Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

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Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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Abstract

Introduction

I intracraniche tumori cerebrali maligni primitivi più comuni sono grado astrocitomi III e IV grado glioblastoma multiforme (glioblastoma o GBM). Questi tumori offrono prognosi poveri con mediana di sopravvivenza di un anno tra i 12 - 15 mesi con le terapie correnti per GBM negli Stati Uniti 1-3. terapie multimodalità comprendono la chirurgia, radioterapia e chemioterapia compresa temozolomide (TMZ) e gli agenti chinasi mirati. segnalazione della chinasi è spesso dysregulated in GBM, tra sottogruppi di tumori con amplificazione o mutazioni attivanti nel Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), aumenti di Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) di segnalazione, una maggiore fosfatidil-inositolo-3-chinasi (PI3K) e tumore sostenere segnalazione angiogenico attraverso Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR), così come altre chinasi guidato percorsi 4-6. Attuale in vitro e in vivo perdono spesso queste alterazioni rappresentativi <sup> 7. Inoltre, profilo genetico non ha offerto i benefici attesi che può riflettere il fatto che i cambiamenti genetici ed epigenetici non sempre prevedere i cambiamenti a livello di attività della proteina, dove la maggior parte chinasi agenti di targeting agiscono direttamente, e dove le terapie con altri meccanismi d'azione possono agire indirettamente.

La linea tradizionale di cellule immortalato che possono essere diversi passaggi all'infinito è stata a lungo lo standard per test anti-droga a causa della loro facilità di manutenzione e riproducibilità. Tuttavia, questo modello soffre di un ambiente di crescita elevato di nutrienti (e artificiale) che seleziona per le cellule che si differenziano notevolmente dal tumore originale in rapida crescita. Come tale, c'è stato un considerevole interesse nello sviluppo di sistemi modello più realistici che riflettono un sistema biologico tumore più complessa in quanto è presente nel paziente. xenotrapianti tumorali sviluppato direttamente da un tumore primario cresciuto in topi ( "xenoline," xenotrapianto paziente-derivati ​​o PDX) Provide un sistema modello più riflessivo, in particolare nel contesto di terapie del cancro, come si sentono di prevedere in modo più affidabile successo clinico. 8 Nonostante la biologia più riflessivo, questi modelli sono costosi e sono difficili da stabilire e mantenere. Inoltre, non sono suscettibili di studi ad alto rendimento. La necessità di sviluppare meglio i modelli biologici che riflettono più accuratamente alterazioni molecolari dei tumori primari, e al profilo e testare questi modelli con misure dirette di attività chinasi, non surrogare marcatori genetici, è chiaro.

E 'ben noto che a differenza di due-dimensionali (2D) colture monostrato, modelli di analisi multicellulari 3D o in grado di fornire più fisiologicamente rilevanti endpoint 9-11. cultura 3D comune si avvicina coinvolgere microcarriers matrice rivestite e la formazione sferoide cellulare. sferoidi tumorali possono essere generati tramite l'aggregazione cellulare utilizzando pallone filatore, piatto pHEMA e appendere le tecniche di caduta. Limitazioni per tapprocci ueste includono: impossibilità per alcune cellule a formare sferoidi stabili, la variabilità in termini di crescita e le sfide con tipi di cellule miste. In alternativa, molti sintetico (idrogel, polimeri) e di derivazione animale Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a matrice da sarcomi del mouse, collagene bovino) matrici sono stati sviluppati per la cultura 3D studia 12-14. Matrix mouse EHS è ampiamente utilizzato, ma noto per promuovere la crescita e differenziazione cellulare in vitro e in vivo 15.

Al fine di replicare biologia tumorale 3D, un sistema biomatrice umano è stato sviluppato dal Dr. Raj Singh et al. 16. Il libero-fattore naturale, la crescita umana Biogel permette impalcature di coltura 3D (sfere, dischi), che supportano la coltivazione a lungo termine di più tipi di cellule. Una serie di disegni cultura Biogel umano 3D sono stabiliti per studiare la crescita del tumore, di adesione, l'angiogenesi e l'invasione proprietà. Vantaggi e proprietà dei Biogel umana rispetto ai comunigel del mouse EHS sono riassunti nella Tabella 1 e Tabella 2.

