Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De meest voorkomende primaire intracraniële kwaadaardige hersentumoren zijn rang III astrocytomen en graad IV glioblastoma multiforme (glioblastoma of GBM). Deze tumoren bieden slechte prognose met een mediane één-jaars overleving tussen 12-15 maanden met de huidige therapieën voor GBM in de VS 1-3. Multimodaliteit behandelingen omvatten chirurgie, bestraling en chemotherapie waaronder temozolomide (TMZ) en-kinase gerichte agenten. Kinase signalering is vaak verstoord bij GBM, waaronder subgroepen van tumoren met amplificatie of activerende mutaties in het epidermale groeifactorreceptor (EGFR), verhogingen Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) signalering, verhoogde fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) en tumor ondersteunen angiogene signalering door middel Vasculaire Endotheliale groei Factor receptor (VEGFR) en andere kinase pathways gedreven 4-6. Huidige in vitro en in vivo modellen vaak verliezen deze representatieve veranderingen <sup> 7. Daarnaast heeft genetische profielen niet aangeboden de verwachte voordelen kan het feit weerspiegelen dat genetische en epigenetische veranderingen wijzigingen niet altijd voorspellen op het niveau van eiwit activiteit, waar de meeste kinase richtende middelen direct werken, en wanneer therapieën met andere werkingsmechanismen kunnen fungeren indirect.

De traditionele geïmmortaliseerde cellijn die kan worden gepasseerd eindeloos is al lang de standaard voor drug tests om goede houdbaarheid en reproduceerbaarheid. Echter, dit model lijdt aan een hoge nutriënt (en kunstmatige) groei omgeving die kiest voor het snel groeiende cellen die sterk afwijken van de oorspronkelijke tumor. Als zodanig is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling realistischer modelsystemen die een complexere tumor biologisch systeem reflecteren zoals aanwezig in de patiënt is. Tumorxenograften direct ontwikkeld van een primaire tumor gegroeid in muizen ( "xenoline," patiënt afgeleide xenograft of PDX) provide een reflectief modelsysteem, met name in de context van kanker therapeutica, zoals zij geacht worden klinisch succes meer betrouwbare voorspelling. 8 Ondanks een reflecterende biologie, deze modellen zijn duur en zijn moeilijk vast te stellen en te onderhouden. Bovendien zijn zij niet vatbaar zijn voor high-throughput studies. De noodzaak om biologische modellen die een betere weerspiegeling van moleculaire veranderingen in de primaire tumoren, en naar het profiel en test deze modellen met behulp van directe metingen van kinase-activiteit, niet surrogaat genetische merkers beter te ontwikkelen, is duidelijk.

Het is algemeen bekend dat in tegenstelling tot tweedimensionale (2D) monolaag culturen, 3D of meercellige assay modellen kunnen meer fysiologisch bieden relevante eindpunten 9-11. Common 3D cultuur benaderingen betrekken-matrix gecoate microdragers en de vorming cel sferoïde. Bolvormige tumoren kunnen worden gegenereerd via cellulaire aggregatie met behulp van centrifugekolf, pHEMA bord en opknoping druppel technieken. Beperkingen voor teze benaderingen omvatten: de onmogelijkheid voor een aantal cellen om stabiele sferoïden, variabiliteit in de groei en uitdagingen met gemengde celtypen te vormen. Als alternatief, vele synthetische (hydrogel, polymeer) en dierlijke-afgeleide Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix van muis sarcomen, runder collageen) matrices zijn ontwikkeld voor 3D-cultuur bestudeert 12-14. Muis EHS matrix wordt uitgebreid gebruikt maar bekende celgroei en differentiatie bevorderen in vitro en in vivo 15.

Om 3D tumorbiologie repliceren, werd een menselijke biomatrix ontwikkeld door Dr. Raj Singh et al. 16. De natuurlijke, groeifactor-vrij mens Biogel maakt 3D-cultuur steigers (kralen, schijven), die op lange termijn de teelt van meerdere celtypen te ondersteunen. Een reeks 3D menselijke Biogel cultuur ontwerpen worden vastgesteld voor het bestuderen van tumorgroei, adhesie, angiogenese en invasie eigenschappen. Voordelen en eigenschappen van menselijke Biogel vergeleken met gewonemuis EHS gels worden samengevat in tabel 1 en tabel 2.

