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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur ​​l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

organites intestinales primaires sont un système modèle précieux qui a le potentiel d'impact significatif sur le domaine de l'immunologie des muqueuses. Cependant, la complexité des caractéristiques de croissance organoïdes portent des mises en garde importantes pour l'enquêteur. Plus précisément, les motifs de chaque individu organoïde de croissance sont très variables et à créer une population hétérogène de cellules épithéliales en culture. Avec de telles mises en garde, les pratiques de culture de tissu commun ne peuvent pas être simplement appliquées au système organoide en raison de la complexité de la structure cellulaire. Comptage et placage basée uniquement sur le nombre de cellules, ce qui est courant pour les cellules séparées individuellement, telles que des lignées cellulaires, ne sont pas une méthode fiable pour organites sauf si une technique de normalisation est appliquée. Normaliser à teneur totale en protéines est rendue complexe en raison de la matrice protéique résident. Ces caractéristiques en termes de nombre de cellules, la forme et le type de cellules devraient être prises en considération lors de l'évaluation con sécrétéetentes de la masse organoide. Ce protocole a été généré pour décrire une procédure simple pour la culture et de traiter les petites organites intestinales avec des agents pathogènes microbiens et des modèles moléculaires de pathogènes associés (PAMP). Il souligne également les techniques de normalisation qui devraient être appliquées lorsque l'analyse des protéines sont effectuées après un tel défi.

Introduction

La capacité de récolte et organites culture primaires ont été décrits pour l' intestin grêle, du côlon, du pancréas, du foie et du cerveau et sont avancées intéressantes germane à la compréhension d' un phénomène plus physiologiquement représentant pour la biologie des tissus 1-5. Les premières méthodes décrivant la culture et l' entretien des petits organites intestinale a été signalée par Sato et al. Du laboratoire de Hans Clevers 1. Avant cette méthode, la récolte et la culture des cellules épithéliales intestinales primaires se sont révélées être limitée et inefficace pour soutenir la croissance des cellules épithéliales. Ces méthodes comprennent la dissociation du tissu par incubation avec des enzymes telles que la collagénase et de la dispase, ce qui conduirait finalement à l'excroissance de cellules de fibroblastes primaires entremêlées 6. Ces conditions seraient également limitée dans le temps dans le maintien de la culture cellulaire épithéliale. Minimal à aucune niche de cellules épithéliales formeraient, comme les cellules épithéliales entreraient en raison de l'apoptosel'absence de facteurs ou de perte d'intégrité de contact croissance appropriés, appelé anokis 7. L'avènement du système de culture en 3D organoïde a fourni une méthode pour la culture des cellules intestinales primaires contenant un spectre de types de cellules intestinales en culture prolongée 1. Ces organites epitheliales ont des avantages sur les lignées de cellules étant qu'elles sont composées de plusieurs cellules différenciées, et mieux mimer l'organe qu'ils dérivent de 8 in vivo. Le processus pour finalement "pousser un mini intestin dans un plat" est avéré être un outil précieux pour évaluer la réponse de l'épithélium intestinal sous différents stimuli. Étude de l'interaction des cellules intestinales primaires avec des motifs microbiens pathogènes associés moléculaires (PAMP) est pertinente pour le domaine de l' immunologie que ces motifs moléculaires peuvent réguler les réponses diverses à la fois hôte et microbe 9. Non seulement les chercheurs peuvent explorer maintenant ces interactions avec les organites de la souris, mais ilspeut être cultivé à partir de l' homme ainsi 2. Cette technologie a le potentiel de modifier radicalement la médecine personnalisée et il est tentant de spéculer sur les progrès que cette technique rendra possible dans un avenir proche.

Le but global de ce procédé est de fournir un protocole pour la culture, l'expansion et le traitement des organites intestinaux avec une variété de stimuli. Ces stimuli peuvent finalement aller de vaccins, PAMP bactériens, des agents pathogènes vivants, gastro-intestinal (GI) et la thérapeutique du cancer. L'isolement et la culture des organites intestinale de souris a été adapté de Sato et al. Bien qu'il existe de légères déviations par rapport à la méthode originale, le produit final étant organoide culture est toujours atteint en suivant ce protocole. Cette méthode se concentre sur la description d'une technique adéquate pour la normalisation appropriée lorsque l'on travaille avec des structures de cellules non-homogènes, qui doivent être prises en considération lors de la conduite d'un essai basé sur la cellule nombre.