Fonte: Amnions umana (tessuto pool)
esenti da organismi patogeni, IRB-esenti / approvato
La natura ECM: Non denaturato Biogel (GLP-produzione)
Chiave
componenti:
Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina & HSPG (<3%)
-GF gratis: Inosservabile EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (non-angiogenico, non tossico)

Tabella 1: Proprietà dei Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.

Biogel umana gel EHS
matrice umana naturale matrice del mouse ricostituita
la crescita e la differenziazione delle cellule Controlled Può promuovere la crescita delle cellule e la differenziazione
espressione genica fisiologica l'espressione del gene variabile
modello di coltura 3D dei tessuti simili modello di coltura piastra a base di

Tabella 2: Vantaggi di Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.

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Protocol

NOTA: tutte le valutazioni di terapia xenotrapianto sono state effettuate utilizzando un modello di tumore ortotopico per glioblastoma su un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali.

1. Isolamento di cellule GBM xenotrapianto paziente-derivati

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Re-costituiscono collagenasi-I in acqua sterile ad una concentrazione di 5 mg / ml filtro e sterile. Conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C (concentrazione finale è di 50 mg / ml in 100 ml di soluzione enzimatica).
    2. Sciogliere 100 mg fattore di crescita epidermico (EGF) in 2 ml sterile fosfato-Buffered Saline (PBS). Conservare in 100 microlitri (5 mg / 100 ml) aliquote a -20 ° C per una concentrazione finale di 10 ng / ml.
    3. Sciogliere 100 mg FGF-β in 2 ml di PBS sterile. Conservare in 100 microlitri (5 mg / 100 ml) aliquote a -20 ° C per una concentrazione finale di 10 ng / ml.
    4. Aggiungere la bottiglia seguente di una 500 ml di Neurobasal MedIA (NBM) per preparare completa NBM: 10 ml B-27 supplemento senza vitamina A, 5 ml di supplemento N2, 100 ml FEG, 100 ml fibroblasti fattore di crescita (FGF) -Basic, 5 ml di amfotericina B, 0,5 ml di gentamicina, 5 ml L-glutammina.
    5. Preparare la soluzione enzimatica fresco combinando: 98,5 ml di PBS, 1 ml di collagenasi-1, 0,5 ml 10x tripsina / EDTA e sterilizzare per filtrazione con filtro 0,22 micron pori.
    6. Preparare o ottenere un piccolo volume sterile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) / terreno di coltura cellulare F12 con il 7% di siero fetale bovino (FBS) e 1x PBS senza calcio e magnesio.
  2. tumore disaggregazione
    NOTA: atimici topo nu / nu precedentemente iniettati con cellule tumorali nel fianco destro e lasciati da una massa tumorale palpabile è necessaria per questa procedura. Negli esempi mostrati qui, abbiamo usato cellule GBM xenotrapianto derivati ​​da pazienti, JX10 e JX12 17.
    1. Sterilizzare area di lavoro a spruzzo 2% clorexidina e impostare area di lavoro ingegnoh strumenti necessari / forniture tra cui Chuck usa e getta, pinze, bisturi, vetro capsula di Petri, soluzione enzimatica, PBS, e clorexidina (Vedi Figura 2A).
    2. Euthanize mouse / topo che ospitano un tumore fianco. Obiettivo per un tasso di spostamento / min 20% delle emissioni di CO 2 con il 30% di CO 2. Dopo il mouse mostra arresto respiratorio, mantenere il flusso di CO 2 per circa 1 min (in genere 3 minuti in totale). I topi vengono rimossi dalla camera e dislocazione cervicale viene eseguita come conferma eutanasia secondaria. Spruzzare l'animale con il 3% di clorexidina per disinfettare la pelle.
    3. Tenendo il mouse costante, fare semicircolare incisione cutanea ~ 1,5 cm dal massa tumorale (fianco impiantato tumore) utilizzando un bisturi sterile monouso con # 11 lama cominciano cranica alla massa tumorale e incidendo verso il ventre del mouse e intorno al fine caudale.
    4. Riflettere pelle sopra massa tumorale con le dita con una leggera trazione sulla estremità caudale dell'incisione e poi spingere sulla pellesuperficie di elevare tumore per avere migliore accesso senza toccare il tumore (vedere Figura 2B).
    5. Utilizzare smussa con una pinza a delicatamente massa tumorale libera dalla parete peritoneale e dalla pelle (vedere la figura 2C).
    6. massa tumorale di trasferimento con una pinza a vetro sterile Petri (NON usare piatti di plastica per evitare la rottura durante il tritare) e disfarsi correttamente carcassa e posizionare tali strumenti da parte.
    7. Utilizzare nuova serie di strumenti sterili (bisturi con lama # 11, pinze semi-curve) per sbrigliare tessuto tumorale del tessuto necrotico e ospite membranosa tessuto connettivo del tumore che copre.
    8. Posizionare soluzione 15 ml di enzimi in una sterile trypsinizing ventilato pallone con ancoretta e iniziare a mescolare lentamente nella cappa.
    9. In uno sterile piatto di vetro Petri, lavare i tumori raccolti 3 - 5 volte con PBS sterile per rimuovere il sangue in eccesso (può versare o usare la siringa per sciacquare loro con la PBS). inclinare leggermente piatto e pipetta o aspirare il materiale di lavaggio. Mince finely utilizzando due lame # 11 bisturi (Vedi Figura 2D).
    10. Aggiungere 14 ml di soluzione di enzima per tumore tritato e pipetta delicatamente su e giù 2 - 3 volte. miscela Trasferimento a sfiatare-trypsinizing pallone e mescolare lentamente per 20 minuti. Preparare 5 50 provette coniche ml aggiungendo 1,5 ml FBS a ciascuno al fine di neutralizzare la tripsina nel passaggio 1.2.11.
    11. Dopo 20 minuti, raccogliere 14 ml di soluzione di cellule dalla boccetta trypsinizing e aggiungere a un tubo con FBS. Aggiungere soluzione enzimatica 14 ml fresca a pallone e continuare a mescolare.
    12. Centrifugare raccolte cellule a 150 xg per 8 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Aggiungere 45 ml di completo NBM al pellet, mescolare delicatamente, e ripetere la centrifugazione di risciacquare siero. Risospendere pellet in 5 ml completa NBM e tenere sul ghiaccio.
    13. Ripetere passaggi di raccolta delle cellule per un totale di 5 raccolti, che unisce tutte le cellule raccolte in un unico tubo conico in ghiaccio.
    14. Inserire un filtro cella 40 micron sulla parte superiore di un tubo conico 50 ml. Prep tegli cella filtro facendo passare 10 ml di DMEM / F12 + 7% FBS attraverso e poi lavate con 10 ml di PBS.
    15. Aggiungere lentamente sospensione cellulare al colino, permettendo così di gocciolare attraverso (Vedi Figura 2M). Sollevare delicatamente la linguetta del filtro cella tra ogni nuova aggiunta a rompere qualsiasi vuoto e permettono alle cellule in sospensione di passare liberamente (vedi Figura 2N).
    16. Centrifugare la sospensione cellulare filtrato come sopra. Risospendere in 10 ml completa NBM e contare fino a determinare il numero totale di cellule vitali che utilizzano 0,04% trypan blu e un emocitometro. Mantenere le cellule in ghiaccio fino generazione microtumor.