Bron: Human Amnions (Pooled weefsel)
Pathogeen-vrij, IRB-vrijgestelde / goedgekeurde
ECM natuur: Niet-gedenatureerde Biogel (GLP-productie)
sleutel
componenten:
Col-I (38%), laminine (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactine en HSPG (<3%)
GF-vrij: Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogene niet-toxisch)

Tabel 1: Eigenschappen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.

Human Biogel EHS gels
Natuurlijke menselijke matrix Opgeloste muis matrix
Gecontroleerde groei & differentiatie cel Kan bevorderen celgroei en differentiatie
Fysiologische genexpressie Variabele genexpressie
3D weefsel-achtige cultuur model -Plaat gebaseerde cultuur model

Tabel 2: Voordelen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle xenograft therapie evaluaties werden uitgevoerd met behulp van een orthotope tumor model voor glioblastoma over een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Isolatie van de patiënt afgeleide GBM Xenograft Cells

  1. Bereiding van reagentia
    1. Opnieuw vormen collagenase-I in steriel water tot een concentratie van 5 mg / ml en steriel filter. Opslag in 1 ml porties bij -20 ° C (eindconcentratie 50 ug / ml in 100 ml enzymoplossing).
    2. Oplossen 100 pg epidermale groeifactor (EGF) in 2 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren in 100 ui (5 ug / 100 ui) aliquots bij -20 ° C voor een eindconcentratie van 10 ng / ml.
    3. Oplossen 100 ug FGF-β in 2 ml steriele PBS. Bewaren in 100 ui (5 ug / 100 ui) aliquots bij -20 ° C voor een eindconcentratie van 10 ng / ml.
    4. Voeg de fles na een 500 ml Neurobasal Medbis (NBM) tot het volledig NBM bereiden: 10 ml B-27 supplement zonder vitamine A, 5 ml N2 supplement, 100 pl EGF, 100 pi fibroblast groeifactor (FGF) -Basic, 5 ml amfotericine B, 0,5 ml gentamycine, 5 ml L-glutamine.
    5. Bereid deze enzymoplossing combineren: 98,5 ml PBS, 1 ml collagenase-1, 0,5 ml 10x trypsine / EDTA en steriliseer door filtratie door 0,22 um poriën filter.
    6. Bereiden of verkrijgen van een kleine hoeveelheid steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 celkweekmedium met 7% foetaal runderserum (FBS) en 1x PBS zonder calcium of magnesium.
  2. tumor Uitsplitsing
    OPMERKING: Athymische nu / nu-muizen die eerder geïnjecteerd met tumorcellen in de rechter flank en men onder een groot tumormassa nodig voor deze procedure. In de hier getoonde voorbeelden, gebruikten we de patiënt afgeleide xenograft GBM cellen, JX10 en JX12 17.
    1. Steriliseren werkgebied door het sproeien van 2% chloorhexidine en het opzetten van het werkgebied with benodigde instrumenten / supplies waaronder wegwerp chuck, pincet, scalpel, glazen petrischaal, enzymoplossing, PBS, en chloorhexidine (zie Figuur 2A).
    2. Euthanaseren muis / muizen die een flank tumor. Streven naar een 20% / min verplaatsingssnelheid CO 2 via 30% CO2. Nadat de muis toont ademhalingsstilstand handhaven CO 2 stroom gedurende 1 min (meestal 3 min totaal). Muizen worden uit de kamer verwijderd en cervicale dislocatie wordt uitgevoerd als een secundaire bevestiging euthanasie. Spray het dier met 3% chloorhexidine aan de huid te ontsmetten.
    3. Houd de muis stabiel maken halfronde huidincisie ~ 1,5 cm van tumormassa (flank geïmplanteerde tumor) met een steriele scalpel met # 11 blad begint craniaal van de tumormassa en insnijden naar de buik van de muis en rond de caudale einde.
    4. Reflect huid over tumormassa met de vingers met zachte tractie op caudale einde van de incisie en druk op de huidoppervlak van de tumor tot beste toegang zonder het aanraken van de tumor te verhogen (zie figuur 2B).
    5. Gebruik stompe dissectie met een tang om voorzichtig vrij tumormassa van peritoneale muur en van de huid (zie figuur 2C).
    6. Transfer tumor massa met een tang om steriele glazen petrischaal (Gebruik GEEN plastic schaaltjes om te voorkomen dat het breken tijdens het fijnhakken) en op de juiste gooi karkas en leg deze instrumenten opzij.
    7. Gebruik nieuwe set steriele instrumenten (scalpel met # 11 blade, semi-gebogen pincet) om tumorweefsel van necrotisch weefsel en membraneuze gastheer bindweefsel die tumor debrideren.
    8. Plaats 15 ml enzymoplossing in een steriele geventileerde-trypsinizing fles met roerstaaf en beginnen te roeren langzaam in de kap.
    9. 5 maal met steriele PBS om overtollig bloed te verwijderen (kan gieten of gebruiken spuit om ze te spoelen met de PBS) - in een steriele glazen petrischaal, 3 wassen geoogst tumoren. Voorzichtig tilt schotel en pipet of zuig het wassen materiaal. mince finely met twee # 11 scalpel messen (zie figuur 2D).
    10. Voeg 14 ml van de enzymoplossing gehakt tumor en pipet zachtjes op en neer 2-3 keer. Transfer mengsel ontlucht-trypsinizing kolf en roer langzaam gedurende 20 min. Bereid 5 50 ml conische buizen door toevoeging van 1,5 ml FBS aan elk om de trypsine te neutraliseren stap 1.2.11.
    11. Na 20 min, laat 14 ml celoplossing van trypsinizing kolf en voeg een buis met FBS. Voeg 14 ml verse enzymoplossing aan kolf en blijf roeren.
    12. Centrifugeer cellen verzameld bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Voeg 45 ml van complete NBM aan de pellet, meng voorzichtig, en herhaal centrifugeren te spoelen serum. Re-schorten pellet in 5 ml compleet NBM en houd op ijs.
    13. Herhaal celoogst stappen voor een totaal van 5 oogsten, waarin alle geoogste cellen in een conische buis op ijs.
    14. Plaats een 40 um cel zeef bovenop een 50 ml conische buis. Prep tHij cel zeef passeren door 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS door en vervolgens wassen met 10 ml PBS.
    15. Voeg langzaam celsuspensie zeef, zodat het door middel druppelen (zie Figuur 2M). Til het lipje van de cel zeef tussen elke nieuwe toevoeging aan een vacuüm te breken en laat de gesuspendeerde cellen vrij te passeren (zie figuur 2 N).
    16. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie zoals hierboven. Resuspendeer in 10 ml compleet NBM en tel totale aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw 0,04% en een hemocytometer bepaald. Houd cellen op ijs tot microtumor generatie.

2. Alternate Tissue Aggregatieniveau Protocol

  1. Geautomatiseerde weefsel dissociator en disaggregatie systeem.
    1. Plaats de opsplitsing buis in de cellulaire dissociator, selecteert u het programma "Tumor _02_02" en druk op start en een looptijd van 32 sec. Verbindingsbuis naar rotator, plaats in de 37 ° C incubator gedurende 40 minuten.
    2. Centrifugeer cellen gesuspendeerd bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Terwijl centrifugeren van de cellen, opgericht reagentia voor de behandeling van de celsuspensie. Voeg 10 ml serum-vrij NBM en zachtjes vermaal schorsing.
    3. Na centrifugatie verkregen celpellet met een ~ 10 - 30 x 10 6 levensvatbare cellen (~ 0,3 ml). Re-schorste de pellet in 10 ml serumvrij NBM (zie figuur 2O). Bepaal de levensvatbare cellen door uitsluiting assay (zie stap 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid volledige NBM als in 1.1.4 en voor te bereiden geneutraliseerde High Density menselijk Biogel (HuBiogel) (HDHG 3 mg / ml) per interne protocol. Biogel soortgelijke matrices kunnen eveneens worden gebruikt.
  2. Microtumor Productie en Cultuur
    1. Verkrijgen net losgemaakte PDX cellen als enkele celsuspensie in volledige NBM, op ​​ijs.
    2. Meng de cel suspension met een gelijk volume van trypan blauwe oplossing (0,4% in PBS) en te gebruiken hemacytometer om het aantal cellen en de levensvatbaarheid bepaald door trypan blauw exclusie 18. Verwijderen volume moet 50.000 cellen te / microtumor waarbij volume = (50.000 cellen / tumorcel * # tumoren) / (telling van levensvatbare cellen / 1 ml) en plaats in een nieuwe conische buis.
    3. Concentreren cellen door centrifugatie bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met ijskoude HDHG oplossing in een uiteindelijke verhouding van 1 deel cellen in FBS en 4 delen HDHG.
    4. Gebruik een elektronische multichannel pipet tot 10 pl per pin cel-HDHG mengsel af te geven op een 96-pins stalen plaat (met waterafstotende coating) aan microtumors (2 mm bolletjes met elk 50.000 cellen) te genereren.
    5. Plaats 3D tumor kralen in weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 bevochtigde) gedurende 15 minuten om de kralen geleren.
    6. Na geleren, overdracht van de microtumors (10 μ, L) een aangepaste suspensiekweek kamer (50 ml) of groot volume kweekschaal (10 cm) met een totale NBM middel van een elektronische multichannel pipet en aangepaste pin-apparaat.
    7. Na 1-2 dagen in weefselkweek incubator, transfer microtumors 96 putjes die 50 pi NBM / putje met behulp van een brede mond pipet afgeven en uitvoeren van verschillende assay en analyseprotocollen.
  3. Drug Treatment en onderhoud van microtumors
    1. Selecteer eindconcentraties voor drug het testen.
      OPMERKING: Indien het geneesmiddel werkzaamheid bekend 2D cultuur, selecteert 2x het IC 50 als middelste concentratie dosis en selecteer 3-voudige seriële verdunningen en boven een totaal van 5 doses. Bijvoorbeeld, als de IC 50 is 9 pM voor het geneesmiddel in 2D cultuur, selecteert 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 pM en 162 pM als eindconcentratie voor drug testen.
    2. Bereid 2x drug dosering oplossing in volledige NBM van dimethyl sulfoxide (DMSO) voorraad. Verdun dosering oplossing in 1% DMSO medium tot een 5 dosis, 3-voudige seriële verdunning te bereiden.
    3. Voeg 50 ul van doseringsoplossing de microtumor putje met 50 pl in testplaten om een ​​uiteindelijke DMSO concentratie van 0,5% te bereiken. Herhaal dit voor elke repliceren (bijvoorbeeld 4) bij elke drug dosis bepaald in 3.3.1.
    4. Handhaaf culturen in 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 1-14 dagen. Feed culturen tweemaal per week door verfrissende media en drugs oplossing als hierboven.

4. morfologische en fenotypische analyse van Microtumors

  1. Bepaal celmorfologie in microtumors met behulp van standaard voor live-cell kleuring.
    1. Bereid 1 mM voorraad calceïne-AM in DMSO. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    2. Op gewenste tijdstippen cultuur (1, 7 en 14 dagen), voeg calceïne-AM oplossing bereid in PBS (zonder Ca / Mg) aan 96-wells plaat 1 uM eindconcentratie.
    3. Incuberen20 min in een 37 ° C, 5% CO 2 bevochtigde incubator, en het beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop op 2x, 4x, en 10X (excitatie: 450-490 nm band pass, emissie: 515 nm lange pass, Dichroic 500 nm) .
  2. Microtumor Groei / Proliferation Assay
    1. Ontbinden MTT poeder in PBS (zonder Ca / Mg) tot 12 mm in voorraad te bereiden. Steriel filter, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    2. Op gewenste tijdstippen cultuur (1, 7 en 14 dagen), voeg 20 ul MTT-oplossing aan 96-well plaat per 100 pl kweek volume. Incubeer 2 uur in weefselkweek incubator.
    3. Bereid verse lysis oplossing van 10% SDS in 0,01 M HCl en voeg gelijke hoeveelheid aan cultuur volume platen. Incubeer verzegelde platen overnacht in 37 ° C incubator.
    4. Lees absorptie bij 570 nm met behulp van een multi-plate reader.
  3. Microtumor Voorbereiding voor Kinomic Analyse
    1. Bereid lysisbuffer door vooraf koelen tot 4 ° C en daarna toevoegen van een 1: 100 verhouding van elk 100x Proeiwit fosfatase remmer (PPI) en 100x Protein proteaseremmer (PI). Meng goed en blijf op ijs.
    2. Overdracht 2 microtumors elk van de drie 1,5 ml microcentrifugebuis. Verwijder supernatant en voeg 40 ul lysisbuffer bevattende PPI en PI aan elke buis en lyse gedurende 30 min bij 4 ° C.
    3. Pipet monsters krachtig om tumor kralen te breken. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en bewaar monsters bij -80 ° C tot kinomic analyse.

5. Kinomic Profilering van Microtumors

  1. Protein Tyrosine Kinase (PTK) profilering
    1. Dooi reagens (10x eiwitkinase (PK) buffer en 2% runderserumalbumine (BSA)) naar 4 ° C Belasting PK buffer (300 pl 10x PK buffervoorraad in 2,7 ml dH 2 O) in de spuit op positie 2 op de profilering platform.
    2. Open de kinase assay software programma en het PTK protocol bestand en druk op 'START' te laden, annoteren monsters binnen softwzijn programma na het scannen chips. Plaats fiches op profilering platform en load 25 ul van 2% runderserumalbumine (BSA) per array en druk op LOAD om de software-gecontroleerde protocol blokkeert stap te beginnen.
    3. Verdun 6 micrometer van 100 mM ATP voorraad met 54 pl dH 2 O tot 10 mm adenosine trifosfaat (ATP) te maken. Wanneer de software begint het 3e en laatste wasstap (zichtbaar op het scherm) brengen 15 ug lysaat gebracht tot 28 ul met dH 2 O, mengen en toe te voegen aan array.
    4. Bereid PTK master mix (MM) (voor maximaal 12 monsters). Voeg 32,6 ul dH 2 O aan dithiothreitol reconstrueren (DTT) en voeg 6 ul DTT, en 60 ul 10x PK-oplossing, om PTK-MM1 buis (al bevat 60 pi 10x BSA).
    5. Wacht tot 'Load' prompt in het kinase assay software verschijnt en voeg dan 126 ul van PTK-MM1, 60 ul PTK additief, en 60 ui 10 mM ATP MM2 (bevat eerder in porties 4,5 ul PY20 FITC antilichaam) en meng.Voeg 16 ul van deze PTK master mix aan elk monster lysaat buisje en de pipet mix 5 keer.
    6. Zorgen voor dekking van glas is schoon en voeg dan 35 ul lysaat / master mix per array, dicht carrousel deksel en druk op de knop LOAD.
  2. Serine / Threonine kinase (STK) Profiling:
    1. Dooi reagens (10x PK buffer, 10x STK buffer en 2% BSA) tot 4 ° C. Load PK buffer (300 ul in 2,7 ml dH 2 0) in de spuit positie # 1, 1:10 en STK buffer (300 ul in 2,7 ml dH 2 0) in de spuit positie # 2.
    2. Open het kinase assay computer software programma en het STK protocol bestand en druk op START te laden, annoteren monsters binnen het programma na het scannen chips. Plaats fiches op profilering platform en load 25 ul van 2% BSA per array en druk op LOAD om de software-gecontroleerde protocol blokkeert stap te beginnen.
    3. Verdun 6 micrometer van 100 mM ATP met 54 ul dH 2 O. Tijdens het laatste (3e) wasstap mix2 ug lysaat aan tot 32,6 pl met dH 2 O, mengen en toe te voegen aan array.
    4. Maak STK master mix: Voeg 70 ul 10x PK aan STK-MM1 buis (bevat 7 pl 100x BSA), en voeg dan 42 ul dH 2 O aan STK-MM1 buis.
    5. Wacht tot 'Load' prompt in het kinase assay software vervolgens: Voeg 18 ul 10 mM ATP om STK-MM1 en voeg 9 ul MM1 aan elk monster lysaat. Goed mengen.
    6. Zorgen voor dekking van glas is schoon en voeg 35 ul lysaat / master mix per array, dicht carrousel deksel en druk op LOAD.
    7. Tijdens de finale (3e) Wash Stap add 1,05 ul STK-FITC secundaire antilichaam aan DMAB buis (bevat 3,03 ul STK primaire antilichaam mix), voeg 39,6 pl AB Buffer te DMAB, voeg 356,0 pl dH 2 O tot DMAB, voeg 30 ul aan DMAB aan elke array, en druk op LOAD .
  3. Analyse van de gegevens Kinomic 19,20
    1. Open analyse software en laad het Image Analysis App. Seteer image map met barcode en tijdstempel hele reeks foto's voor PTK of STK gegevens, selecteert u artikelnummer geëvenaard reeks layout-bestand (86.312 voor PTK en 87.102 voor STK), en de belasting eerder gegenereerde reeks annotatie File.
    2. Controleer of de juiste gridding van alle afbeeldingen en lopen Exposure Time Scaling App. Statistisch vergelijken blootstelling / helling log2 getransformeerde waarden, en bevestig met voorwas kinetische curves 19-21.
    3. Run bovenstrooms kinase voorspelling software om gewijzigde kinomic profielen tussen de voorwaarden te vragen voor de bovenstroomse kinases 22,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben laten zien dat 3D Biogel cultuur systeem ondersteunt groei op lange termijn en de functie van meerdere celtypen. In dit samenwerkingsproject, zijn patiënt afgeleid GBM xenolines (PDX) gebruikt voor de productie van honderden microtumors. Gedissocieerde cellen (3 x 10 5) of neurosferen (40 - 50) zijn ingebed in Biogel parels (2 mm) en na snelle gelering ze gekweekt in een NB-medium gevuld custom bioreactor. Cellulaire levensvatbaarheid (calceïne-AM), groeiprofiel (MTT) en kinomic activiteit array gebaseerde analyse bepaald. PDX microtumors onderhouden meercellige organisatie en een hoge levensvatbaarheid (> 80%) gedurende> 3 weken. Wij geloven dat dit in vivo-achtige biologie is te wijten aan het onderhoud van de 3D-cel-matrix architectuur (niet mogelijk met 2D of sferoïde cultuur). Ook wordt opgemerkt dat 3D tumoren zijn moeilijk te vervaardigen met breekbare gelatineachtige proteïne scaffold, mogelijk als gevolg van gebrek aan collageen I 14. Een werkende regeling voor microtumor productie behulp PDX cellen en 3D Biogel wordt samengevat in Figuur 1 en de dissociatie proces is in Figuur 2.

Door live cell imaging via calceïne-AM, bepaalden wij celgroei en levensvatbaarheid en werking van de geneesmiddelen op de GBM cellen afkomstig van de PDX tumor JX10, zoals blijkt uit een afname in fluorescentie, signalering celdood. De tumorgroei werd gemeten op dag 0, 7 en 14 voor het weergeven microtumors continue groei zoals getoond in figuur 3A. Dit microtumor, JX10, bekend resistent tegen TMZ zijn. Bij blootstelling aan 1-10 uM TMZ, werd minimale groei onderdrukking opgemerkt (Figuur 3B). Echter, testen PDX tumor JX12, waarvan bekend is gevoelig TMZ worden aangetoond gevoeligheid door MTT-bepaling bij 14 dagen die werd bevestigd door calceïne-AM imaging (figuur 4).

er.within-page = "1"> Met het oog op mogelijke mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen te ontdekken, meten we kinase signalisatie in de TMZ resistente microtumors (JX10). Kinomic profielen voor 144 tyrosine en 144 serine / threonine fosforpeptide doelstellingen werden vastgelegd voor DMSO en 10 uM TMZ behandeld microtumors. Kinomic fosforylatie intensiteit voor peptide doelen per cyclus en per meerdere belichtingstijden werd gevangen (gegevens niet getoond). Een representatieve heatmap weergeven peptiden die aanzienlijk waren veranderd intensiteiten 10 uM TMZ behandeling (p <0,05, ongepaarde student t-test) wordt weergegeven in figuur 5A. Kinomic profielen die werden veranderd TMZ behandeld JX10 microtumors werden geanalyseerd met behulp van de bovenstroomse kinase voorspelling software die Syk, LCK, en CTK kinases geïdentificeerd als verhoogd bij TMZ behandelde monsters ten opzichte van DMSO (Figuur 5B). Serine / threonine kinome bovenstroomse kinase analyse werd uitgevoerd (Figuur 5C).

content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 1
Figuur 1:. Werken Regeling Microtumor Production GBM-PDX tumoren worden gezien van de muizen gastheer, en enkele cellen zijn ingebed in Biogel matrix microtumors vormen. Analyses worden dan uitgevoerd op de microtumors. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Dissociatie van PDX tumorcellen Tumoren van host muizen verwijderd en gehakt vóór het mengen met enzymoplossing (AG). Dissociatie wordt getoond na 40 min (H). Tumorcel dissociator weergegeven (I). Trituratie in media en filtratie (JN) wordt getoond met een einde result 0,3 ml pellet (O) bevattende 29,5 x 10 6 levensvatbare cellen (P) die vorm sferoïden in NBM in 24 uur (Q). Schaal bar is 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Groei Microtumors JX10 microtumor groei door middel van optische dichtheid (OD) van MTT en representatieve beelden gedurende 14 dagen, zowel basaal (A), en in reactie op 1-10 uM TMZ behandeling (B).. De beelden worden getoond bij 4X vergroting (schaal bar = 500 pm). Standaarddeviatie aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. figuur 4
Figuur 4:. Groei Microtumors JX12 microtumor groei gemeten OD van MTT en representatieve beelden gedurende 14 dagen, zowel basaal (Dag 1), en in reactie op 0, 1 of 10 uM TMZ behandeling (schaalbalk = 500 pm). Standaarddeviatie aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Kinomic Profielen van TMZ Behandelde Microtumors Temperatuurkaart van blootstelling geïntegreerde waarden (log2 getransformeerd pistes (x 100) van 10, 20, 50, 100, en 200 ms mediane signaal minus achtergrond blootstelling) worden weergegeven aanzienlijk TMZ-gewijzigd. gewijzigde peptiden (p <0,05). Rood geeft toegenomen, en blauw geeft gedaald ten opzichte van DMSO betekenen per peptide. TMZ gewijzigde profielen werden vergeleken met de bovenstroomse kinase predictie software en veranderde kinasen. Genormaliseerde Kinase Statistiek (NKS) score> 1.0 en specificiteit score> 1.3 (rood) worden beschouwd als zeer veranderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritische stappen in het protocol voornamelijk betrekking op productie, en dosering van geneesmiddelen en onderhoud microtumor. Omdat de microtumor kralen zijn kwetsbaar en gemakkelijk gescheurd, is uiterste zorg nodig beide ontwikkelingsstadia van een test en onderhoud. Indien tijdens een van deze processen een fout optreedt, kan experimenteel interpretatie worden aangetast, waardoor verlenging of onnodige herhaling van experimenten of zelfs van gegevenssets.

Wijzigingen en het oplossen van problemen, in het bijzonder van de microtumor ontwikkelingsproces, inclusief het ontwerp en de productie van een aangepaste hydrofoob hulpmiddel voor het gebruik van het maken van de microtumor kralen. Deze tool maakt het mogelijk om sneller en nauwkeuriger productie van microtumors. Bovendien, kleine aanpassingen aan het onderhoud van de microtumors geholpen te versnellen het proces van het veranderen medium en het doseren van de cellen. Verschillende van deze modificaties omvat, maar niet beperkt tot, met een multichannelelektronische pipet verwijderen en vervangen van het medium 96-well platen en voormenging verse drug doseringsoplossingen en regelen de 2x oplossingen in een overeenkomstige 2 ml 96-well plaat.

Major optimalisaties voor kweekomstandigheden in 3D modeling omvat het bepalen van de juiste doseringen voor drug verbindingen, want er is een slechte relatie tussen 2D modellering en 3D-modellering. Daarom seriële verdunningen te stellen een dosistitratie curve is vaak nodig om een ​​2D modelsysteem om het 3D-model microtumor.

Mogelijke problemen om te overwegen met microtumor generatie van xenoline tumorcellen geoogst uit een muis omvatten bacteriële of schimmel besmetting, inconsistente beschikbaarheid van primaire xenolines, zo uniek groei eigenschappen in muizen verschillen in de oogsttijd en variantie in cel opbrengst van afzonderlijke dissociaties kan produceren. Met elke cellijn, het aantal cellen ontvangen en evenzo hoeveel microtumors kan worden geproduceerd will variëren. Als zodanig is er behoefte aan assays die prioriteit vereist en welke "optioneel" moet microtumor opbrengst ontoereikend. Mogelijke beperkingen met kinomic profilering van microtumors omvatten de moeilijkheid bij het corrigeren voor inert eiwithoudend materiaal laden als monsters zodanig worden geladen corrigeren BCA bepaald eiwitniveaus, die niet kan onderscheiden Biogel gebaseerde proteïnen (ECM eiwitten) en die van de cellulaire kinase component die zal worden gemeten. Het meten van het bruto microtumor massa via calceïne-AM, of met behulp van een housekeeping eiwit als een correctiefactor kan dit te beperken, maar problemen met de huishoudelijke eiwitgehalten in tumoren wordt veranderd kan dit verwarren. Voor korte tijdsverloop signalering experimenten, ervan uitgaande dat even grote (kinase die levende cel nummer) en gekoppeld behandelde en onbehandelde monsters, is dit minder een probleem.

Met dit onderzoek is het doel om een ​​goedkopere e biedenffectieve en ziekte-vertegenwoordiger preklinisch model voor een nauwkeurige behandeling met medicijnen testen in vergelijking met orthotope-patiënt afgeleid xenotransplantaten, de huidige gouden standaard model voor GBM testen. De laatste jaren hebben verschillende groepen geprobeerd de GBM in vivo omgeving voor dopingcontroledoeleinden modelleren. Sommige groepen hebben gewoon geprobeerd om GBM tumorcellen groeien in niet-onderscheidende omstandigheden GBM stamcellen te bewaren of op zijn minst hersentumor initiëren cellen (BTIC) 24,25. Deze tumorsphere of neurosfeerculturen kan worden gebruikt voor drug testen en zijn waarschijnlijk beter dan traditionele modellen. Aangezien zij nog niet de tumor-stroma interactie die wordt bewaard in onze microtumor model, de tumorsphere benadering is nog beperkt. Andere groepen hebben geprobeerd om technische principes toepassen op GBM modellen 26-28 te verbeteren. Deze benaderingen hebben stroom kamers, variabele ECM eiwitten en tumorcel / normale cel mengsels inbegrepen. Hoewel veelbelovend, bijna al deze reports gebruikt geïmmortaliseerde cellijnen met de eerder genoemde restricties. Daarom geloven wij dat de PDX-gebaseerde microtumor model beschreven is klinisch relevant.

In de toekomst kan het microtumor model te gebruiken als een echte tumor avatar of "proefpersoon" -systeem. Met de proband systeem, de PDX ontwikkeld van een bepaalde patiënt niet direct de arts over therapie die specifieke patiënt informeren zo de tumor avatar systeem. In plaats daarvan wordt een patiënt de tumor "gekoppeld" naar een reeds bestaande, goed gekarakteriseerde (zowel moleculair en fenotypisch) PDX 29. Inderdaad, kan dit model dienen als een 'go-to' avatar of verblijft in een proefpersoon bibliotheek als een vergelijkende profiel. Bij traditionele avatars groeiende tumorcellen van een patiënt in muizen parallel aan de behandeling van de patiënt is niet alleen tijdrovend, omdat het een aantal maanden kan duren voordat de primaire doorgang, maar ook kostbaar, het testen van verscheidene dtapijt therapieën in muizen te genereren een overweldigende prijskaartje. Om dit tegen te gaan, kan de primaire tumor patiënt direct worden geïmplanteerd in de Biogel matrix. De microtumors, kunnen resultaten snel en tegen lagere kosten worden geproduceerd.

Als een proefpersoon model, zou de microtumor kinome data profielen en drugs reactie worden toegevoegd aan een proefpersoon 'bibliotheek', samen met profielen en gegevens uit eerdere 3D in vitro modellen, bestaande PDXs, dierstudies, andere patiënten, enz. In theorie zou de tumorcellen van de patiënt dan 'omically' (genomisch, kinomically, transcriptomically, etc.) gekoppeld aan een soortgelijke bestaande microtumor profiel om nauwkeurige behandeling voor het best mogelijke resultaat te bepalen.

Samenvatting: Hier identificeren we dat deze microtumor modellen kunnen worden gebruikt om zowel fenotypische groei gemeten en kunnen worden opgevraagd zowel de basale kinaseactiviteit niveau als reactie op behandeling met geneesmiddelen die nuttig kunnen zijnals een translationeel instrument voor verder preklinisch onderzoek. Het ontwikkelen van accurate en moleculair geldig toetsbare modellen voor menselijke tumoren is noodzakelijk voor een effectieve ontwikkeling van geneesmiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Ondersteund door NIH-subsidie ​​R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), hersentumor SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) en SBIR contract (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359, (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10, (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15, (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5, (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17, (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16, (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20, (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4, (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3, (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12, (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111, (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9, (12), 116388 (2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103, (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10, (9), 0139267 (2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3, (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6, (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33, (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34, (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25, (4), 273-280 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics