39.6 ميكرولتر AB العازلة لDMAB، إضافة 356.0 ميكرولتر درهم 2 O لDMAB، إضافة 30 ميكرولتر إلى DMAB إلى كل مجموعة، ثم اضغط على LOAD .
  3. تحليل Kinomic بيانات 19،20
    1. برامج التحليل مفتوحة وتحميل صورة تحليل التطبيقات. سيlect مجلد الصور التي تحتوي على barcoded وختمها الوقت صور مجموعة كاملة من البيانات PTK أو STK، مطابقة عدد اختر المادة ملف تخطيط مجموعة (86312 لPTK و87102 لSTK)، وتحميل ولدت من قبل مجموعة الشرح الملف.
    2. تحقق gridding الصحيح لجميع الصور، وتشغيل التعرض الوقت توسيع نطاق التطبيقات. مقارنة إحصائية التعرض / منحدر log2 تحولت القيم، والتحقق من صحة مع prewash منحنيات الحركية 19-21.
    3. تشغيل المنبع التنبؤ برامج كيناز الاستعلام الشخصية kinomic المتغيرة بين شروط تحركات المنبع 22،23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد أثبتنا أن نظام الثقافة biogel 3D يدعم النمو على المدى الطويل وظيفة من أنواع خلايا متعددة. في هذا المشروع التعاوني، وتستخدم xenolines GBM المشتقة من المريض (PDX) لإنتاج مئات microtumors. كانت جزءا لا يتجزأ من الخرز biogel (2 مم) وبعد دبق سريع أنهم مثقف في مفاعل حيوي مخصصة NB-وسائل الإعلام ليس صحيحا - تنفصل الخلايا (3 × 10 5) أو neurospheres (50 40). تم تحديد الجدوى الخلوية (Calcein-AM)، لمحة النمو (الإنتقالي العسكري)، وتحليل kinomic أساس مجموعة النشاط. حافظ microtumors PDX منظمة متعددة الخلايا وقدرتها على البقاء عالية (> 80٪) ل> 3 أسابيع. ونحن نعتقد يرجع إلى صيانة 3D العمارة خلية مصفوفة (غير ممكن مع 2D أو ثقافة كروي) هذه في الجسم الحي تشبه الأحياء. ويلاحظ أيضا أن الأورام 3D يصعب إنتاج مع الهشة سقالة البروتين هلامية، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود الكولاجين أنا 14. مخطط العمل لهيئة التصنيع العسكري rotumor تتلخص الإنتاج باستخدام خلايا PDX ونظام biogel 3D في الشكل (1) ويصور عملية التفكك في الشكل 2.

من خلال تصوير الخلايا الحية عبر Calcein-AM، توصلنا إلى نمو الخلايا وقدرتها على البقاء، فضلا عن آثار المخدرات على خلايا GBM المشتقة من ورم JX10 PDX، كما يتضح من انخفاض في مضان، مما يشير إلى موت الخلية. وقد تم قياس نمو الورم في اليوم 0 و 7 و 14 لmicrotumors عرض النمو المستمر كما هو مبين في الشكل 3A. هذا microtumor، JX10، ومن المعروف أن تكون مقاومة للTMZ. عندما تتعرض ل1 - 10 ميكرومتر TMZ، لوحظ قمع نمو الحد الأدنى (الشكل 3B). ومع ذلك، واختبار الورم PDX JX12، والذي يعرف لتكون حساسة لTMZ، أظهرت حساسية من قبل MTT فحص في 14 يوما أن ما أكده Calcein-AM التصوير (الشكل 4).

er.within الصفحات = "1"> من أجل استكشاف الآليات المحتملة لمقاومة المخدرات، قمنا بقياس كيناز الإشارات في microtumors مقاومة TMZ (JX10). / تم القبض على التشكيلات Kinomic عن 144 التيروزين و 144 سيرين أهداف phosphopeptide ثريونين لDMSO و 10 ميكرومتر TMZ المعالجة microtumors. Kinomic كثافة الفسفرة لجميع الأهداف الببتيد، في كل دورة، ولكل اعتقل مرات التعرض متعددة (لا تظهر البيانات). وخريطة التمثيل اللوني تمثيلي عرض الببتيدات التي غيرت بشكل ملحوظ شدة مع 10 ميكرومتر العلاج TMZ (ع <0.05، والطلاب أونبايريد T-اختبار) يتم عرض في الشكل 5A. لمحات Kinomic التي تم تغييرها TMZ تعامل حللت microtumors JX10 باستخدام المنبع التنبؤ برامج كيناز التي حددت تحركات SYK، LCK، وCTK عن زيادة في TMZ المعالجة عينات قريبة ل DMSO (الشكل 5B). أجري تحليل سيرين / ثريونين kinome المنبع كيناز أيضا (الشكل 5C).

محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> شكل 1
الشكل 1: يتم فصل برنامج العمل للأورام Microtumor الإنتاج GBM-PDX من المضيف الفئران، وجزءا لا يتجزأ من الخلايا وحيدة في مصفوفة biogel لتشكيل microtumors. ثم يتم إجراء تحاليل microtumors. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تتم إزالة تفكك الخلايا السرطانية PDX الأورام من الفئران المضيف ومفروم قبل الاختلاط مع حل انزيم (AG): الشكل 2. يظهر التفكك بعد 40 دقيقة (H). ويرد dissociator الخلايا السرطانية (I). يظهر سحن في وسائل الإعلام والترشيح (يوحنا) مع دورة الفتشوب نهايةلتر من 0.3 بيليه مل (O) التي تحتوي على 29.5 × 10 6 خلايا قابلة للحياة (P) هذا الشكل الكروية في مصرف مولدوفا الوطني في 24 ساعة (س). شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: نمو Microtumors JX10 microtumor النمو تقاس الكثافة الضوئية (OD) من الإنتقالي العسكري وصور تمثيلية أكثر من 14 يوما، على حد سواء باسالي (A)، وردا على 1-10 ميكرومتر العلاج TMZ (B). وتظهر الصور في التكبير 4X (مقياس بار = 500 ميكرون). الانحراف المعياري المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل (4)
الشكل 4: نمو Microtumors JX12 microtumor النمو يقاس OD من الإنتقالي العسكري وصور تمثيلية أكثر من 14 يوما، على حد سواء باسالي (يوم 1)، وردا على 0 أو 1 أو 10 ميكرومتر العلاج TMZ (شريط مقياس = 500 ميكرون). الانحراف المعياري المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل (5): لمحات Kinomic من TMZ علاجها Microtumors مخطط النشاط القيم المتكاملة التعرض (log2 المنحدرات تحولت (× 100) 10، 20، 50، 100، و 200 مللي متوسط ​​إشارة ناقص خلفية القيم التعرض) يتم عرض لكبير TMZ تغيير. الببتيدات تغيير (ع <0.05). الأحمر يشير إلى زيادة، والأزرق يشير إلى انخفاض نسبة إلى DMSO يعني في الببتيد. وتمت مقارنة ملامح متغيرة TMZ باستخدام المنبع التنبؤ برامج كيناز وتحركات تغييرها. تطبيع كيناز الإحصاء (NKS) درجة> 1.0 و خصوصية درجة> 1.3 (الحمراء) تعتبر غيرت إلى حد كبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تتصل أساسا microtumor جيل، وكذلك الجرعات المخدرات والصيانة. لأن حبات microtumor هشة وممزقة بسهولة، لا بد من الحذر الشديد في كل مراحل النمو لفحص وصيانة. إذا حدث خطأ أثناء أي من هذه العمليات، والتفسير التجريبي يمكن أن يتعرض للخطر، مما تسبب في تمديد أو التكرار غير الضروري للتجارب أو حتى استبعاد البيانات.

تعديلات والمشاكل، خصوصا في عملية التنمية microtumor، تضمن تصميم وإنتاج أداة مسعور مخصصة للاستخدام مما يجعل حبات microtumor. هذه الأداة تسمح لإنتاج أسرع وأكثر دقة من microtumors. بالإضافة إلى ذلك، ساعدت تعديلات صغيرة لصيانة microtumors لتسريع عملية تغيير المتوسطة والجرعات الخلايا. العديد من هذه التعديلات شملت، لكن ليس على سبيل الحصر، وذلك باستخدام الأقنيةماصة الالكترونية لإزالة واستبدال المتوسطة من لوحات 96-جيدا وقبل خلط حلول جديدة المخدرات الجرعات وترتيب الحلول 2X في 2 لوحة مل 96-جيدا المقابلة.

تحسينات كبيرة لظروف التربية في النمذجة 3D تتضمن تحديد الجرعات المناسبة للمركبات المخدرات، كما أن هناك علاقة سيئة بين النمذجة 2D و 3D النمذجة. لذلك، التخفيفات المسلسل لإنشاء منحنى المعايرة جرعة غالبا ما يكون ضروريا لتحريك نظام نموذجي 2D إلى 3D نموذج microtumor.

وتشمل القضايا المحتملة للنظر مع الجيل microtumor من الخلايا السرطانية xenoline تحصد من الماوس التلوث الجرثومي أو الفطري، وتوافر يتعارض من xenolines الابتدائي، وخصائص النمو فريدة من نوعها في الفئران يمكن أن تنتج الاختلافات في وقت الحصاد والتباين في العوائد خلية من dissociations منفصلة. مع كل خط الخلية، وعدد من الخلايا وردت، وعلى نحو مماثل، وكم microtumors يمكن أن تنتج وايليرة لبنانية تختلف. على هذا النحو، هناك حاجة لتحديد الأولويات التي تتطلب فحوصات وتلك التي هي "اختياري" يجب أن يكون العائد microtumor غير كاف. قيود محتملة مع التنميط kinomic من microtumors تشمل صعوبة في تصحيح لخامل تحميل المواد البروتينية، كما يتم تحميل العينات بطريقة لتصحيح BCA تحديد مستويات البروتين، والتي قد لا يميز بين البروتينات biogel إلى (البروتينات ECM) وتلك التابعة لل عنصر كيناز الخلوي الذي يهدف إلى أن تقاس. قياس كتلة microtumor الجسيمة عبر Calcein-AM، أو باستخدام بروتين التدبير المنزلي كعامل تصحيح قد تخفيف هذا، على الرغم من القضايا مع مستويات البروتين التدبير المنزلي في الأورام التي غيرت ربما يحير هذا. لوقت قصير بالطبع إشارات التجارب، على افتراض متساوية الحجم (كيناز تحتوي على عدد الخلايا الحية) وإقران تعامل والعينات غير المعالجة، وهذا هو أقل من قضية.

مع هذا البحث، والهدف هو توفير المزيد من التكاليف هffective وأمراض التمثيل نموذج ما قبل السريرية لاختبار دقة العلاج الدوائي بالمقارنة مع xenografts مثلي المستمدة من المريض، والنموذج المعيار الذهبي الحالي لاختبار الخليج للحاسبات الآلية. في السنوات الأخيرة، وقد حاولت عدة مجموعات لنموذج في الجسم الحي بيئة الخليج للحاسبات الآلية لأغراض الاختبار المخدرات. وقد حاولت بعض الجماعات ببساطة لزراعة خلايا الورم الخليج للحاسبات الآلية في ظروف غير تمييز، للحفاظ على الخلايا الجذعية الخليج للحاسبات الآلية أو على الأقل ورم في المخ الشروع في الخلايا (BTIC) 24،25. هذه tumorsphere أو neurosphere الثقافات يمكن استخدامها لاختبار المخدرات والتي من المرجح متفوقة على النماذج التقليدية. ومع ذلك، لأنها لا تزال تفتقر إلى التفاعل ورم سدى التي يتم الاحتفاظ في نموذج microtumor لدينا، ونهج tumorsphere لا يزال محدودا. وقد حاولت مجموعات أخرى لتطبيق مبادئ الهندسة لتحسين نماذج GBM 26-28. وشملت هذه النهج غرف التدفق، والبروتينات ECM متغير والخلايا السرطانية / المزيج من الخلايا العادية. في حين واعدة، وكلها تقريبا من هذه الريبووقد استخدمت المحطة المذكورة خطوط الخلايا خلد مع المحاذير المذكورة سابقا. على هذا النحو، ونحن نعتقد أن هذا النموذج microtumor أساس PDX وصفها هنا هو أكثر أهمية سريريا.

في المستقبل، ونموذج microtumor يمكن أن تستخدم إما تجسيد الورم الحقيقية أو نظام "المستلفت". مع نظام المستلفت، وضعت PDX من مريض معين لا إعلام مباشرة الطبيب بخصوص العلاج الذي مريض معين، وكما هو الحال مع نظام الورم تجسد الآلهة. بدلا من ذلك، ورم المريض هو "مطابقة" لموجودة من قبل، وتتميز بشكل جيد (على حد سواء جزيئيا وظاهريا) PDX 29. والحقيقة أن هذا النموذج بمثابة الصورة الذهاب إلى 'أو يقيمون في مكتبة المستلفت باعتباره الشخصية المقارن. مع الآلهة والتقليدية، وتزايد الخلايا السرطانية للمريض في الفئران بالتوازي مع معالجة المريض ليس فقط مضيعة للوقت، لأنه قد يستغرق عدة أشهر لمرور الأساسي، ولكن أيضا مكلفة، واختبار العديد دالعلاجات سجادة في الفئران تولد سعرها الساحقة. لمكافحة هذه، وورم المريض الأساسي يمكن زرعها مباشرة في مصفوفة biogel. مع microtumors، والنتائج يمكن أن تتولد بسرعة وبتكلفة أقل.

كنموذج المستلفت، ويمكن إضافة لمحات البيانات microtumor kinome والاستجابة للدواء في المستلفت "مكتبة"، جنبا إلى جنب مع الشخصية والبيانات من 3D السابق نماذج في المختبر، PDXs القائمة، الدراسات على الحيوانات، والمرضى الآخرين، وما إلى ذلك. من الناحية النظرية، يمكن أن الخلايا السرطانية للمريض ثم يكون "omically" (genomically، kinomically، transcriptomically، الخ) مطابقة لمحة microtumor القائمة مماثل لتحديد العلاج دقيقة للحصول على أفضل النتائج الممكنة.

خلاصة القول: هنا نحدد أن هذه النماذج microtumor يمكن استخدامها لقياس كل من النمو المظهري ويمكن الاستعلام على المستويين النشاط كيناز القاعدية واستجابة للعلاج بالعقاقير التي قد تكون مفيدةكأداة متعدية لمزيد من البحوث قبل السريرية. تطوير نماذج قابلة للاختبار صالحة دقيقة، وجزيئيا للأورام الإنسان لا بد لتطوير العقاقير الفعالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R21 (PI: C. ويلي، CA185712-01)، الدماغ جائزة ورم بوغ (PD: غراي غيليسبي، P20CA 151129-03) وعقد SBIR (PI: R. سينغ، N43CO-2013-00026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359, (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10, (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15, (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5, (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17, (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16, (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20, (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4, (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3, (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12, (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111, (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9, (12), 116388 (2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103, (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10, (9), 0139267 (2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3, (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6, (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33, (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34, (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25, (4), 273-280 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics