Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos

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Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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Abstract

Introduction

Los tumores cerebrales primarios más comunes intracraneales malignos son astrocitomas de grado III y grado IV glioblastoma multiforme (glioblastoma). Estos tumores se ofrecen con peor pronóstico de supervivencia a un año de media entre 12 - 15 meses, con las terapias actuales para GBM en el 1-3 de Estados Unidos. terapias multimodales son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia que incluye temozolomida (TMZ) y agentes quinasa específica. la señalización de la quinasa con frecuencia se desregula en GBM, incluyendo subgrupos de tumores con amplificación o la activación de mutaciones en el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el aumento de crecimiento derivado de plaquetas receptor del factor de plaquetas (PDGFR) de señalización, el aumento de la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) y tumor de soporte de señalización angiogénica a través de crecimiento endotelial vascular Factor receptor (VEGFR), así como otras vías de quinasa impulsado 4-6. Current in vitro y en modelos in vivo con frecuencia pierden estas alteraciones representativos <sup> 7. Además, el perfil genético no ha ofrecido los beneficios anticipados que pueden reflejar el hecho de que los cambios genéticos y epigenéticos no siempre predicen cambios en el nivel de actividad de la proteína, donde la mayoría de quinasa agentes de direccionamiento actúan directamente, y donde las terapias con otros mecanismos de acción pueden actuar indirectamente.

La línea celular inmortalizada tradicional que puede ser pasado hasta el infinito ha sido durante mucho tiempo el estándar para las pruebas de drogas debido a su facilidad de mantenimiento y reproducibilidad. Sin embargo, este modelo sufre de un entorno de crecimiento alta de nutrientes (y artificial) que selecciona las células que se diferencian en gran medida del tumor original de rápido crecimiento. Como tal, ha habido un considerable interés en el desarrollo de sistemas de modelo más realista que reflejan un sistema biológico tumor más complejo como está presente en el paciente. xenoinjertos de tumores desarrollan directamente de un tumor primario crecido en ratones ( "xenoline," xenoinjerto derivado del paciente o PDX) provide un sistema de modelo más reflectante, en particular en el contexto de la terapéutica del cáncer, ya que se sienten de predecir de manera más fiable el éxito clínico. 8 A pesar de la biología más reflexivo, estos modelos son caros y son difíciles de establecer y mantener. Además, no son susceptibles de alto rendimiento estudios. La necesidad de desarrollar mejores modelos biológicos que reflejan con mayor precisión las alteraciones moleculares en los tumores primarios, y al perfil y probar estos modelos a través de medidas directas de la actividad quinasa, no subrogarse marcadores genéticos, está claro.

Es bien sabido que a diferencia de dos dimensiones cultivos en monocapa (2D), los modelos de ensayo multicelulares 3D o pueden proporcionar más fisiológicamente puntos finales pertinentes 9-11. cultura 3D enfoques comunes implican microvehículos recubiertos de matriz y la formación de esferoides de células. esferoides tumorales se pueden generar a través de la agregación celular usando matraz de agitación, placa pHEMA y colgando técnicas de caída. Limitaciones para tenfoques stos incluyen: la incapacidad de algunas células para formar esferoides estables, la variabilidad en el crecimiento y desafíos con los tipos de células mixtas. Alternativamente, muchos sintético (hidrogel, polímero) y animal derivados de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de ratón, colágeno bovino) matrices se han desarrollado para el cultivo 3D estudia 12-14. Matriz de ratón EHS se utiliza ampliamente pero conocido por promover el crecimiento y la diferenciación celular in vitro e in vivo 15.

Con el fin de replicar la biología del tumor 3D, un sistema de biomatriz humana fue desarrollado por el Dr. Raj Singh et al. 16. El Biogel humana sin factor natural, el crecimiento de cultivo permite andamios 3D (perlas, discos), que apoyan el cultivo a largo plazo de varios tipos de células. Se establecen una serie de diseños de cultivo Biogel humana 3D para el estudio de las propiedades del crecimiento tumoral, la adhesión, la angiogénesis y la invasión. Ventajas y propiedades de Biogel humano en comparación con comúngeles ratón EHS se resumen en la Tabla 1 y la Tabla 2.

Fuente: Amnios humano (tejido agrupado)
Libres de patógenos, IRB-exentos / aprobado
Naturaleza ECM: Biogel no desnaturalizado (GLP-producción)
Llave
componentes:
Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina y HSPG (<3%)
GF-libre: Indetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogénico, no tóxico)

Tabla 1: Propiedades de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.

Biogel humana geles de EHS
matriz humana natural matriz de ratón reconstituido
el crecimiento y la diferenciación celular controlada Puede promover el crecimiento celular y la diferenciación
la expresión de genes fisiológica la expresión de genes Variable
3D modelo de cultivo de tejido similar modelo de cultivo basado en placas

Tabla 2: Ventajas de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.

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Protocol

NOTA: Todas las evaluaciones de terapia de xenoinjertos se realizaron utilizando un modelo de tumor ortotópico para el glioblastoma en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.

1. Aislamiento de células GBM xenoinjertos derivados de los pacientes

  1. Preparación de los reactivos
    1. Re-constituir colagenasa-I en agua estéril a una concentración de 5 mg / ml de filtro y estéril. Almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C (concentración final es de 50 mg / ml en solución de enzima 100 ml).
    2. Disolver 100 g Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) en 2 ml estéril tamponada con fosfato salino (PBS). Almacenar en 100 l (5 g / 100 l) alícuotas a -20 ° C para una concentración final de 10 ng / ml.
    3. Disolver 100 g FGF-β en 2 ml de PBS estéril. Almacenar en 100 l (5 g / 100 l) alícuotas a -20 ° C para una concentración final de 10 ng / ml.
    4. Añadir la botella siguiendo a uno 500 ml de Neurobasal Medi bis (NBM) para preparar completa NBM: 10 ml B-27 suplemento sin vitamina A, 5 ml de suplemento de N2, 100 l 100 l EGF, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) Básicas, 5 ml de anfotericina B, gentamicina 0,5 ml, 5 ml L-glutamina.
    5. Preparar la solución de enzima fresco mediante la combinación de: 98,5 ml de PBS, 1 ml de colagenasa-1, 0,5 ml de 10x de tripsina / EDTA y esterilizar por filtración a través de 0,22 micras de poro de filtro.
    6. Preparar u obtener un pequeño volumen estéril de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / medio de cultivo celular F12 con 7% de suero bovino fetal (FBS) y 1 x PBS sin calcio o magnesio.
  2. La desagregación del tumor
    NOTA: atímicos ratón nu / nu previamente inyectados con células tumorales en el flanco derecho y se permite que una masa de tumor palpable es necesario para este procedimiento. En los ejemplos que se muestran aquí, hemos utilizado células GBM xenoinjertos derivados del paciente, JX10 y JX12 17.
    1. Esterilizar área de trabajo mediante pulverización clorhexidina al 2% y configurar el ingenio área de trabajoh / instrumentos necesarios suministros, incluyendo mandril desechable, pinzas, bisturí, vidrio plato Petri, solución de enzima, PBS, y clorhexidina (Véase la Figura 2A).
    2. La eutanasia de ratón / ratones que albergaban un tumor en el flanco. Apunta a una velocidad de desplazamiento / min 20% de CO 2 utilizando 30% de CO 2. Después de que el ratón muestra paro respiratorio, mantener CO 2 de flujo durante aproximadamente 1 min (típicamente 3 min total). Los ratones se retiraron de la cámara y la dislocación cervical se lleva a cabo como una confirmación de la eutanasia secundaria. Pulverizar el animal con 3% de clorhexidina para desinfectar la piel.
    3. Mientras sostiene el ratón constante, hacer incisión en la piel semicircular ~ 1,5 cm de masa tumoral (flanco implantado tumor) utilizando un bisturí estéril desechable con # 11 cuchillas comienzan craneal a la masa tumoral y la incisión hacia el vientre del ratón y en torno a la extremo caudal.
    4. Reflejar piel sobre la masa tumoral utilizando los dedos con una tracción suave sobre el extremo caudal de la incisión y luego haga clic en la piella superficie para elevar tumor para tener mejor acceso sin tocar el tumor (véase la Figura 2B).
    5. Utilice una disección roma con pinzas de masa tumoral libre de la pared peritoneal y de la piel (Ver Figura 2C) con suavidad.
    6. transferencia de masa tumoral con una pinza a vidrio estéril placa de Petri (NO use platos de plástico impide la rotura en picado) y desechar correctamente la canal y colocar estos instrumentos a un lado.
    7. Utilice un nuevo conjunto de instrumentos estériles (con bisturí # 11 cuchillas, pinzas de semi-curvas) para desbridar el tejido tumoral de tejido necrótico y anfitrión membranosa tejido conectivo que cubre tumoral.
    8. Coloque la solución 15 ml de enzima en una trypsinizing ventilado matraz estéril con una barra de agitación y comenzar a agitar lentamente en el capó.
    9. En un vaso placa de Petri estéril, lavar tumores recogidos 3 - 5 veces con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre (puede verter o utilizar jeringa para enjuagarlos con el PBS). Incline suavemente el plato y la pipeta o aspirar el material de lavado. Pique la finely usando dos hojas de bisturí # 11 (Ver Figura 2D).
    10. Añadir 14 ml de solución de enzima de tumor triturado y pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces. Transfiera la mezcla a ventila-trypsinizing frasco y agitar lentamente durante 20 minutos. Preparar 5 50 tubos cónicos ml mediante la adición de 1,5 ml a cada FBS con el fin de neutralizar la tripsina en el paso 1.2.11.
    11. Después de 20 min, recoger 14 ml de solución de células del frasco tripsinización y añadir a un tubo con FBS. Añadir solución de enzima fresca 14 ml al matraz y seguir removiendo.
    12. Centrifugar recogió células a 150 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Añadir 45 ml de NBM completa al sedimento, mezclar suavemente, y repetir la centrifugación para enjuagar el suero. Vuelva a suspender sedimento en 5 ml de NBM completa y mantener en hielo.
    13. Repita los pasos de la cosecha de células para un total de 5 cosechas, combinando todas las células cosechadas en un solo tubo cónico en hielo.
    14. Colocar un filtro de células de 40 micras en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Prep tél célula colador pasando 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS y luego a través de un lavado con 10 ml de PBS.
    15. Agregar lentamente la suspensión de células a filtro, permitiendo que gotee a través de (Ver Figura 2 M). Levantar ligeramente la lengüeta de la filtro de células entre cada nueva adición a romper cualquier vacío y permitir que las células suspendidas pasen libremente (Ver Figura 2 N).
    16. Centrifugar la suspensión celular se filtró como anteriormente. Vuelva a suspender en 10 ml completa NBM y contar para determinar el número total de células viables utilizando 0,04% de azul de tripano y un hemocitómetro. Mantenga células en hielo hasta que la generación microtumor.

2. Tejido alternativo Protocolo de desagregación

  1. Automatizada disociador de tejido y sistema de desagregación.
    1. Se coloca el tubo en el disociador desagregación celular, seleccionar el programa "Tumor _02_02" y pulse inicio y una duración de 32 seg. tubo de transferencia de los rotadores, lugar en el incubador a 37ºC durante 40 min.
    2. Centrifugar las células suspendió-a 150 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Mientras centrifugación de las células, configurar los reactivos para el procesamiento de la suspensión celular. Añadir 10 ml de NBM libre de suero y la suspensión se tritura suavemente.
    3. Después de la centrifugación, obtener un pellet de células que contiene ~ 10 - 30 x 10 6 células viables (~ 0,3 ml). Resuspendió el sedimento en 10 ml NBM libre de suero (Ver Figura 2O). Determinar las células viables por exclusión de ensayo (véase el paso 3.2.2).

3. Generación microtumor

  1. Preparación de los reactivos
    1. Preparar completa NBM como en 1.1.4 y preparar neutralizado biogel de alta densidad humana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) según el protocolo interno. matrices Biogel similares se pueden utilizar también.
  2. Microtumor Producción y Cultura
    1. PDX obtener células recién disociadas como suspensión de células individuales en completa NBM, en el hielo.
    2. Mezclar la célula suspension con un volumen igual de solución de azul de tripano (0,4% en PBS) y analizar utilizando hemocitómetro para determinar el número de células y la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano 18. Retire volumen necesario para generar 50.000 células / microtumor donde el volumen = (50.000 células / tumor * # tumores) / (recuento de células viables / 1 ml) y se coloca en un tubo cónico fresco.
    3. Concentrar las células por centrifugación a 150 xg, durante 8 min, a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con solución HDHG enfriado con hielo en una relación final de 1 células de pieza en FBS y 4 partes HDHG.
    4. Utilice una pipeta multicanal electrónica para dispensar 10 l por pin mezcla de células-HDHG sobre una placa de acero de 96 pines (con recubrimiento hidrófobo) para generar microtumores (2 mm perlas que contienen cada 50.000 células).
    5. Coloque perlas tumorales 3D dentro de la incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO 2 humidificado) durante 15 min a gelificar las perlas.
    6. Después de la gelificación, transferir los microtumores (10 μ; L) a una cámara de cultivo en suspensión a medida (50 ml) o placa de cultivo de gran volumen (10 cm) que contiene completa NBM usando la pipeta multicanal electrónica y la costumbre pin-dispositivo.
    7. Después de 1 - 2 días en una incubadora de cultivo de tejidos, transferir microtumores a placas de cultivo de 96 pocillos que contenían bien utilizando una amplia boca de dispensación de la pipeta y realizar diversos protocolos de 50 l NBM / ensayo y análisis.
  3. Tratamiento y Mantenimiento de microtumores
    1. Seleccionar concentraciones finales de las pruebas de drogas.
      NOTA: Si el fármaco ha conocido la eficacia en la cultura 2D, seleccione 2x la IC50 como la concentración de dosis media y seleccionar 3 veces diluciones seriadas arriba y abajo por un total de 5 niveles de dosis. Por ejemplo, si el IC 50 es 9 mu M para el fármaco en cultivo 2D, seleccione 2 M, 6 M, 18 mM, 54 mM y 162 mM como concentración final para las pruebas de drogas.
    2. Preparar la solución de la dosificación del fármaco 2x en completa NBM sulfoxi de dimetilode (DMSO) stock. Diluir la solución de dosificación en un medio de DMSO al 1% para preparar una dosis de 5, dilución en serie de 3 veces.
    3. Añadir 50 l de solución de dosificación a la microtumor pocillos que contiene 50 l en placas de ensayo para conseguir una concentración final de DMSO del 0,5%. Repita este procedimiento para cada réplica (por ejemplo, 4) en cada dosis de fármaco determinado en el apartado 3.3.1.
    4. Mantener los cultivos en 37 ° C, 5% de CO2, humidificado incubadora de cultivo de tejidos para 1 - 14 días. culturas de alimentación dos veces por semana mediante la actualización de los medios de comunicación y solución de fármaco como anteriormente.

4. morfológica y análisis fenotípico de microtumores

  1. Determine la morfología celular en microtumores mediante la tinción de células vivas estándar.
    1. Preparar 1 mM de calceína-AM en DMSO. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
    2. A intervalos de cultivo deseadas (1, 7 y 14 días), agregue la solución de calceína-AM preparado en PBS (sin Ca / Mg) de placa de 96 pocillos durante 1 mM concentración final.
    3. Incubar20 min en un 37 ° C, 5% de CO 2, incubador humidificado, y la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia a 2X, 4X, y 10 veces (excitación: 450 a 490 de paso de banda nm, emisión: 515 nm de largo pasa, dicroicas 500 nm) .
  2. Microtumor Crecimiento Ensayo / Proliferación
    1. Disuelva el polvo de MTT en PBS (sin Ca / Mg) para preparar de stock 12 mM. Filtro estéril, alícuota y se almacena a -20 ° C.
    2. A intervalos deseados de cultivo (1, 7, y 14 días), se añaden 20 l de solución de MTT a placa de 96 pocillos por 100 l de volumen de cultivo. Incubar 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos.
    3. Preparar la solución de lisis fresca de SDS al 10% en HCl 0,01 M y añadir una cantidad igual al volumen de cultivo de placas. Incubar las placas selladas durante la noche en 37 ° C incubadora.
    4. Leer la absorbancia a 570 nm usando un lector de placas múltiples.
  3. Microtumor preparación para el análisis Kinomic
    1. Preparar tampón de lisis por pre-refrigeración a 4 ° C y luego la adición de una proporción de 1: 100 de cada uno de 100x Proproteína fosfatasa inhibidor (PPI) y 100x proteína inhibidor de la proteasa (PI). Mezclar bien y mantener en hielo.
    2. Transfer 2 microtumores a cada uno de tres 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante y añadir 40 l de tampón de lisis que contiene PPI y PI a cada tubo y se lisan durante 30 min a 4 ° C.
    3. muestras de pipeta vigorosamente para romper los granos tumorales. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C las muestras y se almacena a -80 ° C hasta su análisis kinomic.