2. Tessuto alternativo disaggregazione protocollo

  1. Automatizzata dissociatore tessuti e sistema di disaggregazione.
    1. Posizionare il tubo di disaggregazione nella dissociatore cellulare, selezionare il programma "Tumor _02_02" e premere start e correre per 32 sec. tubo di trasferimento per Rotator, posto nel 37 ° C incubatore per 40 min.
    2. Centrifugare cellule sospese-a 150 xg per 8 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Mentre centrifugazione le cellule, impostare reagenti per il trattamento della sospensione cellulare. Aggiungere 10 ml NBM privo di siero e la sospensione delicatamente triturare.
    3. Dopo la centrifugazione, ottenere un pellet di cellule che contiene ~ 10 - 30 x 10 6 cellule vitali (~ 0,3 ml). Risospeso il pellet in 10 ml di NBM privo di siero (vedere la figura 2O). Determinare le cellule vitali mediante test di esclusione (vedi punto 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare completa NBM come in 1.1.4 e preparare neutralizzato alta densità biogel umana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) per protocollo interno. Simili matrici Biogel può essere utilizzato come bene.
  2. Microtumor Produzione e Cultura
    1. Ottenere cellule PDX appena dissociate la sospensione singola cella in completa NBM, sul ghiaccio.
    2. Mescolare il cellulare suspension con un uguale volume di soluzione trypan blu (0,4% in PBS) e analizzare utilizzando emocitometro per determinare il numero di cellule e la vitalità con esclusione trypan blu 18. Rimuovere il volume necessario per generare 50.000 cellule / microtumor dove il volume = (50.000 cellule / tumore * # tumori) / (numero di cellule vitali / 1 ml) e posto in una nuova provetta conica.
    3. Concentrare le cellule per centrifugazione a 150 xg per 8 minuti, a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con la soluzione HDHG ghiacciata in un rapporto finale di 1 cellule parte di FBS e 4 parti HDHG.
    4. Utilizzare una pipetta multicanale elettronica per erogare 10 ml per miscela di cellule-HDHG pin su una piastra in acciaio 96-pin (con rivestimento idrofobo) per generare microtumors (perle di 2 mm ciascuno contenente 50.000 cellule).
    5. Posizionare perline tumorali 3D all'interno di coltura tissutale incubatore (37 ° C, 5% di CO 2, umidificata) per 15 minuti per gelate le perline.
    6. Dopo gelificazione, trasferire i microtumors (10 μ; L) ad una camera di coltura in sospensione personalizzati (50 ml) o grande piatto di coltura di volume (10 cm) contenenti completa NBM usando la pipetta multicanale elettronico e personalizzato pin-dispositivo.
    7. Dopo 1 - 2 giorni nel tessuto della cultura incubatore, trasferire microtumors a piastre di coltura a 96 pozzetti contenenti / pozzetto utilizzando una vasta-bocca di erogazione pipetta ed eseguire diversi protocolli di analisi e di analisi 50 ml NBM.
  3. Il trattamento farmacologico e manutenzione di microtumors
    1. Selezionare concentrazioni finali per i test di droga.
      NOTA: Se il farmaco ha conosciuto efficacia nella cultura 2D, selezionare 2x IC 50 come la concentrazione dose intermedia e seleziona 3 volte diluizioni seriali sopra e sotto per un totale di 5 livelli di dose. Ad esempio, se la IC 50 è 9 pM per il farmaco in coltura 2D, selezionare 2 mM, 6 pM, 18 pM, 54 pM, e 162 pM come concentrazione finale per il test di droga.
    2. Preparare la soluzione di dosaggio della droga 2x in completa NBM da dimetil sulfoxide (DMSO) stock. Diluire soluzione di dosaggio in media DMSO 1% per preparare una dose di 5, diluizione in serie di 3 volte.
    3. Aggiungere 50 ml di soluzione di dosaggio al microtumor pozzetto contenente 50 ml in piastre di saggio per ottenere una concentrazione di DMSO finale di 0,5%. Ripetere l'operazione per ogni replica (ad esempio, 4) in ogni dose di droga determinato al punto 3.3.1.
    4. Mantenere le culture a 37 ° C, 5% di CO 2, umidificata tessuto cultura incubatore per 1 - 14 giorni. culture feed due volte alla settimana aggiornando i media e la soluzione di droga come sopra.

4. morfologica e analisi fenotipica di Microtumors

  1. Determinare morfologia cellulare in microtumors utilizzando standard di colorazione live-cell.
    1. Preparare 1 mM magazzino di calceina-AM in DMSO. Aliquota e conservare a -20 ° C.
    2. A intervalli cultura desiderato (1, 7 e 14 giorni), aggiungere la soluzione calceina-AM preparata in PBS (senza Ca / Mg) a piastra a 96 pozzetti per 1 micron concentrazione finale.
    3. covare20 min a 37 ° C, 5% di CO 2, incubatore umidificato, e l'immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza a 2X, 4X e 10X (eccitazione: 450-490 passa banda nm, emissione: 515 nm lungo, dicroiche 500 nm) .
  2. Microtumor crescita / proliferazione Assay
    1. Sciogliere la polvere MTT in PBS (senza Ca / Mg) per preparare 12 mm magazzino. filtro sterile, un'aliquota, e conservare a -20 ° C.
    2. A intervalli desiderati coltura (1, 7 e 14 giorni), aggiungere 20 ml di soluzione di MTT a 96 pozzetti a 100 volumi cultura microlitri. Incubare 2 ore in coltura tissutale incubatore.
    3. Preparare la soluzione lisi fresco del 10% SDS a 0,01 M HCl e aggiungere pari quantità di volume di cultura a piastre. Incubare le piastre sigillati durante la notte in 37 ° C incubatore.
    4. Leggere l'assorbanza a 570 nm con un lettore multi-piatto.
  3. Microtumor preparazione per l'analisi Kinomic
    1. Preparare tampone di lisi pre-refrigerazione a 4 ° C e quindi aggiungendo un rapporto 1: 100 di ciascun 100x ProTEIN fosfatasi inibitore (PPI) e 100x proteine ​​inibitore della proteasi (PI). Mescolare bene e tenere in ghiaccio.
    2. Trasferimento 2 microtumors a ciascuno dei tre 1,5 ml provetta. Rimuovere il surnatante e aggiungere 40 ml di tampone di lisi contenente PPI e PI a ciascuna provetta e lisi per 30 minuti a 4 ° C.
    3. campioni pipetta con forza di rompere perline tumorali. Centrifugare a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C i campioni e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi kinomic.

5. Kinomic Profiling di Microtumors

  1. Proteine ​​tirosin chinasi (PTK) profiling
    1. Reagenti Scongelare (10x Protein Kinase (PK) tampone e 2% di siero albumina bovina (BSA)) a 4 ° tampone C Carico PK (300 ml 10x PK scorta in 2,7 ml di dH 2 O) nella siringa in posizione # 2 sulla profilazione piattaforma.
    2. Aprire il programma software saggio di chinasi e caricare il file di protocollo PTK e premere 'START', annotare i campioni all'interno di softwsono programma dopo i chip di scansione. Posizionare i gettoni sulla piattaforma di profilazione e di carico di 25 ml di 2% di sieroalbumina bovina (BSA) per matrice e quindi premere LOAD per iniziare il protocollo software controllato blocco passo.
    3. Diluire 6 micron di 100 mm ATP magazzino con 54 ml dH 2 O per fare 10 mM adenosina trifosfato (ATP). Quando il software inizia il 3 °, e fase di lavaggio finale (visibile sullo schermo) portare 15 ug di lisato portato fino a 28 ml con dH 2 O, mescolare e aggiungere alla matrice.
    4. Preparare master mix PTK (MM) (per un massimo di 12 campioni). Aggiungere 32,6 ml dH 2 O per ricostituire ditiotreitolo (DTT) e aggiungere 6 ml DTT, e 60 ml 10x PK soluzione, a tubo PTK-MM1 (già contiene 60 ml 10x BSA).
    5. Attendere fino a quando prompt 'carico' nel software di analisi chinasi appare quindi aggiungere 126 ml di PTK-MM1, 60 ml additivo PTK, e 60 microlitri 10 mM ATP per MM2 (contiene precedentemente frazionato 4,5 ml PY20 FITC anticorpi) e mescolare.Aggiungere 16 ml di questo master mix PTK in ciascuna provetta lisato campione e mescolare pipetta 5 volte.
    6. Assicurarsi vetro di copertura è pulito e quindi aggiungere 35 microlitri lisato / master mix per array, chiudere il coperchio giostra, e premere il tasto LOAD.
  2. Serina / treonina chinasi (STK) Profiling:
    1. reagenti Scongelare (10x tampone PK, 10x STK tampone, e il 2% BSA) a 4 ° C. Buffer di carico PK (300 ml a 2,7 ml dH 2 0) in posizione siringa # 1, 01:10 e buffer di STK (300 ml a 2,7 ml dH 2 0) in posizione siringa # 2.
    2. Aprire il programma software per computer saggio di chinasi e caricare il file di protocollo STK e premere START, annotare i campioni all'interno del programma dopo i chip di scansione. Posizionare i gettoni sulla piattaforma di profilazione e di carico di 25 ml di 2% BSA per array, quindi premere LOAD per iniziare il protocollo di blocco passo controllato via software.
    3. Diluire 6 micron di 100 mm ATP con 54 ml dH 2 O. Durante la finale (3 °) fase di lavaggio mix2 mg di lisato e portare fino a 32,6 ml con dH 2 O, mescolare e aggiungere alla matrice.
    4. Fare STK master mix: Aggiungere 70 ml 10x PK a tubo STK-MM1 (contiene 7 ml 100x BSA), e poi aggiungere 42 ml dH 2 O a tubo STK-MM1.
    5. Attendere fino a quando prompt 'carico' nel software di analisi chinasi poi: Aggiungere 18 ml 10 mM ATP per STK-MM1, e aggiungere 9 ml MM1 ad ogni lisato campione. Mescolare bene.
    6. Assicurarsi vetro di copertura è pulito e aggiungere 35 microlitri lisato / master mix per array, chiudere il coperchio giostra, e premere LOAD.
    7. Durante la finale (3 °) fase di lavaggio aggiungere anticorpo secondario 1,05 ml STK-FITC a tubo DMAB (contiene 3,03 ml STK mix anticorpo primario), aggiungere 39,6 ml AB tampone per DMAB, aggiungere 356,0 ml dH 2 O a DMAB, aggiungere 30 ml di DMAB per ogni array, e premere LOAD .
  3. L'analisi dei dati Kinomic 19,20
    1. Aprire software di analisi e caricare l'immagine Analisi App. Senare cartella di immagini contenente immagini tutta una serie codice a barre e data e ora per la PTK o STK dati, il numero abbinato Seleziona articoli file di layout array (86312 per la PTK e 87102 per STK), e il carico generato in precedenza gamma di annotazione File.
    2. Verificare il corretto gridding di tutte le immagini, ed eseguire tempo di esposizione Scaling App. Statisticamente confrontare i valori log2 trasformato l'esposizione / pendenza, e convalidare con prelavaggio curve cinetiche 19-21.
    3. Eseguire monte software chinasi previsione per interrogare i profili kinomic alterati tra le condizioni per la chinasi a monte 22,23.

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Representative Results

Abbiamo dimostrato che il sistema cultura Biogel 3D supporta la crescita a lungo termine e la funzione di molteplici tipi di cellule. In questo progetto di collaborazione, xenolines GBM pazienti-derivato (PDX) vengono utilizzati per la produzione di centinaia di microtumors. Cellule dissociate (3 x 10 5) o neurospheres (40 - 50) sono stati incorporati in perline Biogel (2 mm) e dopo gelificazione pratica sono coltivate in un bioreattore personalizzata NB-media riempito. vitalità cellulare (calceina-AM), profilo di crescita (MTT), e l'analisi kinomic a base di serie di attività sono stati determinati. microtumors PDX mantenuto organizzazione multicellulare e ad alta redditività (> 80%) per> 3 settimane. Crediamo che questo in vivo -come biologia è dovuto alla manutenzione di architettura cellula-matrice 3D (non possibile con 2D o cultura sferoide). Si è anche osservato che i tumori 3D sono difficili da produrre con fragile impalcatura proteina gelatinosa, probabilmente a causa della mancanza di collagene I 14. Uno schema di lavoro per microfonorotumor produzione utilizzando cellule PDX e sistema biogel 3D è riassunto in Figura 1 e il processo di dissociazione è mostrata in Figura 2.

Attraverso cellule vive con calceina-AM, abbiamo determinato la crescita cellulare e la vitalità così come gli effetti dei farmaci sulle cellule GBM derivate dal PDX tumorale JX10, come indicato da una diminuzione della fluorescenza, segnalando morte cellulare. La crescita del tumore è stata misurata al giorno 0, 7 e 14 per microtumors visualizzazione crescita continua come mostrato nella Figura 3A. Questo microtumor, JX10, è noto per essere resistenti a TMZ. Se esposto a 1-10 micron TMZ, la soppressione della crescita minima è stata notata (Figura 3B). Tuttavia, il test PDX tumore JX12, che è noto per essere sensibili a TMZ, ha dimostrato sensibilità saggio MTT a 14 giorni che è stato confermato da immagini calceina-AM (Figura 4).

er.within-page = "1"> Al fine di esplorare possibili meccanismi di resistenza ai farmaci, abbiamo misurato la segnalazione chinasi nei microtumors resistenti TMZ (JX10). profili Kinomic per 144 tirosina e 144 serina / treonina obiettivi fosfopeptide sono stati catturati per DMSO e 10 micron TMZ trattati microtumors. intensità fosforilazione Kinomic per tutti i target di peptidi, per ciclo, e per di più i tempi di esposizione è stato catturato (dati non riportati). Un heatmap rappresentante la visualizzazione di peptidi che avevano alterato in modo significativo l'intensità con 10 micron trattamento con TMZ (p <0.05, gli studenti non appaiati T-test) viene visualizzato in figura 5A. Profili Kinomic che sono stati alterati in TMZ trattati microtumors JX10 sono stati analizzati utilizzando il software chinasi previsione a monte che ha individuato chinasi SYK, LCK e CTK come un aumento nella TMZ campioni trattati relativi al DMSO (Figura 5B). Analisi serina / treonina chinasi kinome a monte è stata eseguita anche (Figura 5C).

contenuti "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1:. Schema di lavoro per i tumori Microtumor produzione GBM-PDX sono dissociata dall'ospite murino, e le singole cellule sono incorporati nella matrice Biogel per formare microtumors. Le analisi vengono poi eseguite sui microtumors. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Dissociazione PDX cellule tumorali tumori vengono rimossi da topi ospitanti e macinata prima della miscelazione con la soluzione enzimatica (AG). La dissociazione è mostrato dopo 40 min (H). Dissociatore delle cellule tumorali è mostrato (I). Triturazione in media e filtrazione (JN) viene mostrata con un resu finelt di 0,3 ml pellet (O) contenente 29.5 x 10 6 cellule vitali (P) che formano sferoidi in NBM in 24 ore (Q). Barra della scala è di 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Sviluppo del Microtumors JX10 microtumor crescita misurata dalla densità ottica (OD) di MTT e immagini rappresentative oltre 14 giorni, sia basally (A), e in risposta a 1-10 mM trattamento TMZ (B).. Le immagini vengono mostrate a 4X ingrandimento (scala bar = 500 micron). Deviazione standard indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4
Figura 4:. La crescita di Microtumors JX12 microtumor crescita misurata dal diametro di MTT e immagini rappresentative più di 14 giorni, sia basale (giorno 1), e in risposta a 0, 1, o 10 micron trattamento con TMZ (bar scala = 500 micron). Deviazione standard indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Kinomic Profili di TMZ Microtumors trattata Heatmap dei valori di esposizione integrato (log2 pendici trasformati (x 100) di 10, 20, 50, 100, e 200 ms segnale meno sfondo valori di esposizione mediana) vengono visualizzati per molto TMZ-alterata. peptidi modificati (p <0,05). Il rosso indica aumentata e blu indica diminuito rispetto al DMSO significare per peptide. profili alterati di TMZ sono stati confrontati utilizzando il software chinasi previsione a monte e chinasi alterati. Normalizzato Kinase Statistica (NKS) punteggio> 1.0 e specificità punteggio> 1.3 (rosso) sono considerati altamente alterato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Passaggi critici all'interno del protocollo prevalentemente riguardano microtumor generazione, nonché il dosaggio del farmaco e manutenzione. Poiché le perle microtumor sono fragili e facilmente strappata, estrema cura è necessaria in entrambe le fasi di sviluppo di un test e manutenzione. Se si verifica un errore durante uno di questi processi, l'interpretazione sperimentale può essere compromessa, provocando l'estensione o inutili ripetizioni di esperimenti o addirittura l'esclusione dei dati.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi, in particolare del processo di sviluppo microtumor, inclusi la progettazione e la produzione di uno strumento idrofobico personalizzato per l'utilizzo di fare le perle microtumor. Questo strumento consente per la produzione più veloce e più accurata di microtumors. Inoltre, piccole modifiche alla manutenzione delle microtumors contribuito ad accelerare il processo di modifica medie e dosaggio delle cellule. Molte di queste modifiche incluse, ma non si sono limitati a, utilizzando un multicanalepipetta elettronica per rimuovere e sostituire media dalle piastre a 96 pozzetti e pre-miscelazione soluzioni fresche di droga dosaggio e organizzare le soluzioni 2x in una corrispondente 2 piastra ml 96 pozzetti.

I principali ottimizzazioni per condizioni di coltura in modellazione 3D include la determinazione di dosi appropriate per i composti di droga, in quanto vi è un parente povero tra la modellazione 2D e modellazione 3D. Pertanto, diluizioni seriali per stabilire una curva dose di titolazione è spesso necessario per lo spostamento di un sistema modello 2D al modello 3D microtumor.

Potenziali problemi da considerare con la generazione microtumor dalle cellule tumorali xenoline raccolte da un mouse comprendono la contaminazione batterica o fungina, la disponibilità incoerente di xenolines primari, come proprietà di crescita uniche nei topi possono produrre differenze di tempo di raccolta e la varianza dei rendimenti cellulari da dissociazioni separati. Con ogni linea cellulare, il numero di celle ricevute e, analogamente, quante microtumors possono essere prodotti will variare. Come tale, vi è la necessità di dare priorità che saggi sono richiesti e quali sono "optional" dovrebbe la resa microtumor essere insufficiente. Potenziali limitazioni con la profilatura kinomic del microtumors includono la difficoltà di correzione per materiale inerte carico proteico, come campioni vengono caricati in modo per correggere i livelli di proteina BCA determinato, che non può distinguere tra proteine ​​Biogel base (proteine ​​ECM) e quelli del componente chinasi cellulari che è destinato ad essere misurata. Misurazione della massa lorda microtumor via calceina-AM, o utilizzando una proteina di pulizia come un fattore di correzione può attenuare questo, anche se i problemi con i livelli di proteine ​​di pulizia nei tumori in fase alterati possono confondere questo. Per breve tempo-corso esperimenti di segnalazione, assumendo ugualmente dimensioni (chinasi contenente il numero di cellule vive) e associato trattati e campioni non trattati, questo è un problema minore.

Con questa ricerca, l'obiettivo è di fornire una più conveniente emodello preclinico ffective e la malattia-rappresentante per la prova la terapia farmacologica accurata rispetto a xenotrapianti ortotopico paziente-derivato, il modello attuale gold standard per i test GBM. Negli ultimi anni, molti gruppi hanno tentato di modellare l'ambiente in vivo GBM per scopi di test di droga. Alcuni gruppi hanno provato semplicemente a crescere le cellule tumorali GBM in condizioni di non-differenziazione di conservare le cellule staminali GBM o cellule tumorali del cervello, almeno l'avvio (BTIC) 24,25. Questi tumorsphere o neurosfere culture possono essere utilizzati per il test di droga e probabilmente superiore ai modelli tradizionali. Tuttavia, dal momento che manca ancora l'interazione tumore-stroma che è conservato nel nostro modello microtumor, l'approccio tumorsphere è ancora limitata. Altri gruppi hanno tentato di applicare i principi di ingegneria per migliorare i modelli GBM 26-28. Questi approcci hanno incluso camere a flusso, proteine ​​ECM variabili e delle cellule tumorali normali / miscele cellulari. Mentre promettendo, quasi tutti questi reports hanno usato linee cellulari immortali con i caveat citati in precedenza. Come tale, crediamo che il modello microtumor PDX-based descritto qui è più clinicamente rilevante.

In futuro, il modello microtumor potrebbe essere utilizzato sia come un vero e proprio avatar tumore o di un sistema di 'probando'. Con il sistema probando, il PDX sviluppato da un particolare paziente non informa direttamente il clinico sulla terapia di quel determinato paziente, come con il sistema del tumore avatar. Invece, tumore di un paziente è "abbinata" ad un preesistente, ben caratterizzato (sia molecolare e fenotipicamente) PDX 29. Infatti, questo modello potrebbe servire come un avatar 'go-to' o risiedere in una libreria probando come profilo comparativo. Con gli avatar tradizionali, in crescita di cellule tumorali di un paziente in topi in parallelo al trattamento del paziente non è solo in termini di tempo, in quanto potrebbe richiedere diversi mesi per il passaggio primario, ma anche costosi, come prova diverse dterapie tappeto nei topi generano un prezzo enorme. Per combattere questo, il tumore primario paziente può essere impiantata direttamente nella matrice Biogel. Con i microtumors, risultati potrebbero essere generati rapidamente e ad un costo inferiore.

Come modello probando, i profili di dati microtumor Kinome e risposta ai farmaci potrebbero essere aggiunte in un probando 'biblioteca', insieme con i profili ed i dati prima i 3D modelli in vitro, PDXs esistenti, studi su animali, altri pazienti, ecc. In teoria, le cellule tumorali del paziente potrebbero poi essere 'omically' (genomicamente, kinomically, transcriptomically, ecc), abbinato ad un simile profilo microtumor esistente per determinare il trattamento accurato per il miglior risultato possibile.

Riassunto: Qui identifichiamo che questi modelli microtumor possono essere utilizzati per misurare sia la crescita fenotipica e possono essere interrogati sia a livello di attività chinasi basale e in risposta al trattamento farmacologico che può essere utilecome strumento per ulteriori traslazionale ricerca preclinica. Lo sviluppo di modelli verificabili validi accurati, e molecolarmente per i tumori umani è di importanza fondamentale per lo sviluppo di farmaci efficaci.

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Acknowledgements

Supportato da NIH R21 concessione (PI: C. Willey, CA185712-01), Cervello premio tumore SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129-03) e il contratto SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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