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Protocol

Toutes les recherches a été approuvé et mené conformément aux lignes directrices de Virginia Tech IACUC

1. Préparer R-Spondin1 Climatisation Médias De HEK293T-RSPO1 Cell Line

  1. Génération de cellules HEK293T-Rspondin1 a été décrit précédemment 10. HEK293T-graine Rspondin1 cellules sécrétant à 5-10% de confluence, soit environ 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 cellules dans un flacon T-175 avec 40 ml de milieu Eagle modifié (DMEM) 1x Dulbecco + 10% de sérum bovin fœtal ( FBS) en tant que milieu de croissance et laisser incuber à 37 ° C + 5% de CO 2.
    NOTE: Le milieu de croissance pour les cellules sécrétant HEK293T-Rspondin1 serviront de R-spondin1 milieu conditionné. R spondin1 peut être acheté en tant que variante, un facteur de croissance recombinant utilisé à une concentration finale de 500 ng / ml.
  2. Cultiver les cellules HEK293T-Rspondin1 pendant sept jours ou jusqu'à atteindre 95% de confluence déterminée par microscopie à champ lumineux. Récolter les 40 ml de milieu et de transfert conditionnés à un 50tube conique ml. Jeter le flacon T-175 de cellules sécrétant HEK293T-Rspondin1.
  3. Centrifugeuse le tube contenant un milieu conditionné à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires. Récupérer le surnageant, appelé R-spondin1 de milieu conditionné, et aliquote en tubes de 15 ml. aliquotes de conserver à -20 ° C pour le court terme ou -80 ° C pour le stockage à long terme.
    REMARQUE: les médias Une fois décongelé, le R-Spondin1 conditionné peuvent être stockés jusqu'à 1 semaine à 4 ° C.

2. Préparation de organoide croissance Milieux et réactifs pour la récolte d'intestin grêle Cryptes  

  1. Un jour avant la récolte, placer la matrice protéique congelée sur la glace et décongeler une nuit à 4 ° C. Autoclave dissection ciseaux, pinces et lames de verre qui seront utilisés pour la récolte de la crypte.
  2. Le lendemain, commencez par préparer 40 ml de milieu de croissance organoide contenant des suppléments et des facteurs de croissance en ajoutant des concentrations d'achat d'actions à 40 ml de 1x DMEM / F-12. Suppléments de milieux contiennent: mM d' acide 2- [4- (2-hydroxyéthyl) pipérazin-1-yl] éthanesulfonique 10 (HEPES) - 400 pl, 1 x supplément glutamine - 400 ul, 1x sans vitamine B27 A - 400 ul, 1 x N2 - 200 pi, 1 mM N-acétyl-cystéine - 40 pi, 100 ng / ml m-Noggin - 40 pi, 50 ng / ml m-EGF - 4 pi et placer dans un bain - marie à 37 o jusqu'à utilisation. Chauffer une partie aliquote de 15 ml de R-spondin1 à 37 ° C dans un bain d'eau.
  3. Chaud trois plaques 24 puits stériles à 37 ° C pendant au moins 30 min en plaçant dans un incubateur. Préparer 50 ml par acide souris 1x tampon phosphate salin (PBS) + 2 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et refroidir à 4 ° C. Préparer 100 ml par souris 1x PBS contenant 10% de FBS et refroidir à 4 ° C.

3. récolte Mus musculus Petit Intestinal Cryptes pour organoide Culture 1

  1. Sacrifiez un âge de la souris C57B6 / J mâles 6-12 semaines d'âge élevés sur nourriture standard pour rongeurs et de l'eau disponiblead libitum selon les directives institutionnelles. Euthanize par asphyxie au CO2 suivie d' une dislocation cervicale.
    NOTE: Gardez la carcasse sur la glace jusqu'à la récolte des tissus et effectuer la récolte des tissus dans une enceinte de sécurité biologique pour réduire au minimum le risque de contamination.
    Remarque: Une souris mâle ou femelle peut être utilisée pour générer des organites.
  2. (Facultatif) Rasez la souris pour enlever la fourrure avant immergeant dans 70% d'éthanol. Immerger la souris dans 70% d'éthanol pendant 2 min et épingler les membres à bord épinglant avec la face dorsale de la souris de toucher la carte.
  3. Utilisez pré-stérilisé disséquant ciseaux et des pinces pour faire une incision médiane sur la partie ventrale de la souris. Faire l'incision au niveau des organes génitaux procédant crânienne à la base du cou. Ouvrez l'incision de la peau latéralement avec des pincettes et épingler la peau à la carte épinglant pour exposer le péritoine.
  4. Faire une incision médiane dans le péritoine de l'abdomen avec dissection des ciseaux et pliez ee péritoine avec une pince latéralement et broches à la carte de brochage afin d'exposer les organes abdominaux.
    REMARQUE: Prenez soin de ne pas couper les organes abdominaux.
  5. Enlever l'intestin grêle, de la cavité abdominale avec des pinces et des ciseaux de dissection en coupant la jonction proximale de l'intestin grêle, relié à l'estomac et la jonction distale reliée au caecum. Placez le petit intestin dans une boîte de Pétri stérile contenant 10 ml de glace froide 1x PBS.
  6. Vider le contenu contenues dans la lumière de l'intestin grêle, avec le froid de la glace 1 x PBS en utilisant une pipette de 1 ml. Répéter cette étape jusqu'à ce que les débris dans la lumière de l'intestin grêle est enlevé.
  7. Couper le petit intestin avec dissection des ciseaux en 3-4 bandes de longueur à peu près égales et de jeter les bandes longitudinalement sur une nouvelle boîte de Pétri stérile. Pour chaque bande, insérez la pointe des ciseaux de dissection à l'intérieur de la lumière de l'intestin grêle, de faire une incision toute la longueur of la bande. Utilisez une pince à plier ouverte latéralement l'incision afin d'exposer la lumière de l'intestin grêle.
  8. Utiliser une lame de verre stérile pour gratter doucement les villosités sur la surface luminale de l'intestin grêle. Couper l'intestin grêle dans 1-2 cm bandes de longueur avec des ciseaux de dissection et de transférer ces bandes à un tube conique de 50 ml contenant 10 ml glacé 1x PBS.
  9. Mélanger doucement le contenu en retournant le tube conique de 50 ml et laisser le contenu de tissu de se déposer au fond du tube conique de 50 ml. Aspirer le PBS 1x et répétez cette opération trois fois par lavage du tissu avec 10 ml de glace froide 1x PBS. Sur le lavage final laisse le tube conique sur la glace pendant 10 min contenant 10 ml de PBS 1X et les petits segments de tissu de l'intestin grêle.
  10. Aspirer le PBS 1x et ajouter 25 ml de 1 x PBS + EDTA 2 mM. Placer sur une plate-forme à bascule à 4 ° C ou dans un seau à glace pendant 45 min. Alors que le tissu est en phase d'incubation, étiqueter six 15 ml tubes coniques "fraction # 1-6."
  11. Laisser le contenu du tissu de se déposer au fond du tube. Retirer et transférer le surnageant dans le tube de 15 ml conique marqué "fraction 1". Répétez le 1x PBS + 10% de FBS secouant étape (3.11) cinq fois et transférer le contenu surnageant pour le tube convenablement étiquetés-fraction.
  12. Centrifuger à 125 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et resuspendre pastilles dans 5 ml préchauffé 1x DMEM / F-12, sans facteur de croissance ajouté.
  13. Centrifuger à 78 xg pendant 2 min. Aspirer 4 ml du surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 1 ml de milieu restants.
  14. Retirer 20 ml de chaque fraction et ajouter à une lame de verre. Visualisez les cryptes et les débris sous un microscope optique et déterminer les fractions de combiner et mettre en commun en conséquence pour atteindre le plus grand percentage de cryptes ratio de débris.
    NOTE: Les fractions 2-6 donnent le plus grand pourcentage de cryptes à plaquer. Les fractions à la piscine sont le plus souvent la fraction 3 avec la fraction 4, et la fraction 5 avec la fraction 6.
  15. fractions Centrifugeuse à plaquer à 125 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant en laissant 50-100 ul restant au-dessus du culot.
  16. Garder les tubes sur la glace et ajouter 1 ml de matrice protéique aux fractions réunies. Pipeter vers le haut et vers le bas lentement pour empêcher l'addition de bulles d'air.
  17. Enlever les plaques 24 puits pré-chauffé de 37 ° C incubateur et on ajoute 50 pi de matrice protéique / suspension crypte au milieu de chaque puits. Transférer la plaque ensemencée dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 min pour permettre la chute de la matrice protéique se solidifier.
  18. Ajouter 450 ul de milieu de croissance organoïdes préparés précédemment + 50 pi de R-spondin1 milieu conditionné par puits. Incuber les plaques à 37 ° C + 5% de CO2 pendant une nuit.
  19. Ajouter 50-100 ul de R-spondin1 conditionné mediun par puits quotidien. Chaque 3 ème jour remplacer tous les médias de croissance organoide avec fraîchement préparé des milieux de croissance organoide 450 pl / puits décrit à l' étape 2.2. En outre ajouter 50-100 pi de R-spondin1 milieu conditionné par puits.
    REMARQUE: La chute de la matrice de protéine conserve son intégrité pendant une semaine, mais au bout de 7 jours pour procéder organites repiquage.

4. repiquage organites Chaque 7 ème Jour

  1. Décongeler la matrice protéique sur la glace pendant une nuit à 4 ° C le jour avant repiquage. Chaud une stérile plaque à 24 puits à 37 ° C pendant au moins 30 min. Préparer les milieux de croissance organoïdes décrites à l'étape 2.2 et maintenir à 37 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Retirer la plaque organoide de l'incubateur et de commencer repiquage de la plaque sur la glace. des milieux de croissance Aspirer avec une pipette de 10 ml de 3-4 puits pour commencer.
    NOTE: Gardez les médias aspiré dans la pipette de 10 ml, car cela va être utilisé pour déloger la chute de matrice protéique dans l'étape suivante.
  3. Comme dans lepuits pirates, pipette vers le haut et vers le bas afin de déloger la chute de matrice protéique de la plaque. raclage en douceur avec la pointe d'une pipette de 10 ml est utile dans délogeant la chute de matrice protéique. Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml.
  4. Incuber les tubes de 15 ml coniques sur la glace pendant 10 min et centrifuger à 125 g pendant 5 min à 4 ° C. Observer une pastille blanche au fond du tube conique. Aspirer et éliminer la majeure partie de la / ancien milieu de croissance organoïde surnageant au-dessus du culot organoïde laissant 100-200 pi au-dessus du culot.
  5. Briser les cryptes organoïdes en utilisant une aiguille de calibre 23 fixée à une seringue de 1 ml. Aspirer et éjecter 10-15 fois afin de dissocier les cryptes. Minimiser la formation de bulles d'air en raison de pipetage excessive.
  6. Resuspendre les organites dans 500 pi de matrice protéique et ajouter 50 ul par puits dans une nouvelle plaque bien préchauffé 24. Ajouter 450 ul de milieu de croissance organoïdes préparés précédemment + 50 pl de R-spondin1milieu conditionné par puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant une nuit.

5. Placage organites au jour 14 pour Pattern Recognition Receptor Stimulation avec PAMP et Listeria monocytogenes pour l' analyse de l' expression génétique

  1. Deux jours avant la provocation, série sur L. monocytogenes sur une plaque de gélose BHI.
  2. Le lendemain choisir un L. monocytogenes colonie et se développer dans 10 ml de bouillon BHI à 37 ° C pendant une nuit sous agitation à 200 tours par minute.
  3. Décongeler la matrice protéique sur la glace pendant une nuit à 4 ° C le jour avant la provocation organoide. Chaud une stérile plaque à 24 puits à 37 ° C pendant au moins 30 min. Préparer les milieux de croissance organoïdes décrites à l'étape 2.2 et maintenir à 37 ° C jusqu'à utilisation.
  4. Retirer la culture organoïde de l'incubateur et de commencer repiquage organites.
  5. Aspirer le milieu de 3-4 puits et garder les médias aspirée dans les 10 ml pipete que ce sera utilisé pour déloger la chute de matrice protéique. Pipeter etvers le bas afin de déloger la chute de la matrice de protéine à partir de la plaque. raclage en douceur avec la pointe d'une pipette de 10 ml est utile dans délogeant la chute de matrice protéique. Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml.
  6. Incuber les tubes coniques 15 ml sur de la glace pendant 10 min. Centrifuger à 125 g pendant 10 min à 4 ° C. Observer une pastille blanche au fond du tube conique. Aspirer doucement le surnageant en laissant environ 100 pi de surnageant résiduel derrière.
  7. Remettre en suspension le culot organoïde dans 5 ml de glace froide PBS 1x et retirer une partie aliquote de 10 pl pour le comptage. Ajouter la partie aliquote de 10 ul au milieu d'un hémocytomètre sans la lamelle de verre. superposer délicatement la lamelle de verre sur le dessus de la goutte.
    NOTE: Le hémocytomètre va se boucher avec organites si la lame de verre ne sont pas d'abord retiré.
  8. Comptez le nombre total de organites via un microscope optique dans chaque grille / l'ensemble de la chambre de l'hémocytomètre et déterminer la concentration organoide: numbre d'organites totaux compté par 10 pi.
  9. Retirer un volume approprié du tube conique de 15 ml qui permettra un nombre suffisant d'organites à être ensemencés pour le dosage et centrifuger cette suspension à 125 g pendant 10 min.
    NOTE: La plage comprise entre 40-100 organites par puits d'une plaque 24 puits est suffisante pour l'analyse de l'ARN. La taille organoïde typique peut varier de 300 pm à 1000 pm de diamètre.
  10. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ml de matrice protéique sans générer des bulles d'air. Ajouter 50 ml de organoide / protéine matrice suspension par puits dans une plaque à 24 puits.
    NOTE: La quantité de matrice de protéine utilisée pour resuspendre organites variera pour le nombre de conditions de traitement et répétitions techniques.
  11. Ajouter 500 ul de milieu de croissance organoïde (sans N-acétyl-cystéine) à chaque puits et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pendant 1 heure.
  12. Préparer des concentrations de PAMP 2x (c. -à- flagelline,lipopolysaccharide) et de vivre L. monocytogenes. Mesurer la DO en direct L. monocytogenes et le steak sur une plaque BHI pour le comptage. Traiter organites à 1 x 10 6 unités formant colonie (UFC) / ml.
    NOTE: La DO à la détermination CFU variera par des bactéries de type et doivent être évaluées avant organoide stimulation. Par exemple, une densité optique de 0,6 ≈ 1 x 10 9 UFC / ml pour L. monocytogenes, mais doivent également être évalués indépendamment avant l'expérience.
  13. Streak une dilution en série à partir du traitement des stocks L. monocytogenes , afin de déterminer avec précision le traitement UFC / ml. Les auteurs constatent que une dilution de 1 x 10 8 de 100 pi sur une plaque de gélose BHI est suffisante pour compter les colonies pour déterminer une précision UFC / ml.
  14. Préparer une solution de chaleur tué de L. monocytogenes , en prenant une aliquote de 1 ml du live L. monocytogenes solution et centrifuger à 5000 g pendant 10 min. Aspirer le surnageant et lavagele culot bactérien avec 1 ml de PBS 1x.
    1. Centrifuger le L. monocytogenes à 5000 xg pendant 10 min et resuspendre le culot dans 1 ml de PBS 1x. Chauffer tuer le L. monocytogenes dans un tube de 1,7 ml en polypropylene , par chauffage à 80-90 ° C pendant 1 h. Culture d' une aliquote de 100 pi de la chaleur a tué L. monocytogenes sur une plaque de gélose BHI pour confirmer aucune des bactéries vivantes restent.
    2. Ajouter 500 ul de la PAMP 2x appropriée et / ou le traitement d'un microbe à 500 ul support résidant dans les puits désignés déterminés par l'utilisateur. Incuber à 37 ° C + 5% de CO2 pendant 24 heures.
      REMARQUE: L'ajout d'une aliquote de 500 ul d'un traitement / microbe 2x PAMP 500 ul de milieu résident amener la concentration de traitement de 1x dans un volume total de 1 ml.
  15. Le jour suivant, compter manuellement L. monocytogenes colonies pour une détermination précise du traitement UFC / ml. Aspirer le milieu de la plaque d'organites traités et laver les puits ttemps de ROIS avec PBS 1x.
  16. Procéder à l' extraction de l' ARN par l' intermédiaire du phénol / chloroforme 11 ou d' un kit d'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant. Évaluer l' expression des gènes en utilisant la norme qRT-PCR 12.

6. Placage organites au jour 14 pour PAMP et L. monocytogenes Défi pour l'analyse des protéines dans le surnageant

  1. Deux jours avant la provocation, démarrer une culture cellulaire de cellules Caco-2, la densité de semis ≈1 x 10 6 cellules dans un flacon T-75 avec 1x DMEM + 20% de FBS et incuber les cellules Caco-2 à 37 ° C + 5 % de CO 2. Commencer une culture bactérienne de L. monocytogenes sur la plaque BHI et incuber la plaque dans un incubateur bactérienne à 37 ° C.
  2. Le lendemain choisir un L. monocytogenes colonie et croître dans 10 ml de bouillon BHI à 37 ° C pendant une nuit. Décongeler la matrice protéique sur la glace pendant une nuit à 4 ° C le jour avant la provocation organoide.
  3. Le lendemain au chaud un stérile de 96 puits à parois noiresla plaque à 37 ° C pendant au moins 30 min. Préparer des milieux de croissance organoide sans N-acétyl-cystéine décrite à l'étape 2.2 et maintenir à 37 ° C jusqu'à utilisation. Retirer la culture organoïde de l'incubateur et de commencer repiquage organites.
    NOTE: La taille organoide typique peut varier de 300 um à 1000 um de diamètre.
  4. Aspirer le milieu de 3-4 puits et garder les médias aspirée dans les 10 ml pipete que ce sera utilisé pour déloger la chute de matrice protéique. La remise en suspension avec une pipette afin de déloger la chute de la matrice de protéine à partir de la plaque. raclage doux avec une pipette de 10 ml est utile dans délogeant la chute de matrice protéique. Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml.
  5. Incuber les tubes coniques 15 ml sur de la glace pendant 10 min. Centrifuger à 125 g pendant 10 min à 4 ° C. Observer une pastille blanche au fond du tube conique. Aspirer doucement le surnageant en laissant 100 pi de surnageant résiduel derrière.
  6. Reprendre le culot organoide dans 5 ml de glace froide1x PBS et retirer une aliquote de 10 pi pour le comptage. Ajouter la partie aliquote de 10 ul au milieu d'un hémocytomètre et recouvrir doucement la lamelle de verre.
    NOTE: Le hémocytomètre va se boucher avec organites si la lame de verre ne sont pas d'abord retiré.
  7. Compter le nombre total d'organites au moyen d'un microscope optique dans chaque grille du hémocytomètre / de la chambre entière et déterminer la concentration organoïde: nombre total d'organites comptées par 10 ml.
  8. Retirer un volume approprié du tube conique de 15 ml qui permettra un nombre suffisant d'organites à être ensemencés pour le dosage et centrifuger cette suspension à 125 g pendant 10 min.
    NOTE: La quantité de matrice de protéine utilisée pour resuspendre organites variera pour la quantité de conditions de traitement et répétitions techniques. Les auteurs constatent que 40-100 organites est suffisante pour l'analyse de protéine sécrétée.
  9. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 500 ul de matrice protéique / puits sans générerdes bulles d'air.
    NOTE: La quantité de matrice de protéine utilisée pour resuspendre organites variera pour la quantité de conditions de traitement et répétitions techniques.
  10. Laissez au moins deux colonnes vide sur le puits noir à paroi plaque 96 de culture de tissu que ceux-ci serviront de puits ensemencés avec cellules Caco-2 pour la génération d'une courbe standard. Ajouter 50 ul de protéine matrice + suspension organoide par puits à une plaque de culture de tissus et noir à paroi préchauffé 96. Stocker la plaque à 37 ° C pendant 10 min pour permettre à matrice protéique se solidifier.
  11. Ajouter 100 ul de milieu de croissance organoïde (sans N-acétyl-cystéine) à chaque puits et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pendant 1 heure.
  12. Préparer des concentrations 2x de PAMP et de vivre L. monocytogenes. Ajouter 100 ml de chaque condition de traitement donné par puits et incuber pendant 24 heures.
  13. La plaque de jour suivant cellules Caco-2 dans les puits de la courbe standard. Commencer par chauffage stérile PBS 1x, 0,25% de trypsine et 1 x DMEM + 20% de FBS to 37 ° C.
  14. Retirer le flacon T-75 contenant des cellules Caco-2 et aspirer les milieux de culture cellulaire. Laver les cellules avec 10 ml 1x PBS. Aspirer le PBS 1x, ajouter 2 ml de 0,25% de trypsine et lieu flacon T-75 à 37 ° C incubateur pendant 15 min.
  15. Visualisez le flacon sous un microscope optique pour assurer que les cellules ont détaché puis ajouter 8 ml de 1x DMEM + 20% de FBS aux cellules Caco-2 individuelles et transférer dans un tube de 15 ml conique. Retirer une aliquote de 10 pi et compter les cellules par microscopie optique en utilisant un hémocytomètre.
    REMARQUE: Un numéro de cellule supérieure de 60.000 cellules / puits fonctionne bien et dilutions peut être effectuée pour la génération de la courbe standard jusqu'à 2500 cellules / puits.
  16. Resuspendre les cellules Caco-2 dans la matrice de protéines et ajouter 50 ul par puits dans les puits appropriés. Permettre à la matrice protéique se solidifier à 37 ° C pendant cellules Caco-2.
    NOTE: Les médias de croissance pour les cellules Caco-2 n'a pas besoin d'être ajoutés à la suite de la solidification de la matrice protéique.
  17. Suivantle temps de traitement de 24 heures pour le dosage organoide, aspirée et enregistrer les médias surnageant cellulaire organoïdes et de garder sur la glace. Laver les puits trois fois avec PBS 1x. Ajouter 100 pi de methanol à 100% à chaque puits, y compris les cellules Caco-2 puits de courbe standard et incuber à 4 ° C ou sur de la glace pendant 20-30 min pour fixer les organites.
    NOTE: Il est pas nécessaire que les cellules Caco-2 puits de courbes standards être lavés avec PBS 1x, car ils peuvent avoir le méthanol ajouté directement.
  18. Après l'incubation de méthanol, laver les puits trois fois avec de la glace froide 1x PBS. Conservez la plaque à 4 ° C pendant 1-2 semaines.
  19. Ajouter le colorant de coloration nucléaire à une concentration de 1 pg / ml par puits, couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
  20. Utilisez un puits lecteur 96 de plaque pour mesurer colorant coloration nucléaire excitation / émission (350nm / 461nm respectivement) et normaliser chaque organoide bien à la courbe standard de cellules Caco-2.
  21. Procéder à des essais en aval, tels que l'ELISA

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Representative Results

En suivant ce protocole pour cultiver organites intestinale, en forme de sphère organites caractéristiques seront présents après la récolte. L'addition de R-spondin1 milieu conditionné par jour va initier la croissance et le bourgeonnement des organites. La croissance des organites est représentée sur la figure 1A - F et est représentative de l' intestin organites les jours 1, 2, 4, 5, 6 et le jour 14. La figure 1E représente les caractéristiques des organites au jour 14 croissance non homogènes.

Une fois que les organites sont cultivées jusqu'à un nombre suffisant, ils peuvent être réensemencées et stimulés avec divers PAMP et / ou des microbes. Analyse de l'expression peut être réalisée par des techniques standard. Ceci est représenté sur la figure 2A-C qui représente l'expression de l' ARNm des cytokines inflammatoires IL-18, IL-6 et TNFa qui ont été analysés suite à un24 défi h d'organites avec chaleur tué L. monocytogenes et la flagelline PAMP. La raison pour laquelle l'évaluation de l'expression de l'ARNm des cytokines IL-18, IL-6 et TNFa est que ceux-ci étaient de bons candidats pour être modulée par les cellules epitheliales en réponse à une provocation pathogène et la modulation de ces cytokines inflammatoires démontrerait l'efficacité de la technique.

Figure 3A - C illustre la coloration nucléaire relative des organites intestinales avec un colorant de coloration nucléaire après fixation avec un fond de coloration minimale de débris dans la matrice de protéine résidente. Cette méthode de fixation et de coloration peut être appliquée pour normaliser les dosages, qui représenteront un nombre différent de cellules dans chaque puits. Cela apparaît à la figure 4 lors de la génération d' une courbe étalon de dilutions en série de cellules Caco-2 plaquées dans une matrice protéique, puis fixées et colorées avec du nucléairecolorant coloration. R 2 valeur de 0,89 indique une relation linéaire entre le nombre de cellules et l' intensité moyenne de fluorescence, et l'équation linéaire peut être utilisée pour normaliser organites au nombre de cellules. La courbe d' étalonnage représentée sur la figure 4 commence à atteindre la limite de saturation au - delà de 30.000 cellules par puits. Un titrage de cellules au- dessus de 30.000 cellules par puits a été représenté sur la figure 4 pour inclure la plage de saturation d' un colorant de coloration nucléaire. Une précision accrue de la normalisation sera obtenue avec un nombre de cellules qui reflète la gamme linéaire du colorant de coloration nucléaire avant la limite de saturation est atteinte.

Figure 1
Figure 1: Petit cours Intestinal organoide Croissance Temps de croissance pour l' intestin grêle organites murins dérivés suivants isolement.. (A) Jour 1. (B) Jour 2. (C) Jour 4. (D) Jour 5. (E) Jour 6. () Jour F 14. Les images sont représentatives de la croissance organoide pour chaque jour donné. Les barres d'échelle égale à 200 um dans l'image gauche A, barres B, C, D, et E. échelle égale à 100 um dans l'image à droite pour les barres A, B, C, D, et E. échelle égale 1000 um et 200 um pour les images gauche et droite pour F, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Expression de l' ARNm de cytokines inflammatoires Après 24 h PAMP Défi expression de l' ARNm relative de type sauvage organites intestinale contesté pendant 24 heures avec PAMP et chaleur tué Listeria monocytogenes (A - C) représentent un facteur de changement de l'i.. nflammatory des cytokines IL-18, IL-6 et TNFa, respectivement. Les barres d'erreur représentent Déviation standard (SD) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Coloration fluorescente relative des organites pour Normalization coloration nucléaire de organites avec après fixation.. (A) de champ lumineux de organites. (B) de coloration fluorescente des organites avec un colorant de coloration nucléaire. (C) d'image Fusionné de champ lumineux et coloration fluorescente. Les barres d'échelle égale à 400 pm dans toutes les images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"> Figure 4
Figure 4: courbe standard générée à partir de cellules Caco-2 Courbe étalon générée à partir de puits en trois exemplaires.. Cellule ensemencement avait une gamme à partir de 60.000 cellules par puits avec des dilutions en baisse de 2.500 cellules par puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Vue d' ensemble du diagramme Protocole 1 Panneau supérieur de la figure illustre la récolte de la R-spondin1 milieu conditionné. Panel 2-milieu de la figure illustre les aspects du protocole à la récolte et de la souris de la culture de petits organites intestinaux. Panel 3-Bas de la figure illustre: (A) Le placage de 14 jours organites de culture. (B) Défi avec PAMP / L.monocytogenes, et en laissant les puits inoccupées pour générer une courbe standard. (C) Après le défi PAMP, le placage des cellules Caco-2 dans les puits précédemment inoccupées pour générer une courbe standard. (D) Après la fixation et l' ajout d'un colorant de coloration nucléaire, la mesure de l'excitation / émission des puits et la normalisation contre une courbe standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La culture et l'entretien des organites intestinale est une procédure qui peut être maîtrisé par un individu avec la technique de culture de tissu adéquat. Il existe des nuances dans des passages par rapport aux cellules cultivées dans un monocouche plus classique, mais ces nuances ne sont pas difficiles à surmonter. Les étapes essentielles de cette méthode impliquent d'être en mesure de cultiver les organites à une densité suffisante pour l'ensemencement optimal. Les expériences doivent être revus à la baisse avec organites que de grandes densités de semis qui peuvent généralement être obtenus avec des lignées cellulaires ne sont pas pratiques. Cela devient particulièrement évident quand il y a plusieurs groupes de traitement.

Ce protocole est destiné à fournir une méthode étape par étape pour étudier les interactions hôte-pathogène de l'épithélium intestinal avec une variété de bactéries différentes, des pathogènes viraux et fongiques, ainsi que des difficultés d'adresse à l'aide de ce système en ce qui concerne la normalisation. Les rapports sont disponibles que describe les interactions des organites intestinales avec la bactérie pathogène Salmonella, mais ne traitent pas des méthodes de normalisation lors de la mesure des cytokines sécrétées 13.

Il y a plusieurs difficultés rencontrées lors de la normalisation des cultures organoïdes par des méthodes différentes. Normaliser protéine sécrétée par dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) est une option; Cependant, les éléments de croissance nécessaires à la culture organoïde (N2 et / ou de la vitamine B27) interfère avec le dosage BCA (données non montrées) normalisant par la viabilité cellulaire, par exemple un dosage MTT modifié a été décrit 14. cependant, un traitement qui modifie l'activité métabolique des mitochondries des organites introduira un procédé imprécis pour la normalisation par cette technique comme le MTT est basé sur la réduction par l'action des déshydrogénases mitochondriales 15. Il est également nécessaire d'éliminer la N-acétylcystéine (NAC) à partir du support, et non surly si la normalisation par la technique de MTT est souhaitée, mais si le traitement avec un agent pathogène bactérien comme NAC peut inhiber la croissance bactérienne 16.

Les avantages de cette technique sont que les cytokines sécrétées et les produits protéiques à partir organites peuvent maintenant être étalonnée par rapport à une courbe étalon de cellules Caco-2. Les limitations de cette technique sont que la normalisation est corrélative à cause de la coloration nucléaire organoïdes primaires épithéliales non transformées sont normalisées par rapport à la coloration nucléaire d'une lignée cellulaire de cancer du côlon. Les auteurs constatent que la fixation avec du méthanol et de coloration des noyaux avec nucléaires la coloration de colorant est une technique de normalisation efficace contre une courbe standard de cellules Caco-2. Bien que les caractéristiques de cette lignée de cellules de cancer du côlon de croissance ne exactement imitent pas les caractéristiques d'organites intestinales de croissance, en utilisant un colorant nucléaire et en mesurant l'intensité de fluorescence moyenne est une bonne stratégie pour normaliser par rapport au nombre total de cellules.

ELISA

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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