5. Kinomic perfiles de microtumores

  1. Proteína tirosina quinasa (PTK) de perfiles
    1. Reactivos Descongelar (10x proteína quinasa (PK) de amortiguación y 2% de albúmina de suero bovino (BSA)) a un tampón de 4 ° C de carga PK (300 l 10x PK reserva de estabilización en 2,7 ml dH 2 O) en la jeringa en la posición # 2 en el perfilado plataforma.
    2. Abra el programa de software de ensayo de quinasa y cargar el archivo de protocolo PTK y pulse "START", la anotación de las muestras dentro de softwson chips de programa después de escaneo. Coloque las fichas en la plataforma de perfiles y la carga de 25 l de 2% de albúmina sérica bovina (BSA) por matriz y luego pulse Cargar para iniciar el protocolo de software controlado por el bloqueo de paso.
    3. Diluir 6 M de ATP 100 mM con 54 l de dH2O para hacer 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP). Cuando el software se inicia la y la etapa final de lavado (visible en la pantalla) poner 15 g de lisado trajo hasta 28 l con H2O destilada, mezclar y añadir a la matriz.
    4. Preparar PTK mezcla maestra (MM) (para un máximo de 12 muestras). Añadir 32,6 l H2O destilada para reconstituir ditiotreitol (DTT) y añadir 6 l de DTT, y 60 l de 10x PK solución, al tubo de PTK-MM1 (ya contiene 60 l de 10x BSA).
    5. Espere hasta pronta "Load" en el software de ensayo de quinasa aparece a continuación, añadir 126 l de PTK-MM1, 60 l aditivo PTK, y 60 l 10 mM ATP para MM2 (contiene previamente alícuotas 4,5 l de anticuerpo PY20 FITC) y mezclar.Añadir 16 l de esta mezcla maestra PTK a cada tubo de lisado de la muestra y la mezcla de pipeta de 5 veces.
    6. Asegúrese de cubierta de vidrio es limpio y luego añadir 35 l de lisado / mezcla maestra por matriz, cierre la tapa del carrusel, y pulse el botón LOAD.
  2. Serina / treonina quinasa (STK) Profiling:
    1. Descongelar los reactivos (10x tampón PK, 10x tampón STK, y 2% de BSA) a 4 ° C. Tampón de carga PK (300 l en 2,7 ml de dH 2 0) en su posición jeringa # 1, 1:10 y tampón STK (300 l en 2,7 ml de dH 2 0) en la jeringa posición # 2.
    2. Abra el programa de computadora ensayo de quinasa y cargar el archivo de protocolo STK y pulse START, la anotación de muestras dentro del programa de exploración después de virutas. Coloque las fichas en la plataforma de carga de perfiles y 25 l de BSA al 2% por matriz, y luego pulse Cargar para iniciar el protocolo de bloqueo de paso controlado por software.
    3. Diluir 6 M de ATP 100 mM con 54 l de dH2O Durante final (3ª) mezcla etapa de lavado2 g de lisado y llevar hasta 32,6 l con H2O destilada, mezclar y añadir a la matriz.
    4. Hacer STK mezcla maestra: Añadir 70 l de 10x PK al tubo STK-MM1 (contiene 7 l 100x BSA), y luego añadir 42 l de dH2O al tubo STK-MM1.
    5. Espere hasta pronta "Load" en el software de ensayo de quinasa a continuación: Añadir 18 l de ATP 10 mM a STK-MM1, y añadir MM1 9 l de cada lisado de la muestra. Mezclar bien.
    6. Asegúrese de cubierta de vidrio es limpio y añadir 35 l de lisado / mezcla maestra por matriz, cierre la tapa del carrusel y pulse CARGA.
    7. Durante final (3ª) Lavar Paso añadir anticuerpo secundario 1,05 l STK-FITC al tubo DMAB (contiene 3,03 l STK mezcla anticuerpo primario), añadir 39,6 l AB Buffer de DMAB, agregar 356,0 l de dH2O a DMAB, añadir 30 l de DMAB para cada matriz, y pulse CARGA .
  3. Análisis de datos Kinomic 19,20
    1. El software de análisis abierto y cargar la imagen Análisis de la aplicación. Select carpeta de imágenes que contiene imágenes de la matriz entera con código de barras y con fecha y hora para PTK o STK datos, número que coincide archivo de capa del conjunto selecto artículo (86312 para PTK y 87102 para STK), y la carga generada previamente matriz anotación de archivos.
    2. Verificar la correcta grillado de todas las imágenes, y correr el tiempo de exposición Escala de aplicaciones. Comparar estadísticamente los valores log2 transformado exposición / pendiente, y validar con prelavado curvas cinéticas 19-21.
    3. Ejecutar software de predicción de quinasa aguas arriba para consultar perfiles alterados kinomic entre las condiciones para las quinasas aguas arriba 22,23.

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Representative Results

Hemos demostrado que el sistema de cultivo Biogel 3D apoya el crecimiento a largo plazo y la función de múltiples tipos de células. En este proyecto de colaboración, xenolines GBM derivadas del paciente (PDX) se utilizan para la producción de cientos de microtumores. Células disociadas (3 x 10 5) o neuroesferas (40 - 50) fueron incorporados en los granos Biogel (2 mm) y después de la gelificación rápida que se cultivan en un biorreactor de encargo NB-media llena. Se determinaron la viabilidad celular (calceína-AM), el perfil de crecimiento (MTT), y el análisis basado en la matriz de la actividad kinomic. microtumores PDX mantienen organización multicelular y alta viabilidad (> 80%) para> 3 semanas. Creemos que esta in vivo -como la biología es debido al mantenimiento de la arquitectura célula-matriz 3D (no es posible con la cultura 2D o esferoide). También se observa que los tumores 3D son difíciles de producir con frágil armazón de proteína gelatinosa, posiblemente debido a la falta de colágeno I 14. Un esquema de trabajo para el micrófonorotumor producción usando células de PDX y sistema de Biogel 3D se resume en la Figura 1 y el proceso de disociación se representa en la Figura 2.

A través de imágenes de células vivas a través de calceína-AM, se determinó el crecimiento celular y la viabilidad así como los efectos de los fármacos sobre las células GBM derivados del tumor JX10 PDX, como se indica por una disminución de la fluorescencia, lo que indica la muerte celular. El crecimiento del tumor se midió en días 0, 7 y 14 para microtumores que muestran un crecimiento continuo como se muestra en la Figura 3A. Este microtumor, JX10, es conocido por ser resistente a la TMZ. Cuando se expone a 1 - 10 mM TMZ, se observó la supresión del crecimiento mínima (Figura 3B). Sin embargo, las pruebas de tumor PDX JX12, que se sabe que es sensible a TMZ, demostró una sensibilidad por el ensayo de MTT a los 14 días que fue confirmada por calceína-AM de formación de imágenes (Figura 4).

er.within-page = "1"> Con el fin de explorar posibles mecanismos de resistencia a los medicamentos, que mide la señalización de la quinasa en las microtumores resistentes TMZ (JX10). perfiles para Kinomic 144 tirosina y serina 144 / treonina objetivos fosfopéptidos fueron capturados por DMSO y 10 mM TMZ tratados microtumores. intensidad fosforilación Kinomic para todos los objetivos de péptidos, por ciclo, y por varios tiempos de exposición fue capturado (datos no mostrados). Un mapa de calor se presentan péptidos representativos que se había alterado de manera significativa con intensidades de 10 mM tratamiento TMZ (p <0.05, los estudiantes no apareados t-test) se muestra en la Figura 5A. Kinomic perfiles que se han alterado en TMZ tratados microtumores JX10 fueron analizados utilizando el software de predicción de quinasa aguas arriba que identificó quinasas SYK, LCK, y CTK como el aumento en las muestras tratadas con TMZ en relación con DMSO (Figura 5B). Análisis de serina / treonina quinasa aguas arriba kinome también se llevó a cabo (Figura 5C).

contenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1:. Esquema de Trabajo para los tumores microtumor Producción GBM-PDX se disocian del huésped murino, y las células individuales están incrustadas en una matriz para formar Biogel microtumores. Los análisis se llevaron a cabo a continuación, en los microtumores. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. La disociación de las células tumorales Los tumores PDX se eliminan de los ratones receptores y picado antes de la mezcla con una solución de enzima (AG). La disociación se muestra después de 40 min (H). Se muestra disociador de células tumorales (I). La trituración en medios de comunicación y filtración (JN) se muestra con un resu finallt de 0,3 ml de pellets (O) que contiene 29,5 x 10 6 células viables (P) que forman esferoides en NBM en 24 hr (Q). La barra de escala es de 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Crecimiento de microtumores JX10 microtumor crecimiento medido por la densidad óptica (DO) de MTT y las imágenes representativas de más de 14 días, tanto basalmente (A), y en respuesta a 1-10 mM tratamiento TMZ (B).. Las imágenes se muestran en la magnificación de 4x (barra de escala = 500 micras). La desviación estándar se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4
Figura 4:. El crecimiento de microtumores JX12 microtumor crecimiento medido por OD de MTT y las imágenes representativas de más de 14 días, tanto basales (Día 1), y en respuesta a 0, 1, o 10 mM tratamiento TMZ (barra de escala = 500 m). La desviación estándar se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Perfiles Kinomic de TMZ trata la microtumores mapa de calor de los valores de exposición integradas (log2 laderas transformadas (x 100) de 10, 20, 50, 100 y 200 ms mediana de los valores de exposición de señal menos fondo) se muestran de manera significativa TMZ-alterada. péptidos alterados (p <0,05). El color rojo indica aumentó, y el azul indica disminución en relación con DMSO significa por péptido. perfiles alterados de TMZ se compararon mediante el software de predicción de quinasa quinasas aguas arriba y alterados. Normalizado quinasa Estadística (NKS) puntuación> 1,0 y especificidad puntuación> 1,3 (rojo) es considerado como altamente alterado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los pasos críticos en el protocolo predominantemente refieren a microtumor generación, así como la dosificación del fármaco y el mantenimiento. Debido a que las cuentas microtumor son frágiles y fácilmente desgarrado, es necesario tener cuidado extremo en ambas etapas de desarrollo de un ensayo y mantenimiento. Si se produce un error durante cualquiera de estos procesos, la interpretación experimental puede verse comprometida, provocando la extensión o la repetición innecesaria de los experimentos o incluso la exclusión de los datos.

Modificaciones y resolución de problemas, en especial del proceso de desarrollo microtumor, incluido el diseño y la producción de una herramienta personalizada hidrófobo para el uso de hacer las cuentas microtumor. Esta herramienta permite la producción más rápida y precisa de microtumores. Además, pequeñas modificaciones en el mantenimiento de las microtumores ayudaron a acelerar el proceso de cambio de medio y dosificación de las células. Varias de estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, el uso de un multicanalpipeta electrónica quitar y reemplazar medio de las placas de 96 pocillos y pre-mezcla de soluciones frescas de dosificación de la droga y la organización de las soluciones de 2x en una placa de 2 ml de 96 pocillos correspondientes.

Importantes optimizaciones para las condiciones de cultivo en el modelado 3D incluye la determinación de las dosis apropiadas para los compuestos de fármacos, ya que hay una mala relación entre el modelado 2D y modelado 3D. Por lo tanto, diluciones en serie para establecer una curva de titulación de la dosis es a menudo necesaria para mover un sistema modelo 2D al modelo microtumor 3D.

problemas potenciales a tener en cuenta con la generación de microtumor a partir de células tumorales xenoline cosechadas a partir de un ratón incluyen contaminación bacteriana o fúngica, la disponibilidad inconsistente de xenolines primarios, como propiedades de crecimiento únicos en ratones pueden producir diferencias en el tiempo de la cosecha y la varianza de los rendimientos celulares de disociaciones separadas. Con cada línea celular, el número de células recibidas y wi de manera similar, el número de microtumores se pueden producirll variar. Como tal, hay una necesidad de priorizar el que se requieren ensayos y que son "opcional" debe el rendimiento microtumor ser insuficiente. Las limitaciones potenciales con el perfilado kinomic de microtumores incluyen la dificultad en la corrección para inerte carga de material proteico, como muestras se cargan de una manera para corregir BCA determinado los niveles de proteína, que puede no distinguir entre proteínas Biogel base (proteínas ECM) y los de la quinasa componente celular que tiene por objeto que se desea medir. La medición de la masa bruta microtumor a través de calceína-AM, o el uso de una proteína de limpieza como un factor de corrección puede mitigar esto, a pesar de los problemas con los niveles de proteína en los tumores de limpieza, siendo la alteración puede confundir esto. Por corto tiempo-por supuesto experimentos de señalización, en el supuesto de igual tamaño (quinasa que contiene el número de células vivas) y par de tratados y las muestras sin tratar, esto es un problema menor.

Con esta investigación, el objetivo es proporcionar una mejor relación costo-eEFECTIVA modelo preclínico de la enfermedad y representativa para las pruebas de la terapia con medicamentos precisa en comparación con xenoinjertos ortotópico derivados del paciente, el modelo actual estándar de oro para las pruebas de GBM. En los últimos años, varios grupos han tratado de modelar el entorno in vivo GBM para propósitos de prueba de drogas. Algunos grupos han intentado simplemente para hacer crecer células tumorales GBM en condiciones no diferenciándose para preservar las células madre o células GBM al menos cerebro tumorales iniciar (BTIC) 24,25. Estos cultivos tumorsphere o de neuroesferas se pueden utilizar para pruebas de drogas y es probable superior a los modelos tradicionales. Sin embargo, puesto que todavía carecen de la interacción del tumor de estroma que se conserva en nuestro modelo microtumor, el enfoque tumorsphere es aún limitada. Otros grupos han intentado aplicar los principios de ingeniería para mejorar los modelos de GBM 26-28. Estos enfoques han incluido cámaras de flujo, proteínas ECM variables y de células tumorales / mezclas de células normales. Al tiempo que promete, casi todos estos repoRTS han utilizado células inmortalizadas líneas con las salvedades mencionadas anteriormente. Como tal, creemos que el modelo basado en microtumor PDX descrito aquí es más clínicamente relevante.

En el futuro, el modelo microtumor podría ser utilizado ya sea como un verdadero avatar tumor o un sistema 'probando'. Con el sistema de probando, la PDX desarrollado a partir de un paciente en particular no informa directamente al clínico respecto a la terapia de ese paciente específico, como con el sistema de avatar tumor. En lugar de ello, tumor de un paciente se "corresponde" a un pre-existente, bien caracterizado (tanto molecularmente y fenotípicamente) PDX 29. De hecho, este modelo podría servir como un avatar 'ir' o residir en una biblioteca probando como un perfil comparativo. Con avatares tradicionales, creciendo las células tumorales de un paciente en ratones en paralelo al tratamiento del paciente no sólo es mucho tiempo, ya que puede tomar varios meses para el paso principal, sino también costoso, ya que varias pruebas dterapias de alfombras en ratones generan una etiqueta de precio abrumadora. Para combatir esto, el tumor primario paciente puede ser implantado directamente en la matriz de Biogel. Con los microtumores, los resultados podrían ser generados de forma rápida y con un coste menor.

Como modelo probando, los perfiles de datos microtumor kinome y respuesta a los fármacos podrían añadirse en un probando "biblioteca", junto con los perfiles y datos de la previa en 3D en modelos in vitro, PDXs existentes, los estudios en animales, otros pacientes, etc. En teoría, las células tumorales del paciente podrían entonces ser "omically '(genómicamente, kinomically, transcriptomically, etc.) adaptado a un perfil existente microtumor similar para determinar el tratamiento preciso para el mejor resultado posible.

Resumen: Aquí identificamos que estos modelos microtumor pueden ser utilizados para medir tanto el crecimiento fenotípica y se pueden consultar, tanto en el nivel de actividad quinasa basal y en respuesta al tratamiento con fármacos que pueden ser útilescomo una herramienta de traslación de una mayor investigación preclínica. El desarrollo de modelos válidos comprobables precisos, y molecularmente para los tumores humanos es imprescindible para el desarrollo de fármacos eficaces.

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Acknowledgements

Apoyado por el NIH subvención R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor premio de esporas (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) y el contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013 a 00.026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

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References

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